PCR-SSP ABO基因分型实验操作规程
PCR-SSCP实验操作详细步骤
PCR-SSCP 实验步骤一．样品制备1．PCR 扩增并检测。
根据不同的引物挑选适合的退火温度进行 PCR 扩增。
扩增产物用 2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量 3-5ul。
PCR 产物为 10ng/nl 左右为最佳。
2．PCR 产物与变性 buffer 混合。
在干净的 PCR 管底部加入 5ul SSCP 上样缓冲液（变性缓冲液，同《分子克隆》中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入 PCR 扩增产物。
按照经验，扩增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加 1ul，效果很好加 0.5ul，如果不太好就适当增加1.5、2 或 3 不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加 3ul 的 PCR 产物，缓冲液加到 8ul 变性效果更好。
3．PCR 产物变性。
加好的样品进行离心，使样品集中在管底。
PCR 仪上 95℃变性 10 分钟，立即取出 PCR 产物连同架子一同置于冰上静置 5min，以免变性的产物复性。
注：3 和 4 步可以在制 SSCP 胶第四步后，等胶凝的过程中进行。
二．制胶1．装板。
在所要进行实验的每一副玻璃板先用自来水冲洗，然后使用 ddH2O 冲洗，然后使用吸水纸将玻璃板擦拭干，然后再玻璃板上涂抹无水酒精，待 2-3min 酒精挥发。
将玻璃板组装好放入凝胶架子中，两边及底部固定好，两玻璃板保持水平，然后将发条拧紧。
（可用无水乙醇测试是否漏胶）。
2． 配胶。
甘油浓度 50%的几种浓度大板胶（10ml 下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）：8%6%30%PAGE 2.7ml1ml10×TBE1ml0.5ml50%甘油1ml0.5mlddH2O5ml3mlAPS70ul70ulTEMED12ul8ulTotal10ml5ml甘油浓度 50%的几种浓度小板胶（15ml 下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.5mm）8%6%4.05ml 2 ml30%PAGE（4℃）10×TBE 1.5ml1m50%甘油 1.5m1mddH2O7.5ml6mlAPS105ul70 ulTEMED12ul12ulTotal15ml10ml3．灌胶。
pcr 操作流程
pcr 操作流程PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于复制DNA片段的技术，它可以在短时间内扩增出数百万份特定DNA序列。
PCR技术在分子生物学、医学诊断、法医学等领域有着广泛的应用。
下面将介绍PCR的操作流程。
首先，准备PCR反应体系。
PCR反应需要的基本组成包括DNA模板、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、DNA聚合酶、缓冲液和水。
引物是PCR反应的关键，它们是用来识别目标DNA序列并引导DNA聚合酶合成新链的短链DNA片段。
其次，进行PCR反应。
PCR反应通常分为三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将PCR管中的混合物加热至95°C，使DNA双链解旋成两条单链。
在退火步骤中，将反应温度降至50-60°C，引物与目标DNA序列结合。
在延伸步骤中，将反应温度升至72°C，DNA聚合酶在引物的引导下合成新链。
最后，进行PCR产物的分析。
PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可以用来检测PCR产物的大小和纯度，实时荧光定量PCR可以用来定量PCR产物的数量。
在PCR反应中，需要注意一些常见的问题，如引物的设计、反应条件的优化、污染的防止等。
此外，PCR反应的结果也需要谨慎解读，避免误判。
总的来说，PCR技术是一种简单、快速、高效的DNA复制技术，广泛应用于科研和临床实验中。
熟练掌握PCR的操作流程和技巧，可以提高实验效率和准确性，为科研工作提供有力支持。
PCR-SSCP实验原理和操作步骤
PCR-SSCP实验原理和操作步骤(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism)【实验目的】1．了解PCR-SSCP技术的原理。
2．了解并熟悉PCR-SSCP技术的步骤。
【实验原理】PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。
它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。
PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。
PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。
其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。
因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。
为了便于观察分析结果，PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物，电泳后放射自显影观察泳动带的位置。
目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带，此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤，但其灵敏度不如用同位素标记。
单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关，但也受到其他条件的影响。
因此，PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件，如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。
PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性，一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。
【实验用品】1．PCR扩增仪；聚丙烯酰胺凝胶电泳装置；电泳仪；电泳槽。
2．6%非变性聚丙烯酰胺凝胶（49：1）、1´TBE、10%过硫酸铵、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液、琼脂糖3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip头（200μl，20μl）。
PCR-SSP方法用于ABO疑难血型检定
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Super007-004.1 人类ABO血型A亚型基因分型检测试剂盒(PCR-SSP法)说明书
Tianjin Super Biotechnology Developing Co., Ltd人类ABO血型－A亚型基因分型检测试剂盒（PCR-SSP）包装规格：4/8/20人份产品代码：SUPER007-004-004SUPER007-004-008SUPER007-004-020★仅供研究，不用于临床诊断【产品名称】通用名称：人类ABO血型－A亚型基因分型检测试剂盒(PCR-SSP)英文名称：Human ABO Bloodtype－A subgroup genotyping kit【包装规格】包装规格：4 / 8 /20人份【预期用途和简介】已知ABO血型系统中A亚型包括，A1、A2A3、Aw、Ax、Am & Ael等。
A1亚型具有A1抗原、A抗原和H抗原，血清中含有抗B抗体；A2亚型则只有A抗原和H抗原，其血清中除含抗B抗体，还有少量抗A1抗体，在血清学实验中约25%能与A1红细胞发生的凝集反应。
本试剂盒检样可为外周血、羊水、骨髓、组织、皮肤、血痕等提取的DNA，具有分型准确、快速、DNA需求少、针对中国人群设计优于同类进口试剂盒等优点。
可用于个体识别，疑难配血，新生儿溶血病的产前和产后诊断、骨髓干细胞移植（血型转换期间）和器官移植，以及肿瘤或病毒感染后血型一过性改变的基因识别。
【试剂盒原理】根据Genebank公布的基因序列，通过针对A亚型基因不同碱基的替换或缺失设计特异性引物，设计该特异性碱基为正义链引物的3′末端，由于Taq酶缺乏3′-5′外切酶活性，与引物3′末端不相配的等位基因模板不能进行扩增，而与引物3′末端相配的等位基因顺利扩增；其中每孔已经包含有内参质控品为人类生长激素（HGH）的保守片段设计，内参扩增产物作为有效试验在电泳中显现。
可识别A亚型基因包括：A2、A3、Aw、Ax、AM、Ael & O。
【主要组成成分】1.试剂盒组成B.浓缩dNTPs-Buffer：包括200mM dNTPs 、3.5mM Mg2+、500 mM KCl，100 mM Tris-HCl，1% Triton X-100等，使用前用无菌去离子水稀释。
PCR-SSP法检测胎儿、新生儿ABO血型
黄疸是新生儿尤其是早产儿的常见症状，可以由各种原 因引起，其中包括母儿血型不合导致的溶血。在临床工作中 准确的鉴定 新 生 儿 血 型 以 确 定 黄 疸 原 因 及 恰 当 治 疗 十 分 必 要。为此，我们用PCR-SSP法检测胎儿、新生儿 ABO 血型，对 ABO 血型检测方法进行了研究。
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404
西 安 交 通 大 学 学 报（ 医 学 版 ）
第24卷
P12、P13是一对对照引物。 由以上引物组成8个独立的反应体系：
1.P1+P3+P12+P13 2.P2+P3+P12+P13
3.P4+P6+P12+P13 4.P5+P6+P12+P13
5.P7+P6+P12+P13 6.P8+P6+P12+P13
-
A2A2
A
-
+
-
+
A1A1
pcr-sscp检测
实验七PCR-SSCP检测一、实验目的1．了解PCR-SSCP技术的原理。
2．了解并熟悉PCR-SSCP技术的步骤。
二、实验原理SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism)：单链构象多态性检测，是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。
它是一种简单、快速、经济的基于DNA构象差别来检测点突变的方法。
相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。
单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。
空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。
因此，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。
该方法简便、快速、灵敏，但它也有不足之处。
例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。
三、实验用品1．聚丙烯酰胺凝胶电泳装置，电泳仪，电泳槽。
2．8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29：1）、1*TBE、5*TBE、10%过硫酸铵、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液。
四、实验步骤1．PCR产物经琼脂糖电泳确认特异性好的PCR产物才能用于PCR-SSCP检测，无条带或出现非特异性条带的产物都不能用于PCR-SSCP检测。
2．聚丙烯酰胺凝胶电泳2.1 装板在所要进行实验的每一副玻璃板（事先洗静、风干）的两边及底部装上垫片，尽量使底边及侧边紧密接触，夹子固定好，确保接头处都封上，以免漏胶。
pcr实验基本流程
pcr实验基本流程
一。
PCR 实验准备工作那可是相当重要。
1.1 首先得把实验材料备齐喽，像引物、模板 DNA、dNTPs、Taq 聚合酶，还有各种缓冲液，缺了啥都不行，这叫“兵马未动，粮草先行”。
1.2 仪器设备也得准备妥当，PCR 仪得性能良好，离心机、移液器都得调试好，不然关键时刻掉链子，那可就麻烦大了。
二。
实验操作得一丝不苟。
2.1 先把反应体系配好，各种成分的量都得严格按照要求来，多了少了都可能影响结果，这就好比做饭，盐多了太咸，盐少了没味。
2.2 加样的时候得小心谨慎，千万别把样品弄混了，一旦出错，那就是“一失足成千古恨”。
2.3 把样品放进 PCR 仪，设置好反应程序，温度、时间都得精准，这就像开车掌握好油门和刹车，才能稳稳当当到达目的地。
三。
实验结束后的工作也不能马虎。
3.1 反应结束后，要对产物进行检测，琼脂糖凝胶电泳就是常用的方法，通过电泳图谱能看出实验结果好不好。
3.2 对实验结果进行分析和判断，看看是不是达到了预期的目标，如果不理想，就得找找原因，是操作失误还是实验设计有问题，“吃一堑，长一智”，下次可不能再犯同样的错误。
PCR 实验就像一场精心策划的战斗，每个环节都要考虑周全，操作精准，才能取得胜利，得到满意的结果。
PCR-SSCP实验步骤(仅供参考)
PCR-SSCP实验步骤（仅供参考）1、PCR（例：15uL体系，n个样）A、取n个PCR管，做好标号。
B、配混合液（1.5mL离心管中）mix （n+1）×7.5uLDNApol （n+1）×0.15 uL引物（上）（n+1）×0.2 uL引物（下）（n+1）×0.2 uL无菌水（n+1）×5.95 uLC、分装：14uL/PCR管。
（注意枪头最好插到PCR管底部，打出混合液，待枪头离开PCR管再松手）D、加模板：1uL。
（注意加模板前一定要将模板DNA轻微振荡混匀，且枪头最好插到PCR管液面下打出模板，打出后待枪头离开液面后再松手）E、瞬时离心。
（长按short spin键，待转速升到10000r/min即可松手，使其自然停转）F、PCR仪中扩增。
G、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
（注意结果好时才可做SSCP）２、SSCP(1)制胶与电泳（此步要尽量统筹好时间）A、洗玻板、梳子，烘干，润湿胶条。
(注意玻板尽量洗净，千万不能留指纹或其他污物。
此步最好提前做好)B、润湿毛玻璃（注意蒸馏水不可弄的太多），放胶条，放另一块玻板，封好胶条（尤其毛玻璃最下端），用夹子在两侧夹好玻板（最好往两侧最下端夹，且夹在毛玻璃位置）。
C、制胶(例：20mL、8％。
注意不同片段长度所用胶浓度不同）30％Acr/Bis 5.334mL10×TBE 4mL10％Ap 250uLTEMED 25uL蒸馏水11.066mL添加顺序：蒸馏水→30% Acr/Bis→10×TBE→10% Ap→TEMEDD、混匀PAGE，迅速倒胶，注意不要产生气泡（最好从胶槽中间倒），插入梳子，切勿在齿下留有气泡。
E、室温聚合约10分钟后，取出梳子（用力要均衡），迅速用蒸馏水冲洗点样孔，用注射器吸净孔内的水，放置胶板，倒入电泳缓冲液(1×TBE)。
（注意胶板下端千万不要留有气泡，要仔细检查）F、电泳槽置冰水混合物中250V预电泳10分钟。
pcr实验流程和注意事项
PCR实验流程如下：
试剂准备阶段：在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。
所有的PCR体系都应该在-20℃保存，除了ddH2O之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。
配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。
体系配制完成之后应马上进行PCR反应。
样本制备阶段：样本制备是整个PCR反应中最为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。
严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。
所有操作需要在生物安全柜内进行，操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒，注意生物安全柜中物品的排放。
戴手套并勤于更换，要有无核酸观念。
在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。
PCR实验注意事项：
引物长度通常在18-22个碱基之间。
解链温度Tm值通常要在52-58度之间。
GC含量也是一个重要的因素。
以上信息仅供参考，具体步骤和注意事项可能会因实际情况而有所不同，建议咨询专业人士获取更准确的信息。
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PCR-SSP ABO基因分型实验操作规程 SXYJ-GZ-0222
1目的本文件规定了采用PCR－SSP技术、使用ABO基因分型试剂盒，对被检标本ABO血型基因型进行鉴定的操作规程。
2适用范围适用于各类ABO疑难血型标本鉴定。
3职责检测者负责依据此程序进行ABO基因分型实验操作。
4材料与设备ABO分型试剂盒（美国G&T公司）、Taq酶（Promega公司）、注射用水、PCR 扩增仪、微量加样器、涡旋震荡仪、冰箱、灭菌0.5ml离心管、灭菌200µl枪头、灭菌20µl枪头、废物缸、超净工作台、台式离心机、一次性帽子、口罩、手套等。
5操作方法
5.1建立PCR反应体系按此操作规程表1建立PCR反应体系
表1 PCR扩增反应体系配制
5.2PCR扩增反应采用热启动方法，先将PCR扩增仪预热到95℃后，再放入PCR板或
PCR试管，进行以下扩增反应：95℃预变性5min;95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保温。
5.3质量控制标准：
5.3.1PCR反应体系的建立必须在PCR前区的生物安全柜进行操作。
5.3.2实验前应对照DNA模板管编号标记相应PCR管或板。
5.3.3必须设立ABO各基因表型的阳性对照。
5.3.4严格按操作规程中PCR扩增循环程序参数进行扩增，放入PCR板或PCR试管前需调出
已存入的程序核对无误后再进行PCR扩增。
5.3.5严格按照要求存放Taq DNA聚合酶，使用时一定要放在冰盒中保持低温，并核对有效
期限和浓度，用后立刻放回冰箱，不得反复冻融。
5.4琼脂糖凝胶电泳参见SXYJ-GZ-0305《凝胶电泳操作规程》。
5.5琼脂糖凝胶电泳结果记录与分析参见SXYJ-GZ-0318《凝胶成像系统操作规程》。
6结果分析
每个PCR反应都产生强弱不一的207bp内对照产物。
由于竞争作用，某些PCR反应中内对照很弱，属正常现象。
根据是否产生特异性PCR产物及其大小来指定相应基因型，见此操作规程表2。
表2 PCR产物及检测的等位基因PCR Mix PCR产物（bp）检测的等位基因
A 75 A101,A102,A103,A113;A201,A202,A203,A205,A206;A301,A302; Ax01,Ax03,Ax04;Ael01,Ael02;cis-AB01;B108;O301,O302O304
B 90 B101,B102,B103,B104,B105,B106,B107,B108;B301,B302; Bx01; Bel01,Bel02;B(A)01;B(A)02; cis-AB01,cis-AB02
O 127 O101,O102,O103,O104,O105,O106,O108,O108,O109,O110, O111,O112,O113,O114,O115,O116,O117,O118,O119;
O201,O202,O203,O204,O205,O206,O207,O208,O209,O210, O211,O212,O213,O214
7常见问题分析参见试剂使用说明书。
8依据ABO基因分型试剂盒使用说明书。