成骨细胞培养
新生大鼠成骨细胞体外培养经验总结
新生大鼠成骨细胞体外培养经验总结摘要] 目的：体外培养成骨细胞技术不仅仅在研究其生物学特征及功能方面有重要作用, 而且在研究代谢性骨疾病和重建骨组织方面异常重要。
高效便捷的体外培养方法，是开展体外实验研究的基础。
方法：采用0.25%胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶联合的二次酶消化法对新生SD大鼠成骨细胞进行原代提取、培养、传代。
通过观察成骨细胞的形态、碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红矿化结节染色法鉴定，确定其细胞活性及增殖情况。
结果：原代成骨细胞多呈混杂细胞，经过3次传代可获取较纯细胞。
成骨细胞呈三角形、梭形、多边形，胞体向外伸展，胞浆丰富，胞核呈卵圆形见，碱性磷酸酶和钙结节染色阳性。
结论：通过体外培养成骨细胞，可获取符合体外细胞生物学对细胞的要求。
为成骨细胞生物学特征及功能、代谢性骨疾病和重建骨组织方面等研究提供基础。
关键词：成骨细胞、细胞培养、碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红矿化结节染色法 Summary of the experience of osteoblasts culture in vitro in neonatal rats Wangzhen1, Yin Hong2▲, Qiang Weiqing2▲,Yao Nianwei2,Liu Yi Xin1,Xu Lei1, He Qiang 1(1.Nanjin g University of Chinese Medicine；2.Nanjing Hospital of TraditionalChinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine) [Abstract] Objective: In vitro culture of osteoblasts plays an important role not only in the studyof biological characteristics and functions, but also in the study of metabolic bone diseases and reconstruction of bone tissue. Efficient and convenient in vitro culture method is the basis of in vitro experimental research.Methods: Primary extraction, culture and subculture of osteoblasts from neonatal SD rats were carried out by secondary enzyme digestion with 0.25% trypsin and type II collagenase. By observing the morphology of osteoblasts, alkaline phosphatase (ALP) staining and alizarin red mineralized nodule staining, the cell activity and proliferation were determined.Results: Most of the primary osteoblasts were hybrid cells, and the more pure cells could be obtained after 3 passages. Osteoblasts were triangular, fusiform and polygonal in shape. The body of osteoblasts extended outwards. The cytoplasm of osteoblasts was abundant. The nucleus of osteoblasts was oval. Alkaline phosphatase and calcium nodule were positive.Conclusion: Osteoblasts cultured in vitro can meet the requirements of cell biology in vitro. It provides the basis for the study of osteoblast biological characteristics and functions, metabolic bone diseases and reconstruction of bone tissue. Key words: osteoblasts, cell culture, ALP staining, alizarin red mineralized nodule staining 成骨细胞是重塑单位的骨形成细胞，对于骨骼的生长和维持至关重要[1]。
人成骨细胞原代培养
人成骨细胞原代培养1.人成骨细胞的分离和培养：在无菌条件下取自体骨移植患者少量的松质骨，装入无菌HANK’S液中，迅速运送至实验室，充分剥离骨膜及软组织，把将骨块置于盛有DMEM培养液的培养皿中修整为1mm×1mm×1mm大小的碎块，将松质骨块置入含有2∼3mlPBS的EP管中，用力摇动数次，然后静止30秒，令骨块沉下，小心倒掉含有造血组织和细胞的上清液，无菌PBS冲洗3次。
在松质骨块粒内加入红细胞裂解液(碳酸氢钠840mg、乙二胺四乙酸37.2mg、氯化铵8.023g、双蒸水1000mL，pH为7.2)，体积比为1∶2，裂解8min，离心去上液，至骨片发白放入离心管内。
2.酶消化法：加入10倍的2.5g/L胰蛋白酶，在37℃恒温箱振荡预消化20min，胎牛血清终止消化，弃去消化液，PBS清洗两遍。
再加入体积比为1∶8的0.1%的Ⅰ型胶原酶密封置于37℃水浴箱内振荡消化1h，1000r/min离心5min，弃上清，沉淀用PBS洗涤后再1000r/min离心5min，沉淀用DMEM-F12完全培养液重新悬浮反复吹打均匀，将细胞悬液通过200目不锈钢筛网，去除可能存在的非成骨细胞和杂质成分，保留骨粒。
剩余骨粒重复Ⅰ型胶原酶消化，共3次。
然后将3次消化所得的细胞悬液用血球计数板计数，制成5×107L-1的细胞浓度(台盘蓝染色显示存活的细胞不少于95%)，接种于无菌培养皿中，在体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37℃条件下培养。
48h后换液，弃去悬浮细胞，每隔2d换液1次，细胞接近融合时传代。
3.组织块法：将消化过的骨块，先用血清润湿，然后用吸管均匀接种至25 cm2的培养瓶中，翻转培养瓶，小心加入5 mL DMEM-F12完全培养液后，放入体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37 ℃条件下培养4 h后小心翻瓶。
每周换液1次，第3周起每周换液2次，细胞接近融合时按1∶ 2传代。
成骨细胞培养
成骨诱导液：地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C，OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphatePG(磷酸甘油)和Vc配好放四度，Vc尽量分装保存，减少与空气接触，三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。
用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min 离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。
所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。
于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。
48 h后换液，以后隔日换液1次。
成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。
将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。
成骨细胞鉴定：活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。
Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。
待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。
碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
成骨细胞与破骨细胞的共培养体系
成骨细胞与破骨细胞的共培养体系
1 建立成骨细胞与破骨细胞共培养体系
成骨细胞和破骨细胞是骨再生的重要细胞，在成骨和破骨之间存
在矛盾性相互作用，为解决该矛盾性作用，建立成骨细胞与破骨细胞
共培养体系是有必要的。
1.1 获取细胞
获取成骨细胞和破骨细胞是共培养体系的第一步。
一般的获取方
式有从动物原位骨组织采集、从动物移植位骨组织采集以及从动物分
化出的骨细胞培养采集等；此外，还可以利用旁路移植操作获得成骨
和破骨细胞，以及通过多剂量胶原纤维骨再生制备法获取到成骨细胞，以及经过分离纯化的单个样品。
1.2 制备培养基
共培养体系建立的必要组成部分之一是，必须将对成骨细胞和破
骨细胞培养基进行优化；即构建一个基于实验的的多层联合的培养体系。
1.3 实现活细胞共培养
实现活细胞共培养仅用AMP法是不能取得理想效果的，而且很容
易造成细胞成骨破骨细胞凋亡和发生假复合，因此需要考虑利用有特
殊支架结构的凝胶体，或者应用其他生物材料来实现活细胞共培养。
1.4 动物实验
为了在实际应用中证实共培养体系的可行性，需要在动物实验上进行实验验证，有助于进一步用于临床应用，以达到促进骨再生的目的。
建立成骨细胞与破骨细胞的共培养体系具有重要的理论指导意义和临床应用价值，从而实现骨量的增加与骨质的维持，这不仅将有助于改善骨健康，而且有助于促进骨骼可塑性，有助于改善患者的生活质量，也是进一步改善骨病患者的治疗方法。
成骨培养基配方
成骨培养基配方
成骨培养基是一种特殊的细胞培养基，它可以用于培养和研究骨细胞、软骨细胞和成骨细胞。
成骨培养基的配方是关键之一，下面介绍一种经典的成骨培养基配方。
1. DMEM/F12培养基：DMEM和F12培养基的混合物能够提供足够的营养物质和生长因子，支持细胞的存活和生长。
2. FBS：胎牛血清(FBS)是细胞培养中最广泛使用的血清，提供多种生长因子和营养物质，促进细胞的增殖和分化。
3. 抗生素和抗真菌剂：如青霉素和链霉素，保持培养物的纯度和无菌状态。
4. 抗氧化剂：细胞长期培养会产生氧化应激，影响细胞的生长和功能，加入抗氧化剂如谷胱甘肽(GSH)和丙酮酸可以减少氧化应激的影响。
5. 骨形态发生蛋白-2(BMP-2)：BMP-2是一种重要的成骨分化因子，能够促进干细胞向成骨细胞的转化，加入BMP-2能够促进细胞的成骨分化。
6. 维生素C：维生素C是一种重要的抗氧化剂，能够抑制细胞凋亡和促进胶原合成，加入适量的维生素C可以促进细胞的生长和分化。
以上是一种经典的成骨培养基配方，但随着科学技术的发展和研究的深入，配方也在不断改进和完善。
未来的成骨培养基会更加精细化，能够更好地模拟人体环境，促进细胞的生长和分化。
成骨细胞培养问题
鄙人做成骨细胞培养检测相关指标，走了许多弯路，今将自己的总结的经验贴出，望后续战友做成骨细胞培养时少走弯路，加快实验进程，不要把过多的时间耗费在培养上！1.成骨细胞的取材：选取新生SD大鼠的乳鼠（有参考书上新生24h的，鄙人试过72h的乳鼠，消化下来的成骨细胞活力也是很不错的），具体取材方法不详述。
2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中（PBS不要放太多，否则延长剪碎时间），用剪刀剪成1*1mm的组织快，越小越好（越小越能消化完全），一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml，37℃水浴中消化30min（目的是消化掉附着骨片上的结缔组织），离心去酶，加入2ml胶原酶2，水浴中继续消化1h（中间间隔晃动，使消化下来的胶原离开团块溶于液体中）。
如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以加适量的PBS，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。
离心后去掉上清液，用PBS悬浮细胞，如果发现还有很多的骨片，将骨片单独取出继续用胶原酶2做第二次消化，第一次胶原酶2消化的细胞悬液和第二次胶原酶2消化的细胞悬液混匀（如果担心胶原酶2会影响细胞的生长，可以将两次的悬液离心，去掉上清液后，用培养基重悬）3.培养基问题：当时选取培养基问题确实弄苦了自己，因为师兄他们的论文说使用的是高糖DMEM，所以也用这个，但是消化下来的细胞很难成活，后来改成同实验室做神经细胞培养使用的DMEM/F12培养基，消化下来的细胞完全可以成活下来。
但是问题接踵而至，到了第五天时发现细胞铺满底壁的60%，此时只要一换液，第二天绝对培养基混浊，没有一瓶细胞活过7天的（比如今的公司倒闭的都快），怀疑是污染问题（因为正值夏季雨天），折腾到最后绝对保证所有的添加物都是过滤后才使用，死亡现象依然在上演。
后来联系到丁香园的一个战友，他那里用的是低糖的DMEM培养基，没有出现我的问题，建议我换用这个！我购买了一包GIBCO牌子的低糖DMEM培养基，使用后细胞生长良好，繁殖旺盛！没有出现死亡漂浮现象！个人认为成骨细胞本来就是在血液循环不好的情况下生长的（相比神经细胞，肾细胞等），高糖无疑刺激了成骨细胞分泌胶原（类似既得生孩子还要挤过多的奶水不累死才怪），另过多的胶原很难在玻璃上贴牢靠，一换液就会漂浮，将细胞从底壁带下来。
原代细胞分离培养鉴定1(SD 大鼠颅骨成骨细胞、兔关节软骨细胞)
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠颅骨成骨细胞、兔关节软骨细胞）目录 1 原代分离——SD 大鼠颅骨成骨细胞的分离2 原代分离——兔关节软骨细胞的分离1、SD 大鼠颅骨成骨细胞的分离目的与意义体外培养成骨细胞是研究骨代谢和成骨机制的重要手段，成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。
随着组织工程学的发展，成骨细胞的体外培养已成为骨组织工程体外构建研究的基础。
此外，培养的成骨细胞多取材于动物的骨和骨膜组织。
颅骨人体中：头骨（又名颅骨）：按颅骨所在的部位，B 颅骨分为脑颅和面颅两部分，通常以经过眶上缘和外耳门上缘的连线为分界线。
大鼠：头骨包括颅骨和面骨，颅骨包括：枕骨1块，顶间骨1块，顶骨2块，额骨2块，颞骨2块，基蝶骨1块，前蝶骨1块，筛骨1块。
AC6 成骨细胞 成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。
成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。
成骨细胞增殖期时其数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌Ⅰ型胶原以便最终可以矿化形成骨结节。
骨切片HE 染色 成骨细胞短柱状,有突起,核圆形,细胞质强嗜碱性，在将要形成骨组织的地方，排列成单层，彼此由突起相连 D E F分离方法文献方法注意事项1、选择出生24 h内大鼠乳鼠取颅骨, 否则骨组织难以消化；2、取颅骨时应注意剔除骨膜、骨缝中结缔组织及颅顶透明软骨结节, 以减少杂质细胞的污染；3、首次消化液弃去以减少首先消化下来的成纤维细胞、破骨细胞、骨祖细胞等的污染；4、注意消化传代时机, 最好待细胞生长至单层融合时即传代。
传代过早, 细胞数目稀少, 不易生长;传代过晚, 细胞提前分化、衰老, 分泌骨基质；5、传代后可采用差速贴壁法进一步纯化成骨细胞, 因为混杂的成纤维细胞先贴壁, 所以传代后静置 30min, 此时成纤维细胞已经贴壁, 然后轻摇培养瓶, 将仍未贴壁的成骨细胞接种至另一培养瓶；6、适度的消化；7、原代培养容易污染, 应严格无菌操作；参考：刘长剑, 刘建国, 于铁成, et al. Ⅰ型胶原酶阶段消化法体外培养、纯化及鉴定大鼠成骨细胞[J]. 中国老年学杂志(06):525-527.断头︐取颅骨︵顶骨︶1234 5剥除骨膜，去软骨6 7 剪切，初次消化8 9 二次与后期消化100倍 形态多样，呈三角形、梭形、多角形等不规则形，细胞伸展，有长短不一的突起，呈复层生长。
成骨诱导培养基配方
成骨诱导培养基配方成骨诱导培养基配方引言成骨诱导培养基是一种能够促进细胞分化为成骨细胞的培养基。
在组织工程、再生医学等领域中有着广泛的应用。
本文将详细介绍成骨诱导培养基的配方及其作用。
一、成骨诱导培养基的作用1.促进成骨细胞分化：成骨诱导培养基中含有多种生长因子和激素，能够刺激干细胞或前体细胞向成骨细胞分化。
2.增加成骨细胞数量：成骨诱导培养基中含有足够的营养物质和生长因子，可以促进成骨细胞增殖。
3.提高成骨组织工程的成功率：使用成骨诱导培养基可以获得更多、更健康的成骨组织，从而提高组织工程修复效果。
二、常见的成骨诱导培养基配方1.α-MEM（Minimum Essential Medium, alpha modification）：是常用的无血清培养基之一，含有多种必需氨基酸和维生素，适合于培养多种哺乳动物细胞。
2.β-Glycerophosphate：是一种有机磷化合物，可以促进成骨细胞分化和矿化。
3.维生素C：是一种重要的抗氧化剂，能够促进成骨细胞的增殖和分化。
4.地塞米松（Dexamethasone）：是一种合成的类固醇激素，能够促进成骨细胞分化和骨基质沉积。
5.人源性成骨蛋白-2（rhBMP-2）：是一种人源性生长因子，能够刺激干细胞或前体细胞向成骨细胞分化。
6.牛血清蛋白（Fetal Bovine Serum, FBS）：是一种常用的培养基添加剂，含有多种生长因子和营养物质，可以促进细胞增殖和分化。
三、配方及用量1.α-MEM培养基：500ml2.β-Glycerophosphate：10mM3.维生素C：50μg/ml4.地塞米松：10nM5.rhBMP-2：100ng/ml6.FBS：10%四、注意事项1.成骨诱导培养基中含有多种生长因子和激素，使用时应注意安全。
2.配方中的各种成分应按照比例加入，避免出现浓度过高或过低的情况。
3.培养基的pH值应保持在7.2-7.4之间，否则会影响细胞的生长和分化。
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成骨诱导液：地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C，
OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphate
PG(磷酸甘油)和Vc配好放四度，
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成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过
程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。
将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。
成骨细胞鉴定：
活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。
Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。
待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。
碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，
按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。
阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。
• 茜素红染液
操作 1. 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用
1×PBS冲洗 1-2次。
每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。
2.吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。
每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min。
3.吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2-3次。
4. 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。
用4周龄大鼠，用全骨髓贴壁法取得原代细胞，消化传代，用第3代培养至80-90%融合后，胰酶消化，接种在事先明胶包被的六孔板中，当细胞生长达接近80-90%时，使用cyagen的成骨诱导培养液诱导，每2-3天换液，诱导28天后，吸去六孔板中培养基，用PBS冲洗，加入4%中性甲醛固定30min，再次用PBS冲洗，加入茜素红染4min，PBS冲洗后观察。
骨科手术中获得成
人松质骨，经PBS 或者D-Hanks 液冲洗数次后剪成1 ～3 mm3 左
℃人骨髓梯度离心法提取成骨细胞和破骨细胞。