单抗腹水制备过程中遇到的问题及对策
通过小鼠腹水如何大量制备单克隆抗体
教学中产生的问题：单克隆抗体的制备过程中，大家都关注了筛选过程，往往没有关注制备的两条途径，其中之一，细胞培养的途径许多学生能理解，而腹水生产的途径就不熟悉，教材中也没有介绍，而这对内环境的知识也是有帮助的。
单克隆抗体（monoclonal
antibody，MAb），是针对专一的抗原决定簇产生的抗体。
单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，主要原理是利用产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。
两种方法生产单克隆抗体：
目前大量制备单抗的方法主要有两种方法，一种是动物体内生产法（腹水制备），在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体；另一种是细胞体外培养法，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
由于腹水中单克隆抗体的产生通常会导致内源性宿主蛋白的污染，因此细胞培养对于小规模和大规模单克隆抗体的生产至关重要。
重点问题解疑：如何通过腹水产生单克隆抗体？
杂交瘤细胞被注射到小鼠腹腔内，由于有组织液提供足够的营养，所以能够大量分裂。同时部分杂交瘤细胞分泌抗体，这些细胞和抗体导致腹腔组织液渗透压增高，血浆和淋巴就会渗出并潴留在腹腔内形成腹水。
腹水制备法的优点：
腹水制备法操作简单、制备成本低，是目前国内生产抗体的主要方式，但是，得到的腹水常混有小鼠的各种杂蛋白（包括免疫球蛋白Ig），而且还有污染动物病毒的危险。而体外培养法通过转代培养制备的细胞培养得到的抗体，不但不含小鼠杂蛋白和动物病毒，而且抗体易纯化，目前在国外抗体生产中非常流行。
实验中可能出现的常见问题与解决办法
实验中可能出现的常见问题与解决办法一．污染污染是指由于微生物的侵染，在组织培养容器中滋生大量菌斑，使组培材料不能正常生长和发育的现象，主要有以下5方面的原因：1.器具灭菌：实验的所有器具都要在121°C消毒25min，若灭菌温度不够或者时间不足，都会导致污染。
灭菌时要求冷空气完全排除，否则会达不到指定温度。
其次，要做好灭菌登记，杜绝出现人为失误造成的污染。
此外，在接种过程中，每用一次都要在火焰上彻底灼烧，特别在接触到污染物时极易引起器具污染。
2.外植体：很多材料在灭菌后其实还是带菌的，不过量比较少，短期应该观察不到被感染的现象。
3.接种操作：首先，接种人员的手，手腕要用酒精棉球好好擦拭。
其次，对于放置在外的培养物（灭菌好的培养基）其瓶子外壁上有灰尘与微生物，放入超净台前可以用酒精消毒一下。
再者，很容易出现瓶口的污染，所以接种人员的技术要娴熟，干练。
4.环境条件：加强环境的灭菌消毒。
若有污染的材料不可以就地清洗，必须高压杀菌后再清洗，否则会导致大量孢子弥漫。
此外，要及时打扫卫生，定期蒸熏消毒。
保证环境的干净。
5.超净工作台：要定期对初过滤器进行清洗和更换。
此外，每次使用前要提前20min打开机器预处理，并对台面进行酒精喷雾消毒。
二．材料死亡实验过程中，很可能出现材料死亡，主要有以下几个方面：1.外植体灭菌过度：一旦材料太小或灭菌时间太长，剂量太大，就会导致材料死亡，所以要严格控制时间。
2.污染：大量污染会造成材料死亡。
3.培养基配置出现问题：在激素配置或营养成分配置出现问题时，材料易死亡，常常发生在无生长点的材料和愈伤组织中。
4.培养环境的恶化：温度过高，透气不好，培养过于密集，久不转移，有害气体的累积都会造成培养材料的死亡。
【措施】：【1】.选用较为温和的灭菌剂，降低药物浓度，减少灭菌时间，或选取较为坚强的外植体（eg：生长季节取芽）【2】注意个人卫生，严格按照规则进行操作。
【3】认真配置各种母液及培养基，选用盐含量较低的培养基，也可以试着用1/2或1/4的培养基，并调整各激素的用量和配比。
单克隆抗体制备流程
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／ ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／ ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／ ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般～1ml ／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
单抗制备
杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4）细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；（10）单克隆抗体的大量制备。
下面简要介绍单克隆抗体的制备过程：1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。
将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。
在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT 选择性培养基。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。
未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。
只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。
通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。
采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。
经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
制剂生产过程中常见问题和处理方法
制剂生产过程中常见问题和处理方法在制剂生产中，由于涉及到众多环节和复杂的工艺流程，常常会遇到各种各样的问题。
这些问题如果不加以妥善处理，不仅会影响产品的质量和产量，还可能导致生产延误、成本增加甚至安全事故。
下面我们就来探讨一下制剂生产过程中的一些常见问题以及相应的处理方法。
一、原材料质量问题原材料的质量是影响制剂产品质量的关键因素之一。
常见的问题包括原材料的纯度不达标、含水量过高、杂质含量超标等。
处理方法：1、加强原材料的采购管理，选择质量可靠的供应商，并建立严格的原材料检验制度。
对每一批次的原材料进行全面的检测，包括外观、纯度、含水量、杂质含量等指标，确保原材料符合质量标准。
2、对于纯度不达标或杂质含量超标的原材料，应进行进一步的提纯或去除杂质处理。
如果无法处理，应坚决予以退货。
3、控制原材料的储存条件，避免受潮、受污染等情况。
对于易吸湿的原材料，应存放在干燥的环境中；对于易氧化的原材料，应采取密封、避光等措施。
二、设备故障问题制剂生产需要依靠各种设备，如混合机、粉碎机、压片机、灌装机等。
设备故障会导致生产中断，影响生产效率。
处理方法：1、建立完善的设备维护保养制度，定期对设备进行检查、清洁、润滑、调试等保养工作，及时发现和排除潜在的故障隐患。
2、配备专业的设备维修人员，提高维修人员的技术水平和应急处理能力。
当设备出现故障时，能够迅速准确地诊断故障原因，并采取有效的维修措施。
3、储备必要的设备备件，以便在设备出现故障时能够及时更换，减少设备停机时间。
4、对于关键设备，可以采用双机备份或备用生产线的方式，以确保生产的连续性。
三、工艺参数控制问题制剂生产过程中的工艺参数，如温度、压力、搅拌速度、反应时间等，对产品的质量和产量有着重要的影响。
如果工艺参数控制不当，可能会导致产品质量不稳定、收率降低等问题。
处理方法：1、在生产前，对工艺参数进行充分的研究和验证，确定最佳的工艺参数范围。
在生产过程中，严格按照工艺规程控制工艺参数，确保工艺参数的稳定性和准确性。
单克隆抗体生产过程中的杂质去除技术之现状与展望
单克隆抗体生产过程中的杂质去除技术之现状与展望生物制剂在临床治疗和商业上的成功，推动了全球对生物产能的巨大需求。
生物制剂上游产能已经得到显著提升，但同时也给下游去杂和纯化过程造成障碍，开发高通量去杂和纯化技术成为新的瓶颈。
细胞培养环境的多样性使得制品中的杂质复杂多样，痕量的杂质残留都会在人体产生严重的免疫反应，因此必须使制品所含杂质的成分和浓度控制在制品的质量要求之下。
制品中的杂质主要由两部分组成，一种与制品本身相关，另一种由生产过程中带入。
与制品相关的杂质包含制品组分的多聚体、降解产物、错误翻译产物等；生产过程中带入的杂质包括残留的细胞组分、添加剂、培养基等。
其中宿主细胞蛋白质（HCPs）和核酸（DNA）是最主要的杂质。
杂质去除始于制品纯化的初始阶段，以减轻下游纯化的负担，也有利于保护下游纯化设备、提高纯化效率。
所使用去杂技术的的适用性、去杂效率、运行成本等都需要纳入考虑范畴。
本文主要介绍三种去杂技术：沉淀、絮凝和深层过滤。
沉淀技术沉淀技术长期用于血浆蛋白纯化、抗体分离和富集，通过降低目标组分的溶解度实现。
沉淀极大浓缩产物，实现溶剂置换。
改变培养液pH、电导率和加入沉淀剂等可选择性地改变沉淀对象。
改变细胞培养液pH，尤以使培养液pH低于杂质等电点，可有效地去除HCPs和DNA。
沉淀剂是一类低溶解度物质。
沉淀剂破坏胶体的平衡状态，触发沉淀。
降低培养液pH与沉淀剂共同作用，低pH条件进一步降低沉淀剂的溶解度从而引起共沉淀。
辛酸及其钠盐用于沉淀血浆、血清和腹水蛋白质。
酸性条件下，酸性蛋白质（如HCPs）被沉淀，偏碱性的抗体保持溶解状态。
有研究发现，辛酸对抗体的纯化效果优于抗体片段（FC片段），可能由于抗体的疏水基团包裹于内。
辛酸破坏包膜病毒的脂质层，使病毒失活，但对非包膜病毒效果不明显。
有机溶剂通过分步沉淀达到纯化混合蛋白质的目的。
但高浓度的有机溶剂引起蛋白质变性，其疏水基作用产生的高温同样使蛋白质变性。
细胞冻存复苏及腹水制备-LM
四，细胞培养时的注意事项：
1，要定期观察细胞的状态，发现问题及时处理，切忌将 细胞弃之不顾。 2，不能频繁将细胞拿进拿出，会影响细胞的生长。 3，不能频繁更换培养基，细胞生长有一个适应过程。 4，必须更换培养基时应严格无菌操作，避免交叉污染。 如液体变黄，死细胞过多等原因可考虑换液。 5，培养基应该做到专人专用。 6，发现细胞污染后需要及时处理，避免传染。
第二章，细胞的复苏
一，确定复苏的细胞数 二，制备适量的饲养细胞 三，细胞的复苏 四，细胞复苏的注意事项
细胞冻存复苏及腹水制备-LM
一，首先确定复苏的细胞数
1，比较紧急的项目 对于研发性腹水一般要先和领导沟通确定哪些项目紧急，
紧急的项目要随时准备复苏。例如，目前紧急的有肿瘤系列 细胞如CA153CR，CA724，colo205等。中样腹水一般由领 导直接下单子。 2，根据实际情况自行安排
细胞冻存复苏及腹水制备-LM
二，细胞培养的污染
细菌污染 培养细胞受细菌污染后， 会出现培养液变混浊，PH改 变。污染后细胞发生病理改 变，胞内颗粒增多、增粗， 最后变圆脱落死亡。
小鼠胃癌细胞的球菌感染
2021/2/1
细胞冻存复苏及腹水制备-LM
二，细胞培养的污染
真菌污染
培养细胞受真菌污染后，可见培养液 中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在 生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微 镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横 交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状 排列。
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二，小鼠的选择
小鼠的选择很研发重要，不仅关系到腹水的数量还 关系到质量，研发性和中样细胞必须挑选状态好的小鼠， 小鼠健康标准：1,食欲旺盛；2,眼睛有神，反应敏捷； 3,体毛光滑，肌肉丰满，活动有力；4,身无伤痕，尾不 弯曲，天然孔腔无分泌物，无畸形；5,粪便黑色呈麦粒 状；6,小鼠的尾、趾有无溃烂；7,检查眼、耳、鼻、肛 门有无分泌物和异常增殖物;8,肚子不瘪进去
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单抗腹水制备过程中遇到的问题及对策
1，腹水少或者无腹水产生
①致敏不正确，不正确的使用致敏剂，或者致敏时间与接种杂交瘤的时间相差太久，一般是7-14天，具体看小鼠的腹部情况。
②杂交瘤细胞或者致敏剂的接种位置不正确，没有打到腹腔，而是打到了皮下。
③接种的杂交瘤细胞数量太少，太多或者细胞状态不好。
一般不50万个细胞左右为宜。
④建议使用母鼠或者生育过的母鼠制备腹水。
2，腹水没有效价
①制备腹水的杂交瘤极不稳定，打到小鼠身上之前就失去抗体分泌能力或者打到腹腔内就失去了分泌能力。
②致敏小鼠时采用了错误的致敏剂。
③接种的杂交瘤细胞数量太少，或者细胞状态不好。
④由于注射方式和部位错误，形成了实体瘤。