核桃分心木化学成分与生物活性研究_杨明珠

酸乙酯部位分离鉴定了 11 个化合物，分别为大黄素（ 1） 、齐墩果酸（ 2） 、Isosclerone（ 3） 、正十七烷（ 4） 、3-羟基-1-
（ 4-羟基取代苯基） -1-丙酮（ 5） 、硬脂酸甘油单酯（ 6） 、没食子酸（ 7） 、没食子酸乙酯（ 8） 、核桃素 D（ 9） 、对羟基苯
甲酸（ 10） 、香草酸（ 11） 。运用 DPPH（ 1，1-二苯基苦基苯肼） 法、纸片扩散法、肉汤稀释法对分心木粗提物及各相
核桃分心木 75% 乙醇粗提物（ A） ，经 D100 大 孔树脂柱梯度洗脱，得水部分浸膏（ B） 、50% 乙醇部 分浸膏（ C） 、95% 乙醇部分浸膏（ D） ； 50% 乙醇部分 浸膏再用水分散后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取， 得乙酸乙酯提取物 （ E） 、正丁醇提取物 （ F） 和萃取 剩下的水相 （ G） 。精确称量样品提取物 10 mg 左 右，溶解在 2 mL DMSO 中，之后用 DMSO 按 1 ∶ 3、1 ∶ 1、1∶ 1、1∶ 1 的比例稀释。以 DMSO、维生素 C 分别 作为对照，在 96 孔板上用 50 μL 供试品与 150 μL DPPH（ 400 mmol·L-1 ） 液混合，放入 37 ℃ 的恒温培 养箱中 30 分钟，之后用酶标仪于 515 nm 处测定 OD 值，最后计算出供试品的 IC50 数值。 1． 4 抗菌活性供试样品
准确称取供试样品 2． 0 g 溶于 20 mL 灭菌蒸馏 水中，超声溶解，吸取上清液，0． 45 μm 微孔滤膜过 滤 除 菌，备 用。 剩 下 的 不 溶 物 冷 冻 干 燥，扣 除 其 重 量，从而计算药物原液的浓度。 1． 5 纸片扩散法抗菌活性测试［7］
将厚度为 1． 5 mm 的优质定性滤纸用打孔机制 成直径为 6 mm 的小圆片，置于培养皿中灭菌，烘 干。然后放到药物原液中浸泡 2 h，待用。用接种环 挑取待测菌体置于少量生理盐水中，配制成 0． 5 麦 氏标准的菌悬液，待用。取 100 μL 菌悬液置于营养 琼脂板上，用灭菌棉签均匀涂开，将含药滤纸片分别
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贴于平板表面，37 ℃ 培养 18 h，根据药敏纸片周围 显出的抑菌圈大小来判断抗菌作用的强弱，通过此 法初步筛选敏感细菌谱。对照组为生理盐水。 1． 6 肉汤稀释法抗菌活性测试［7］
收稿日期： 2012-03-12
接受日期： 2012-05-14
基金项目： 云南省中青年学术技术带头人后备人才项目（ 2008PY005） ；
教育部留学回国人员科研启动基金［2009］1001
* 通讯作者 Tel： 86-872-2257316； E-mail： northjiang@ yahoo． com
分心木（ Diaphragma juglandis Fructus） 为胡桃科 植物胡桃（ Juglans regia L． ） 果核内的木质隔膜，又 名胡桃衣、胡桃夹、胡桃隔、核桃隔膜。中医认为，本 品性味 苦、涩、平，入 脾、肾 经，有 健 脾 固 肾、利 尿 清 热，治淋病尿血、暑热泻痢等功效，适用于治疗遗溺、 崩中下血、耳聋、治遗精、尿频、带下等。用核桃分心 木泡 水 喝，具 有 补 肾 涩 精 的 功 能，对 多 汗、尿 频、遗 尿、肾虚遗精、口腔溃疡、牙龈出血、小便多等也有功 效，且具有一定的抗菌活性［1］。
关样品的抗氧化与抗菌活性进行了初步研究。结果显示，分心木提取物及各相关样品普遍具有较好的抗氧化
与抗菌活性。分心木具有多种活性物质，具有一定的药用与开发价值。
关键词： 分心木； 化学成分； 抗氧化活性； 抗菌活性
中图分类号： R284. 2
文献标识码： A
Chemical Constituents and Bioactivity Studies of Diaphragma juglandis Fructus
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据文献报道，付文焕等曾从鞣质定性分析入手 研究建立分心木药材质量标准的方法［3-4］； 王艳梅、 毕肯·阿不得克里木等采用传统化学反应方法对分 心木的化学成分进行了定性分析，初步推断其中含 有氨基 酸、蛋 白 质、糖 类、酚 类、有 机 酸、黄 酮、生 物 碱、强心苷、挥发油、甾类、皂苷、蒽醌类、内酯、香豆 素、油脂等多种成分［5，6］； 然而，有关分心木中单体 化学成分分离、结构鉴定至今未见报道。本项目对 分心木 75% 乙醇提取物进行了系统的化学成分研 究，由乙酸乙酯部位分离鉴定了 11 个化合物，本文 报道这些化合物的结构鉴定及分心木提取物的抗氧 化、抗菌活性研究结果。
YANG Ming-zhu，TIAN Xin-yan，XIAO Chao-jiang，HAN Bing-yang，JIANG Bei*
College of Pharmacy，Dali University，Dali 671000，China
Abstract： Based on chromatographic separation and modern spectroscopy analysis techniques，eleven compounds were separated and purified from the ethyl acetate fraction of the 75% ethanol extract of Diaphragma juglandis Fructus． The structures of the eleven compounds were elucidated as emodin （ 1） ，oleanolic acid （ 2） ，isosclerone （ 3） ，heptadecane （ 4） ，3-hydroxy-1-（ 4-hydroxyphenyl） -1-propanone （ 5 ） ，glycerol-1-octadecanoate （ 6 ） ，gallic acid （ 7 ） ，ethyl gallate （ 8） ，juglanin D （ 9） ，p-hydroxybenzoic acid （ 10） and vanillic acid （ 11） ． The antibacterial activities of the fractions extracted from Diaphragma juglandis Fructus were evaluated by disk diffusion method and routine broth dilution method． In addition，the antioxidant activities of the crude ethanol extract of Diaphragma juglandis，as well as some sub-fractions of the crude extract，were tested by using DPPH （ 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ） method． As a result，most samples showed strong antibacterial and antioxidant activities． The antioxidant activity of ethyl acetate fraction was even stronger than the positive control，vitamin C． The study presented in this paper indicated that Diaphragma juglandis Fructus contains various bioactive constituents and possesses potential values for medical purposes and application developments． Key words： Diaphragma juglandis Fructus； chemical constituents； antioxidant activity； antibacterial activity
1 材料与方法
1． 1 仪器与材料 质谱由 VG Auto Spec-3000 质谱仪测定，电离条
件为 70 eV； 1 H 与13 C NMR 由 Bruker AM-400 核磁共 振波谱仪测定，四甲基硅烷（ TMS） 为内标。柱层析 硅胶材料、薄层层析板硅胶 G 和 GF254 均为青岛海洋 化工厂生产； 葡聚糖凝胶为 Sephadex LH-20 （ Amersham Biosciences，Sweden） ； 氯仿、石油醚、乙酸乙酯、 丙酮、乙醇均为工业纯试剂，正丁醇、氯化钠（ 天津 市风船化学试剂科技有限公司） 均为分析纯试剂； 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（ DPPH，Aldrich Chem Co， USA） ，营养琼脂（ 北京奥博星生物技术有限责任公 司） ，液体沙氏培养基（ 北京奥博星生物技术有限责 任公司） ，琼脂粉（ 天津市大茂化学试剂厂） ，0． 5 麦 氏比浊标准管，滤纸、接种环、微量加样器等。核桃 分心木（ Diaphragma juglandis Fructus） 采于云南省大 理州漾濞县，由大理学院药学院生药学教研室周浓 副教授鉴定。标本（ DLYX-JIANG-2009-10-01） 存放 于大理学院药学院姜北教授研究组。菌种： 所有菌 种均由大理学院基础医学院微生物与免疫实验室提
胡桃为云南省的重要支柱型经济林木之一，其 中大理地区为优质核桃品种漾濞泡核桃（ Juglans sigillata Dode） 的主产区，2009 年产量达到 12． 33 万 吨［2］，副产品分心木 6 千吨以上，全省分心木资源蕴 藏量更是十分巨大。虽然近年来国内关于胡桃研究 已相当广泛，研究范围包括核桃仁、核桃壳、核桃青 皮、枝叶、树皮、根皮等，发现了许多抗肿瘤、抗氧化 活性成分，但对分心木的化学成分与药理活性研究 报道却十分有限，致使分心木（ 与核桃壳一道） 除用 于烧制活性炭或作燃料外，基本上无任何其它方面 的应用，极大限制了该资源的价值与用途。因此，如 能对云南丰富的分心木资源进行研究利用，变废为 宝，无疑可为当地的社会经济发展做出重大贡献。
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2012，24： 1707-1711，1728
文章编号： 1001-6880（ 2012） 12-1707-06
核桃分心木化学成分与生物活性研究
杨明珠，田新雁，肖朝江，韩冰洋，姜 北*
大理学院药学院，大理 671000
摘 要： 利用色谱分离方法与现代波谱分析技术，对核桃分心木的化学成分进行了系统的研究。由其醇提物乙
供，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、铜绿 假单胞菌、痢疾杆菌、H901 伤寒杆菌、白色念珠菌。 1． 2 提取与分离
核桃分心木 10． 0 kg，粉碎后用 75% 乙醇冷浸 提取，浓缩后得到浸膏 1． 1 kg，用水分散后，依次用 乙酸乙酯、正丁醇萃取，得相应提取物。取 200 g 乙 酸乙酯萃取浸膏，进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-丙 酮（ 1∶ 0-0∶ 1） 梯度洗脱，得 Fr1 ～ Fr7 七个部分。Fr2 经硅胶柱层析石油醚-乙酸乙酯洗脱后得化合物 1、 2 和 4，相应部位再经 Sephadex LH-20 纯化后得 3， 经 RP-18 反相层析得 6。Fr3 经硅胶柱层析，氯仿丙酮、石油醚-丙酮洗脱后，再经 Sephadex LH-20 纯 化得 10； 相应部位经 RP-18 反相层析得 5； 用石油 醚-丙酮系 统 硅 胶 柱 层 析 粗 分，再 经 Sephadex LH20、石油醚-乙酸乙酯硅胶柱层析、重结晶后得 9； 经 氯仿-甲醇系统硅胶柱层析得 8 和 11。Fr4 经硅胶 柱层析氯仿-丙酮、石油醚-丙酮洗脱，再用 Sephadex LH-20 纯化，经重结晶得 7。 1． 3 抗氧化活性测试