降解石油复合微生物菌剂的筛选研究
微生物菌剂技术研究及应用示范总结报告
微生物菌剂技术研究及应用示范总结报告一、课题主要研究内容利用微生物菌剂促进作物健康生长，提高作物抗逆性、拮抗重金属等能力，在农产品保增产同时，减少杀菌剂、化肥、激素的使用为首要目标，最终实现提高农产品品质，提升农产品安全，减少作物病虫害发生。
研究内容主要包括微生物菌剂产品商品化工艺与质控体系建立、微生物菌剂产品应用效果评价、微生物菌剂产品应用示范三个部分。
二、课题研究的技术路线和方法所完成项目的核心内容、技术特征、技术方法和难点；项目研究的技术路线和实现途径，技术成果先进性、成熟性。
（一）小区试验筛选常见蔬菜，在作物不同生长期使用微生物纳米硒营养液，观测其对作物根系、叶片、茎干的影响，在作物生长过程中观测作物对病原菌的抗性。
收获后检测农产品中硒含量以及其他营养元素的含量，在此基础上对微生物纳米硒进行优化。
（二）大田实验每种作物设置实验组与对照组，每组2亩；实验周期为作物的一个生长周期。
实验组处理方法：依据小区试验结果，设定大田实验中微生物纳米硒的喷施剂量与喷施时期；对照组不做处理即可。
结果观测：喷施后7-10天观测作物的长势、叶片大小、根系生长情况、作物抗病能力以及农产品成熟度；农产品采收后检测农产品中硒与其他营养成分的含量、检测农产品中杀菌剂农药残留数据。
（三）机理研究通过营养成分检测与代谢组学研究，研究微生物纳米硒、微生物菌剂等植物内源激素的影响，以探明其抗病抗虫的机制。
三、研究内容和取得的成果（一）微生物菌剂产品商品化工艺与质控体系建立课题组依据任务书要求，筛选了3种微生物菌剂，分别为复合微生物菌剂、微生物纳米硒和微生物有机肥，并对产品效果进行评价。
2.微生物纳米硒工艺微生物纳米硒由桂林集琦生化有限公司转化，登记证号：微生物肥（2018）准字6480号，有效活菌数≥0.5亿/mL，6%≤N+P2O5+K2O ≤20%。
（1）微生物纳米硒的发酵工艺1）主要原料：硒粉、动物源氨基酸、植物源氨基酸、海藻酸、蔗糖、糖蜜等2）发酵菌种：酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、醋酸杆菌、巨大芽孢杆菌。
石油降解菌株的筛选 鉴定及其石油降解特性的初步研究
（2）pH值对菌株降解效率的影响：在pH值为7.0时，菌株X的降解效率最高， 达到60%以上。当pH值偏离7.0时，其降解效率明显下降。
（3）盐度对菌株降解效率的影响：在低盐度条件下，菌株X的降解效率较高。 随着盐度的增加，其降解效率逐渐降低。当盐度超过5%时，其降解效率显著下降。
（4）产物分析：利用GC-MS等技术，我们对菌株X降解石油烃的产物进行了 分析。结果显示，菌株X能够将石油烃主要降解为脂肪酸、酚类化合物等中间产 物。这些中间产物在进一步降解过程中转化为二氧化碳和水，从而实现石油烃的 生物修复。
2、筛选流程：首先，采集油污土壤和石油废水样品，进行富集培养；其次， 通过初筛和复筛，获得具有较强石油降解能力的菌株；最后，通过形态学和分子 生物学鉴定，确定菌株种类。
3、鉴定步骤：将筛选得到的菌株进行16S rDNA分子鉴定，利用细菌分类学 软件进行比对分析，最终确定菌株的种属。
4、石油降解特性分析：采用液体培养法测定菌株的石油降解能力，通过测 定不同时间点石油烃类物质的含量，计算菌株的降解速率和降解效率。
1、菌株筛选
从石油烃污染地区采集土壤样品，采用富集培养法，经过多步筛选，获得具 同温度、pH值、盐度等条件下，对菌株降解石油烃的能力进行测定。通 过改变环境因素，观察其对菌株降解效率的影响。同时，利用气相色谱-质谱联 用（GC-MS）等技术，对菌株降解的产物进行分析。
参考内容
一、引言
石油烃是石油和天然气的主要成分，它们在自然环境中的存在和降解对全球 碳循环和环境生态有着重要影响。厌氧降解菌在石油烃的降解过程中扮演着关键 角色。本次演示旨在筛选出具有高效石油烃厌氧降解能力的菌株，并对其降解特 性进行研究，以期为石油烃污染的生物修复提供理论依据。
二、材料与方法
降解石油复合微生物菌剂的筛选研究
降解石油复合微生物菌剂的筛选研究摘要：从30个土样中筛选出3株高效原油降解菌株，它们为dch-16，dch-19和dch-20，7天后降油率分别为75.6%，80.3%和73.2%。
经鉴定，分别是脂肪酸芽孢杆菌属alicycolobacillus，芽孢肠状杆菌属sporomaculum和盐芽孢杆菌属halobacillus。
将此3株高效原油降解菌在原油培养基中进行复合实验，结果表明，在相同条件下复合菌降油效果优于单菌；菌株dch-19与dch-20复合的最佳原油降解条件为：接种量比1：1（总接种量为10%），ph值为7.5，底物浓度20mg·ml-1，温度35℃，原油降解时间为7天。
将实验复筛所得部分降油菌用于胜华炼厂废水处理，效果最好的是菌dch-19和dch-20的复合，处理两天后降油率达到80.2%。
表明复合菌株dch-19和dch-20有很强的适应能力。
abstract： we select three strains of high efficient oil degrading strains from 30 soil samples， i.e. the dch-16，dch-19 and dch-20. seven days later， the oil degradation rate turns to 75.6%， 80.3% and 73.2%. the three strains are identified as the fatty acid bacillus alicycolobacillus，bacillus sporomaculum and bacillus halobacillus. thereafter，we use the three strains of high efficient degradation bacteria for the crude oil compound experiments. the result shows that the compound bacteria has much better efficiency than single bacteria， and the optimized condition for dcd-19and dch-20 is that： the inoculation ratio gets 1：1 with total inoculation 10%， the ph value is 7.5， the concentration of substrate is 20mg. ml-1， and the temperature reaches 35℃，then the degradation of crude oil will be 7 days. further more，we introduce part of the microbial inoculants into the refinery wastewater treatment of shenghua refinery. the compound dch-19 and dch-20 shows the best performance of petroleum degradation which is up to 80.2%.关键词：筛选；石油降解；复合生物菌；炼厂废水key words： selection；petroleum degradation；complex microbial inoculants；refinery wastewater中图分类号：[p642.5] 文献标识码：a 文章编号：1006-4311（2013）13-0296-03————————————作者简介：徐宝刚（1979-），男，山东潍坊人，工程师，工学学士，环境工程给排水专业硕士在读。
采油微生物复合菌剂驱油性能评价研究
［ 中 图 分 类 号 ］ＴＥ ３ ５ ７ ． ９
［ 文献标志码］Ａ
［ 文章编号］１ ６ ７ ３ —１ ４ ０ ９（ ２ ０ １ ３ ）０ １ —０ ０ １ ５ —０ ２
微 生物 提高 原油采 收率 技术 是 目前最 具发 展前景 的一 项采 油技 术 ，与其他 采 油技术 相 比 ，该技 术具 有适 应 范 围广 、工艺简 单 、投资 少 、见效快 和无 污 染 等优 点 。利 用 该 技术 的关键 是 相关 微 生 物 菌种 能够 在 油藏条 件 下生存 并产 生对 驱油 有利 的代 谢产 物 。因此 ，开 发 能适 应 不 同 区块 油 藏 的微 生 物并 研究 其相 关 的理化 性质尤 为 重要 。下 面 ，笔 者 在模 拟 地 层 条 件 下 ，对 从 大庆 油 田采 出液 中分 离筛 选 的 ４种菌 株 的复合 菌剂 性质及 驱 油效果 进行 研究 ，为下一 步 的配伍 和矿场 试验 提供参 考依 据 。
ห้องสมุดไป่ตู้
Ｌ ｅ ｉ ｃ ａ Ｌ Ｂ ３ ０ Ｓ电子 显微镜 （ 德 国徕 卡仪 器 有 限公 司） ；高 温 高压 蒸 汽 灭 菌锅 （ 哈尔 滨 市松 花 江 医疗
器 械厂 ） ；数 显 振荡 培养箱 （ 常州 国华 电器 公 司） ；超净 工作 台 。
２ 结 果 与分 析
２ ． １ 试 验菌 的特 性研 究
［ 作者简介］刘蕊娜 （ １ ９ ８ １一 ） ，女 ，工程师 ，现主要从事油田开发方面的研 究工作 。
理 工 上 旬 刊 ＊化 学 与 环境 工 程
２ ０ １ ３年 １ 月
１ ）试 验 茵的耐 温性 微 生 物对 温度 十 分敏 感 ，细 胞 内的各种 酶在 最适 温度 下 才有 高活 性 ， 温度过 高 酶 加 速失 活 ，活力 迅 速 降 低 ，导 致 细 胞死 亡 。将 菌 株 分 别 置 于 不 同 温 度 下 培 养 后 ，
石油降解菌的分离与鉴定
状， 经过分 离、 筛选、 复筛 ， 从大港油 田的石油 污染土壤 中富集分 离、 选 出 ２株石 油降解 菌， 优 并进 一步研 究了 ２株 菌 的生理生化特性． 菌株鉴 定结果表明 ， 菌株 Ｄ — Ｂ ｌ属于假 单胞杆菌属 ， 菌株 Ｄ Ｆ一１ 于曲霉 菌属 ． 属 关键词 ： 石油 ；石油污染土壤 ； 石油 降解 菌 ； 分离鉴 中图分类号 ： ５ Ｘ３ 文献标识码 ： Ａ ｄ ｉ１ ．９ ９ｊｉ ｎ １７ －９ Ｘ．０ １ ０ ．２ ｏ ：０３ ６ ／．ｓ ．６ ３ ０５ ２ １ ．４ ０ １ ｓ
Ｋｅ ｒ ｓ ｅ ｒ ｌｕ ；ｐ ｔｏｅ ｍ— ｏｌ ｔ ｄ ｓ ｉ；ｐ ｔ ｌ ｕ ｄ ｇ ａ ａｉｎ ｓｒ ｉ ｓ ｓ ｌｔｏ ｎ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｙ ｗｏ ｄ ：ｐ ｔｏｅ ｍ ｅｒ ｌｕ ｐ ｌ ｅ ｏ ｌ ｅ ｒ ｅ ｍ— ｅ ｒｄ ｔ ｔ ｎ ；ｉ ａｉｎ ａ ｄ ｉ ｅ ｔ ｉａ ｉ ｕ ｏ ｏ ａ ｏ ｆ ｏ
耐盐 性实 验 培 养 基 ： 白胨 ２ ｇ 蒸 馏 水 １０ ０ 蛋 ， ０
各三支， 一支作为空 白对照 ， 其他 两支分别接人两株
供 试菌 ， 同对 照试 管均 放 于 ３ 连 ７℃ 恒温箱 中培养 ２ ４
ｈ 观察 试 管 内培养 液 的混浊程 度 ． ， ２ 生长 曲线 的绘 制 ： ） 采用 比浊 法 ．
基 ，ｂ 为加 入 菌 株 在摇 床 中培 养 ４天 后 的 培养 基 ， （） （） Ｃ 为加 入菌株 并 在摇 床 中培养 ７天 后 的培 养 基 ． 通
过 观察 不难 发 现 ， （ ） （ ） 培 养 基 逐 渐 浑 浊 ， 从 ａ到 Ｃ ， 并
液转入新鲜 的牛 肉膏蛋 白胨液体培养基 中， 在上 述
℃ 、６ ｍｉ 条件 下 培养 １ ． １０ｒ・ ｎ ０ｄ 培养 液 明显 浑浊 ，
石油烃污染土壤微生物修复技术、菌剂的筛选研制及案例分析
为混合颗粒状粉剂，具有调理土壤环境，提高土壤渗透性、增加氧气传输 等作用，同时还具有很好的持水能力，有利于微生物生长，提高污染物降 解率。
油泥生物处理调质营养素
为白色粉剂，能有效改善土壤质地，为微生物提供营养物质，促进微生物 快速繁殖，增强降解活性，提高污染物降解速度。
六、微生物菌剂的生产
60
50
40
30
20
10
0 2周 4周 6周 8周 3个月 4个月
示范现场土壤中石油烃含量的变化
修复前 调理剂、菌剂播撒
翻耕
浇水
种植植物
修复后
五、石油污染土壤微生物修复技术
2、异位修复技术---堆体技术
根据多种生物堆体的生物学过程特性, 将其与微生物包埋/脱附增溶（IMT/SER）等强化工艺 相组合，建立了不同类型的生物堆体强化修复系统，并获得了完整的工艺参数。
土壤中主要石油污染物残留量测试 （GC-FID、UV、IR、重量法） 土壤中微生物群落变化 （PCR、DGGE）； 修复植物生物量变化。
CK F-7 FL-7 FH-7 F-24 FL-24 FH-24
FH-24 FL-24 F-24 FH-7 FL-7 F-7
修复后微生物群落谱带条数 增加了3-4倍
溶
（Rhodococcus erythropolis）；25%铜绿假单孢杆菌 （Pseudomonas aeruginosa）；25% acinetobacter）。
构建适宜反应的微环境
促进污染物的脱附传质
企业标准
《石油污染土壤处理用微生物修复菌剂》 (Q/0500DJH001-2015)
五、石油污染土壤微生物修复技术
菌剂添加量对修复效果的影响
微生物石油降解
中国科学院成都生物研究所研究出油田不同领域使用的微生 物菌剂，该项技术及其成套设备在胜利油田现场中试和工程应用 均获得圆满成功：中试反应器日处理能力达到5吨以上；工程化 应用装置日处理能力达到100吨；处理3-5h以内回收原油资源9598%；处理后土壤残留石油含量达到农用标准。
Thank you.
生物修复石油污染技术处理后的最终产物 是二氧化碳、水和脂肪酸,无二次污染 无二次污染。 是二氧化碳、水和脂肪酸 无二次污染。据有关 专家介绍,石油污染物生物修复技术 石油污染物生物修复技术,是利用微生 专家介绍 石油污染物生物修复技术 是利用微生 物及其他生物材料,将存在于土壤的石油污染物 物及其他生物材料 将存在于土壤的石油污染物 降解成二氧化碳和水或转化成为无害物质的工 程技术。微生物可以分解石油污染物质。 程技术。微生物可以分解石油污染物质。早在 上个世纪80年代 年代,对石油污染物的生物修复技术 上个世纪 年代 对石油污染物的生物修复技术 就开始研究,并逐渐在实际中应用 并逐渐在实际中应用。 就开始研究 并逐渐在实际中应用。
原位生物降解技术,顾名思义就是在污 染地直接进行生物修复,向污染区域投放氮、 磷营养物质,或接种经驯化培养的高效微生 物等,促进土壤中依靠有机物生存的微生物 的生长繁殖,提高目的微生物的种群数量,利 用其代谢作用达到分解石油烃的目的。此项 技术的关键是筛选高效吸收或降解污染物的 生物突变体。
Perfect？
石油污染物 微生物降解 措施和方法
投加 表面活性剂
投加 高效降解 石油 微生物
投加 氮、磷等 营养源
添加 电子受体
离 原 位 生 物 降 解 技 术 术 技 解 降 物 生 位
离位生物降解技术则必需将污染物转移到 具有一定条件的场所进行集中处理。处理方法包 括土耕法、土壤堆肥法、生物泥浆法。土耕法的 基本操作是将被污染的土壤置于处理垫上,进行定 期耕作,以提高生物降解效率。土壤堆肥法是将污 染物与一些容易分解的有机物混合在一起,并加入 氮、磷等其他无机营养物质,促使污染物加快分解 速度。生物泥浆法是将污染土壤和液体混合起来 形成泥浆,引入反应容器进行处理。
微生物降解石油烃
唐山学院毕业设计设计题目：微生物降解石油烃最适条件研究系别：环境与化学工程系班级：09 石油化工生产技术2班姓名：张贺松指导教师：程磊2012年6月11 日微生物降解石油烃最适条件研究摘要从学校腐蚀质土囊中筛选到2株对机油等相关石油制品具有高效降解能力的菌种ZL1 ZL2。
通过生长条件正交实验测定了温度、油量和pH值对其降解能力的影响。
实验表明：4天对于含油300mg/L的去除率分别达到67.9%和76.2%，其中ZL2菌对底物浓度和PH值有较广的适应范围。
关键词：正交实验高效降解菌菌种筛选Microbial degradation of petroleum hydrocarbons in the optimum conditionsAbstractCorrosion from the school the quality of soil in the bag filter to the 2 strains of bacteria degrading ability of oil and other petroleum products ZL1 ZL2. Orthogonal experimental determination of the growth conditions of temperature, substrate concentration and PH value of their degradation ability. The experimental results show that: four days for oily 300mg / L, the removal rate of 67.9% and 76.2%, which ZL2 bacteria have a wider range of substrate concentration and pH value.Keywords：Orthogonal experiment Efficient degradation bacteria Strain screening目录1 引言 (1)1.1石油污染的危害 (1)1.2微生物法治理石油污染 (2)1.3微生物降解石油途径 (4)1.4微生物降解石油影响因素 (5)1.5各国对微生物降解石油烃的研究 (6)1.6微生物降解石油烃类污染物的代谢机制 (6)1.7微生物降解菌的种类 (6)2 试验 (8)2.1材料 (8)2.1.1菌种 (8)2.1.2 培养基 (8)2.1.3试验药品 (8)2.1.4试验仪器 (9)2.2 优势菌筛分试验 (9)2.2.1取样 (9)2.2.2 准备实验用品 (9)2.2.3制作培养基 (9)2.2.3 高温灭菌 (9)2.2.4 初次富集分离 (10)2.2.5 连续富集分离 (10)2.2.6 平板分离 (10)2.2.7 划线分离 (10)2.3生长条件正交实验 (10)2.4 混合菌机油降解效率 (11)2.5分析方法 (11)3结果分析 (12)3.1 优势菌筛分实验 (12)3.2生长条件正交试验 (12)3.3混合菌种实验 (13)4结论 (15)谢辞 (16)参考文献 (17)外文资料 (18)唐山学院毕业设计1 引言上世纪初以来,石油的重要性日益突显。
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徐宝刚 ＸＵ Ｂ ａ ｏ — ｇ ａ ｎ ｇ ； 金 立建 Ｊ Ｉ Ｎ Ｌ ｉ － ｊ ｉ ａ ｎ ； ￣ ｑ 燕 Ｌ Ｉ Ｕ Ｙａ ｎ
（ 山东 省 环 境 保护 科 学 研 究 设计 院 ， 济南 ２ ５ ０ ０ １ ３ ） （ Ｓ ｈ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍ ｙ ｏ ｆ Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｊ ｉ ＇ ｎ ａ ｎ ２ ５ ０ ０ １ ３ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｌ ｉ ｃ ｙ ｃ ｏ ｌ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ．Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ Ｓ ｐ ｏ ｒ ｏ ｍａ ｅ ｕ ｌ ｕ ｍ ａ ｎ ｄ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ Ｈａ ｌ ｏ ｂ ａ ｃ ｌ ｉ ｌ ｕ ｓ ．Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ．ｗ ｅ ｕ ｓ ｅ ｈｅ ｔ ｔ ｌ ｌ ｒ ｅ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｆ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｔ ｄ ｅ ｒａ ｅ ｃ ｒ ｕ ｄ ｅ ｏ ｉ ｌ ｃ ｏ ｍｐ ｏ ｕ ｎ ｄ ｅ ｘ ｐ ｅ ｉ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ｓ ．Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｈ ｏ ｗ ｓ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｍｐ ｏ ｕ ｎ ｄ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉａ ｒ ｈ ａ ｓ ｍｕ ｃ ｈ ｂ ｅ ｔ ｔ ｅ ｒ ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｃ ｙ ｔ ｈ ａ ｎ ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ
摘要 ： 从３ ０个土样 中筛选 出 ３ 株 高效原油降解 菌株 ，它们为 Ｄ Ｃ Ｈ 一 １ ６ ， Ｄ Ｃ Ｈ一 １ ９ 和Ｄ Ｃ Ｈ 一 ２ ０ ， ７天后降油率分别为 ７ ５ ． ６ ％， ８ ０ － ３ ％
和７ ３ ． ２ ％。 经鉴 定， 分别是脂肪酸芽孢杆 菌属 Ａ ｌ ｉ ｃ ｙ ｃ ｏ ｌ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ， 芽孢肠状杆菌属 Ｓ ｐ ｏ ｒ ｏ ｍａ ｃ ｕ ｌ ｕ ｍ和盐芽孢杆 菌属 Ｈａ ｌ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ 。 将此 ３ 株
高效原油降解菌在 原油培 养基 中进行 复合 实验 ， 结果表 明， 在相 同条件下复合 菌降油效果优 于单 菌； 菌株 Ｄ Ｃ Ｈ一 １ ９与 Ｄ Ｃ Ｈ一 ２ Ｏ复合 的最佳原 油降解条件为： 接种量 比 １ ： ｌ （ 总接种量为 １ ０ ％） ， ｐ Ｈ值为 ７ ． ５ ， 底 物浓度 ２ ０ ｍｇ ・ ｍＬ ， 温度 ３ ５ ￣ Ｃ， 原 油降解 时间为 ７天 。将 实 验复 筛所得部分降油茵用于胜华炼厂废水处理 ， 效果 最好的是菌 Ｄ Ｃ Ｈ 一 １ ９和 Ｄ Ｃ Ｈ一 ２ ０的复合 ， 处理 两天后降油率达到 ８ ０ ． ２ ％。 表 明复
・
２ ９ ６・
价 值 工 程
降解石油复合微 生物菌剂 的筛选研 究
Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｃｏ ｍｐ ｌ ｅ ｘ Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ａ ｌ Ｉ ｎ ｏ ｃ ｕ ｌ ａ ｎ ｔ ｓ ｆ ｏ ｒ Ｐ ｅ ｔ ｒ ｏ ｌ ｅ ｕ ｍ Ｄｅ ｇ ｒ ａ ｄ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
合 菌株 Ｄ Ｃ Ｈ 一 １ ９ 和 Ｄ Ｃ Ｈ 一 ２ ０有很强的适应 能力。
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｗｅ ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｔ ｈ ｒ ｅ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｆ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｔ ｏ ｉ ｌ ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ｉ ｎ ｇ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ３ ０ ｓ ｏ ｉ ｌ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ， ｉ ． ｅ ． ｔ ｈ ｅ Ｄ ＣＨ一１ ６ 。 ＤＣ Ｈ－ １ ９ ａ ｎ ｄ ＤＣ Ｈ一 ２ ０ ．
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