cDNA文库构建
名词解释cdna文库
CDNA 文库
CDNA 文库是一种 cDNA(互补 DNA) 文库，它包含了生物体中所有基因的 mRNA 转录本的互补 DNA 序列。
在 CDNA 文库中，mRNA 被逆转录成 cDNA，然后被克隆到载体中，最终形成一个包含所有基因信息的文库。
CDNA 文库的构建过程通常包括以下步骤:
1. 从生物组织中提取 mRNA，并去除 rRNA 和 tRNA 等非编码RNA。
2. 将 mRNA 逆转录成 cDNA，使用逆转录酶将 mRNA 转录成cDNA，并在此过程中添加适配体，以产生特定长度的 cDNA 片段。
3. 将 cDNA 片段连接到载体上，通常使用质粒载体。
4. 将连接好的载体转化到大肠杆菌中，并筛选出阳性克隆。
5. 对阳性克隆进行测序和分析，以确定其序列信息。
CDNA 文库在基因组学研究中具有广泛的应用，例如:
1. 基因克隆：通过 CDNA 文库，可以克隆出感兴趣的基因，并对其进行进一步的研究。
2. 基因表达分析：通过比较不同组织或条件下的 CDNA 文库，可以分析基因的表达情况，了解基因在生物体内的功能和调控机制。
3. 基因组测序：通过 CDNA 文库，可以对生物体的基因组进行测序，以确定其基因组序列信息。
cdna文库的构建步骤
cdna文库的构建步骤CDNA文库是基因组学和转录组学研究中非常常见的技术，它可以用来快速鉴定不同组织或不同生长条件下基因表达的变化情况。
下面将介绍CDNA文库的构建步骤。
一、RNA提取RNA提取是构建CDNA文库的第一步，它是从不同组织或生长条件下采集的样品中提取出RNA。
RNA提取需要注意以下几点：1. 样品必须在冰上保存，并尽可能快地进行处理。
2. RNA提取要使用无菌工具和试剂，并严格遵守操作规程。
3. RNA提取要避免DNA污染，可使用DNase对RNA进行处理。
4. RNA质量要进行检测，以保证后续实验的可靠性。
二、反转录反转录是将RNA转化为cDNA的过程。
反转录需要注意以下几点：1. 反转录试剂必须新鲜，并且使用前应该预先热处理。
2. 反转录反应时间和温度要根据实验需求进行调整。
3. 可以选择使用随机引物或寡聚dT引物作为反转录引物。
三、二代测序前的PCR扩增PCR扩增是将cDNA扩增为足够的量以进行二代测序的过程。
PCR扩增需要注意以下几点：1. PCR反应体系要严格控制，避免引物和模板过量。
2. PCR反应时间和温度要根据实验需求进行调整。
3. 可以选择使用高保真PCR酶，以保证扩增产物的准确性。
四、文库构建文库构建是将PCR扩增产物连接到载体上，形成完整的CDNA文库的过程。
文库构建需要注意以下几点：1. 选择合适的载体，如pBluescript II SK+、pUC19等。
2. 连接PCR扩增产物时要控制连接比例，避免连接过多或过少。
3. 连接后可以进行转化、筛选和纯化等步骤，得到CDNA文库。
五、二代测序二代测序是对CDNA文库进行高通量测序的过程。
二代测序需要注意以下几点：1. 选择合适的平台和测序模式，如Illumina HiSeq、NovaSeq等平台。
2. 测序深度要根据实验需求进行调整，以保证数据质量和覆盖度。
3. 测序后得到原始数据后，需要进行质控、去除低质量数据、拼接等步骤，得到高质量的测序数据。
cDNA 文库的构建
第二节cDNA 文库的构建cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。
cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。
cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。
cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第二，第一链 cDNA 合成；第三，第二链 cDNA 合成；第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。
图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图一、RNA 的分离cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总RNA 中所占比例很小，因此从总RNA 中富集mRNA 是构建cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。
通过降低rRNA和tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。
目前纯化mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与mRNA 的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA ，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。
1．mRNA 的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，mRNA 的大小，总mRNA 制剂指导合成cDNA 第一链长分子的能力。
2．mRNA 的丰度高丰度mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占50-90% 。
低丰度mRNA ：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA 。
3．mRNA 的富集3.1按大小对 mRNA 进行分级分离3.2 cDNA 的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA ，可避免降解mRNA , agarose 分离大小易辨。
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。
自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。
通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系．因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。
它是发现新基因和研究基因功能的工具。
1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。
真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。
真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA （complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。
而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。
为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA 谱，需要先构建cDNA文库。
所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。
cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中：N－cDNA文库所包含的克隆数目；P－低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99％；1/n－每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。
2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA；④双链cDN 的分子克隆；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。
对cDNA的文库的要求：一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆；二是克隆的cDNA应是全长的，避免丢掉5’端的序列。
cDNA文库构建
cDNA文库构建cDNA文库[原理]：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。
CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。
从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。
cDNA文库的构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：SepharoseCL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA 第一链的合成：poly(A)+RNA(1μg/μl)10μl寡核苷酸引物(1μg/μl)1μl1mol/LTris-HCl(pH8.0,37℃) 2.5μl1mol/LKCl 3.5μl250mmol/LMgCl22μldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl0.1mol/LDTT2μlRNase抑制剂（选用）25单位加H2O至48μl2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。
在这个小规模反应管中加入0.1μl[α-32P]dCTP（400Ci/mmol,10mCi/ml）。
3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl0.25mol/LEDTA，然后将反应管转移到冰上。
大规模反应管则在70℃温育10min，然后转移至冰上。
5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。
此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。
cDNA文库构建
cDNA文库构建概述cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA （cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。
cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。
cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。
但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。
真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。
高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都仅有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。
cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。
原理经典cDNA文库构建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA 文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
cDNA文库的构建流程
▲3M 醋酸钠
▲ 4M LiCL:
MOPS 41.86g NaAC·3H2O 4.10g 0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml 用 NaOH 调 PH 值 6.5 , DEPC 水定容到 1L，室温避光放置 备用。 ▲ 1x MOPS: 10x MOPS 30ml 加 DEPC 水 270ml，用时现配。 ▲4x RNA Loading buffer: 10x MOPS 400ul 甘油（高压过） 200UL 溴酚兰 10ul 甲醛(37%) 72ul 去离子甲酰氨 310ul EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul 70ul ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 在 4℃ 可保持 3 个月 ▲ 10x PBS pH=7.4 NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14.4g KH2PO4 2.4g 定容至 1000ml ▲变性电泳胶： 称取 0.5g 琼脂糖，加入 47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至 50℃左右，加入 2.5ml 甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。 ▲变性电泳缓冲液： 在 250ml 容量瓶内加入 5ml 甲醛，用 1x MOPS 定容至 250ml
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பைடு நூலகம்
13. 4℃，13000rpm 离心 15min。 14. 弃上清，用 1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm 离心 10min。 15. 弃上清，取沉淀，空气中干燥 RNA 沉淀，直至无乙醇味。 16. 用 40－60ul DEPC 水溶解(300-500ug/g)RNA 沉淀。 17. 取少量 RNA 用于测定 OD 值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。
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9． 10． 11． 12． 13． 14． 15． 16． 17．
cDNA文库的构建
3. mRNA 的纯化
对高丰度的 mRNA 来讲，其所对应的 cDNA 克隆很NA 之前不需要进一步纯化和富集。分离低丰度 mRNA 通常有如下两种方法：①按照大小对总 mRNA 进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。
4. mRNA 完整性的确定
确定 mRNA 完整性的方法有三种：
① 直接检测 mRNA 分子的大小；
② 测定 mRNA 的转译能力；
③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。
二、 cDNA 的合成和克隆
1. cDNA 第一链的合成
用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。
3. 将 cDNA 重组到载体上
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cDNA文库构建cDNA文库[原理]：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。
CDNA 组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。
从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA 开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。
cDNA文库的构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl1mol/L KCl 3.5μl250 mmol/L MgCl22μldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl0.1 mol/L DTT 2μlRNase抑制剂（选用）25单位加H2O至48μl2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。
在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。
3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。
大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。
5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。
此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。
6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）：[掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg)7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。
[阶段2：cDNA第二链的合成]1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中：10 mmol/L MgCl270μl10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol）10μl1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μlRNase H (1000单位/ml) 1μl大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。
在16℃温育2~4h。
2．温育结束，将下列试剂加到反应混合物中：β-NAD (50 mmol/L) 1μl大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml) 1μl室温温育15min。
3．温育结束，加入1μl含有4种dNTP的混合物和2μl T4噬菌体DNA聚合酶。
反应混合物室温温育15分钟。
4．取出3μl反应物，按步骤7和8描述的方法测定第二链DNA的质量。
5．将5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中，用酚：氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。
在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收DNA，将DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。
6．将下列试剂加到DNA溶液中：10×T4多核苷酸激酶缓冲液10μlT4多核苷酸激酶（3000单位/ml）1μl室温温育15分钟。
7．测定从上面步骤4取出的3μl反应物中放射性活度，并按分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法测定1μl第二链合成产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。
8．用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。
要考虑到已掺入到DNA第一链种的dNTP的量。
[第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA第二链合成量/μgx表示cDNA第一链量。
CDNA第二链合成量通常为第一链量的70~80%9．用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物进行抽提。
10．Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和cDNA分开。
11．加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15分钟，然后在微量离心机上以最大速度4℃离心15分钟，回收沉淀DNA。
用手提微型监测仪检查，是否所有放射性都沉淀下来。
12．用70%乙醇洗涤沉淀物，重复离心。
13．小心吸出所有液体，空气干燥沉淀物。
14．如果需要用Eco R I甲基化酶对cDNA进行甲基化，可将cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中。
另外，如果要将cDNA直接与Not I或Sal I接头或寡核苷酸衔接子相连，可将cDNA悬浮在29μl TE(pH7.6)溶液。
沉淀的DNA重新溶解后，尽快进行cDNA合成的下一步骤。
[阶段3：cDNA的甲基化]1．在cDNA样品中加入以下试剂：2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl5 mol/L NaCl 2μl0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸1μl加H2O至96μl2．取出两小份样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为1号和2号，置于冰上。
3．在余下的反应混合液中加入2μl Eco R I 甲基化酶（80 000单位/ml），保存在0℃直至步骤4完成。
4．再从大体积的反应液中吸出另外两小分样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为3号和4号。
5．在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA。
这些未甲基化的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率。
6．所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃温育1h。
7．于68℃加热15min，用酚：氯仿抽提大体积反应液一次，再用氯仿抽提一次。
8．在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，混匀后贮存于-20℃直至获得小样反应结果。
9．按下述方法分析4个小样对照反应：a. 在每一对照反应中分别加入：0.1 mol/L MgCl22μl10×Eco R I 缓冲液2μl加H2O至20μlb. 在2号和4号反应管中分别加入20单位Eco R I。
c. 四个对照样品于37℃温育1h，通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
10．微量离心机以最大速度离心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。
弃上清，加入200μl 70%乙醇洗涤沉淀，重复离心。
11．用手提式微型探测器检查是否所有放射性物质均被沉淀。
小心吸出乙醇，在空气中晾干沉淀，然后将DNA溶于29μl TE（pH8.0）。
12．尽可能快地进行cDNA合成的下一阶段。
[阶段4：接头或衔接子的连接]cDNA末端的削平1．cDNA样品于68℃加热5 min。
2．将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂：5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液10μldNTP溶液，每种5 mmol/L 5μl加H2O至50μl3．加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml），37℃温育15min。
4．加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，以终止反应。
5．用酚：氯仿抽提，再通过Sephadex G-50离心柱层析，除去未掺入的dNTP。
6．在柱流出液中加入0.1倍体积的3 mol/L 乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇，样品于4℃至少放置15 min。
7．在微量离心机上以最大速度离心15 min(4℃)，回收沉淀的cDNA。
沉淀经空气干燥后溶于13μl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).接头-衔接子与cDNA的连接8．将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中：10×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液2μl800~1000 ng的磷酸化接头或衔接子2μlT4噬菌体DNA连接酶（105 Weiss单位/ml）1μl10 mmol/L ATP 2μl混匀后，在16℃温育8~12h。
9．从反应液中吸出0.5μl贮存于4℃，其余反应液于68℃加热15min以灭活连接酶。
[阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA]Sepharose CL-4B柱的制备1．用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部，用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。
2．将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。
将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。
轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关闭软管。
3．在吸管宽端接一段乙烯泡沫管，让糊状物静置数分钟，放开止血钳，当缓冲液从吸管滴落时，层析柱亦随之形成。
如有必要，可加入更多的Sepharose CL-4B，直至填充基质几乎充满吸管为止。
4．将几倍柱床体积的含0.1 mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。
洗柱完成后，关闭柱子底部的软管。
依据大小分离回收DNA5．用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体，将cDNA加到柱上（体积50μl 或更小），放开止血钳，使cDNA进入凝胶。
用50μl TE(pH7.6)洗涤盛装cDNA的微量离心管，将洗液亦加于柱上。
用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充满泡沫管。
6．用手提式小型探测器监测cDNA流经柱子的进程。
放射性cDNA流到柱长2/3时，开始用微量离心管收集，每管2滴，直至将所有放射性洗脱出柱为止。
7．用切仑科夫计数器测量每管的放射性活性。
8．从每一管中取出一小份，以末端标记的已知大小（0.2kb~5kb）的DNA片断作标准参照物，通过1%琼脂凝胶电泳进行分析，将各管余下部分贮存于-20℃，直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片。
9．电泳后将凝胶移至一张Whatman 3MM滤纸上，盖上一张Saran包装膜，并在凝胶干燥器上干燥。
干燥过程前20min至30min于50℃加热凝胶，然后停止加热，在真空状态继续干燥1~2h.10．置-70℃加增感屏对干燥的凝胶继续X射线曝光。
11．在cDNA长度≥500bp的收集管中，加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇。
于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量离心机于4℃以12 000g 离心15min，以回收沉淀的cDNA。