石油降解菌的分离
原油降解菌YSL28的分离鉴定及降解特性研究
２ ０ １ ３ 年５ 月
东
北
农
业
大
学
学
பைடு நூலகம்报
４ ４ （ ５ ） ： ４ ７ － ５ ０
Ｍａ ｖ ． ２０ １ ３
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｎ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ａ ｓ ｔ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
原 油 降解 茵 Ｙ Ｓ Ｌ ２ ８ 的分 离鉴定及 降解特性研究
刘 明 ，孙
（１ ． 黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆
鹏 ，张祥胜
２ ２ ４ ０ ０ ２）
１ ６ ３ ３ １ ９ ；２ ． 盐城师范学院生命科学与技术学院，江苏 盐城
摘
要 ：取材 受原 油污染的土壤 中分 离得到一株石油降解 茵Ｙ Ｓ Ｌ ２ ８ ，对原油的降解率为 ４ ６ ． ９ ％。通过形 态、生
Ａｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏｉ Ｉ ｂ ｉ ｏ ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ， ＹＳ Ｌ ２ ８ ， ｗａ ｓ ｊ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｌ ０ ｍ ｔ ｈ ｅ ｃ ｒ ｕ ｄ ｅ ｏ ｉ ｌ ． ｃ ｏ ｎ ｔ ａ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｅ ｄ ｓ ｏ ｉ Ｉ
３ ０℃、原 油初 始 浓度 ５ ・ Ｌ ～ 、转速 １ ８ ０ ｒ ・ ａ ｒ ｉ ｎ ～ 。
关键词 ：原油降解茵 ；分 离；鉴 定 ；Ｒ ｈ ｏ ｄ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ Ｕ Ｓ ｓ ｐ ． ；１ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ
中图分类号 ：Ｘ１ ７ ２ 文献标志码 ：Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ５ — ９ ３ ６ ９ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ５ — ０ ０ ４ ７ — ０ ４
2株石油污染降解菌的分离与鉴定
石 油是 由各 种 烃 类组 成 的复 杂 混合 物 ， 含 有少
Ｆ ｉ ｅ ｌ ｄ ．Ｔ ｈ ｅ ｉ ｒ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ，ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ １ ６ Ｓ ｒ ＤＮ Ａ ａ ｎ ｄ ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ．Ｔ ｈ ｅ
Ｓ ＨＩ Ｘｉ ａ ｏ — ｆ ｅ ｎ ｇ，ＨＵＡＮＧ Ｌ ｅ ｉ
（Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆ Ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ａ ｎ ｄ Ｃ ｈ ｅ ｍ ｉ ｃ ａ ｌ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ， Ｔ ｉ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｔ ｉ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ３ ０ ０ ３ ８ ４ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
构、 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ序 列 分 析 及 生理 生化 特 征 进 行 了初 步 的 菌 种 分 类 鉴 定 ． 结果表 明菌株 Ｄ Ｑ 一 １属 于假 单 胞 菌 属 、 Ｔ ６ １ ９ ０属
于迪 茨氏菌属． 菌株 Ｔ ６ １ ９ ０可 以降解脂肪族烃类 ， ３ ｄ降解率达到 ４ ０ ． ７ ％； 而Ｄ Ｑ — ｌ可以降解芳香族 烃类 ， ３ ｄ降解率
达到 ８ ３ ． ０ ７ ％．
关键词 ： 石油 ； 石油降解菌 ； 分类鉴定 ；生物修复
中图 分 类 号 ： Ｘ ５ ３ 文献标识码 ： Ａ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ３ － ０ ９ ５ Ｘ ． ２ ０ １ ４ ． ０ １ ． ０ １ ３
石油烃降解菌Rhodococcus sp.15—3的分离鉴定及特性研究
（．ｐ ｎＫ ｙＬｂ ｒｔｙｏ ｃｏ ｉ ｏｉ ｌ ｎ ｉｅｒ ｇ ｆ ｇｉ ｌ ｒ ｎ ｉ ｎ ｅ ｔＭｉｉｒ ｇｉｕ ｕｅ Ｎ ｎｉｇ ｇｉｕ ｕａ Ｕ ｉ ｒ ｔ １ ｅ ｅ ａ ｏａ ｒ Ｍｉ ｂｏ ｇ ａ Ｅ ｇ ｅｉ ｒ ｕｔ ａ Ｅ ｖ ｏ ｍ ｎ， ｎｓ ｙ ｆ ｒ ｌ ｒ， ａｊ Ｔ ｌ ｒｌ ｎｖ ｓｙ Ｏ ｏ ｆ ｒ ｌ ｃ ｎ ｎ ｏ Ａ ｃ ｕｌ ｒ ｔ ｏＡ ｃ ｔ ｎ Ａ ｃｔ ｅ ｉ，
关键词 ： 红球菌 ； 分离鉴定 ； 石油生物降解
中图 分 类 号 ： ７ 文 献 标 识 码 ： Ｘ１２ Ａ 文 章 编 号 ：６２ ２ ４ （０ ８０ — ７ ７ ０ １７ — ０ ３２ ０ ）５ １ ３ — ５
ＴｈｅＩ ｏ ａｔｏ ａ ｓ ｌ ｉ ｎ ｎｄ Ｃｈａｒ ｃ ｅ ｉ ａ ｉ ｓｏ ｋａ ｓ Ｄｅ ｒ ｄｉ ｃ ｅ ｉ ａ ｔ ｒ ｚ ｔｏｎ ｆａＡｌ ｎｅ － ｇ ａ ｎｇＢａ ｔ ｒｕｍ Ｒｈｏ ｃ ｃ ｕｓｓ １ －３． ｄｏ ｏ ｃ ｐ ５
最适温度 、Ｈ值和盐浓度 （ ａ １分别 为 ３ ｐ Ｎ Ｃ） ０℃、．、 ％， ７０ ２ 在低温（０℃） 高盐 （ ５ Ｎ Ｃ） １ 及 ４ ％ ａ １环境下也有 良好 的降解 能力 。１— ％～ ５ ３菌株
可 以降解原油 中 Ｃ Ｃ 的正构烷烃 、 芳香烃及姥鲛烷 。在含 ５ｇＬ ・ 原油的培养基 中，０℃培养 ５ ３ ， ｄ后 菌株 １ — ５ ３对原油 的降解 率
ａｕ ｅ ｐ ａ ｄ Ｎ Ｃ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ ｆｒｄ ｇ ａ ｉｇ ｎ ｏ ｔ ｄ ｃ ｎ ｙ ｓｒ ｉ ５ ３ ｗ ｒ ０ ， Ｈ７ ０ ａ ｄ ２ Ｎａ １ ｅ ｐ ｃｉ ｅｙ Ｉ ｓ ｌ ｈ ｄｈ ｇ — ｔ ｒ ， Ｈ ｎ ａ １ ｎ ｅ ｔ ｉ ｅ ｒ ｄ ｎ — ｃ ａ ｅ ａ ｅｂ ｔａｎ １ － ｅ ｅ ３ ｐ ． ｎ ％ ｃ ａｏ ｏ Ｃ ｓ ｅ ｔ ｌ ．ｔ ｔ ｌ ａ ｉｈ ａ ｒ ｖ ｉ
石油降解菌的分离筛选及混合菌群的构建与优化
（ １ ．中国地质科学 院水文地质 环境 地质研究所 ，河北 石家庄 ２ ．中国地质科学 院地下水 污染机理与修复重点实验室 ， 河北 正定
泽 ’
０ ５ ０ ０ ６ １ ； ０ ５ ０ ８ ０ ３ ）
摘要 ：以河 南濮 阳油 田超重质原 油为研 究对 象 ，从 污染井场 土壤 中分 离并 筛选 出几株 高效 降解 细菌、酵母 茵和霉 菌。 由于不 同类型微 生物对碳 源的利 用 目标和方 式有 所不同，而将 ３类不 同类型 菌种进行排 列组合进行 降解 实验 ，最终优 选 出一组石 油降解优势 菌群 。该文还利 用正 交优化 法对 降解菌的最佳 添加 量进行 计算 ，结果显示 ，最佳接 种量 为 Ｘ ２ ５ ： １ ． ５ ％ ，Ｚ ３ ：１ ％ ，Ｘ１ ８ ：１ ％ ，Ｚ ２ ８ ：２ ％。利用该优化结果进行 降解 实验 ，石 油的 降解 率在 一定程 度上提 高 了。在 对濮
文献 标 识 码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ １ ． ３ ６ ４ ４（ ２ ０ １ ３ ） ０ ６ － ０ ０ １ ６ ０５ － 中 图分 类 号 ： Ｘ ５ ３
Ｓ ｔ ｕｄ ｙ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｉ ｓ ｏ ｌ ａｔ ｉ ｏ ｎ ａｎ ｄ Ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎｉ ｎｇ ｏ ｆ Ｏｉ ｌ Ｄｅ ｇ ｒ ａ ｄａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｏ ｒ ｇ ａ ｎｉ ｓ ｍ ａ ｎｄ ｔ ｈ ｅ Ｃｏ ｎｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｏｐ ｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈｅ Ｍｉ ｘ ｅ ｄ Ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎｓ ＮＩ ＮＧ Ｚｈ ｕ ｏ，ＬＩ Ｕ Ｙａ — ｃ ｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｓ ｈｅ ｎ ｇ，ＺＨＡＮＧ Ｃｕｉ － ｙ ｕ ｎ，ＨＥ Ｚｅ，ＹＩ Ｎ Ｍｉ — ｙ ｉ ｎｇ
石油降解菌株的筛选 鉴定及其石油降解特性的初步研究
（2）pH值对菌株降解效率的影响：在pH值为7.0时，菌株X的降解效率最高， 达到60%以上。当pH值偏离7.0时，其降解效率明显下降。
（3）盐度对菌株降解效率的影响：在低盐度条件下，菌株X的降解效率较高。 随着盐度的增加，其降解效率逐渐降低。当盐度超过5%时，其降解效率显著下降。
（4）产物分析：利用GC-MS等技术，我们对菌株X降解石油烃的产物进行了 分析。结果显示，菌株X能够将石油烃主要降解为脂肪酸、酚类化合物等中间产 物。这些中间产物在进一步降解过程中转化为二氧化碳和水，从而实现石油烃的 生物修复。
2、筛选流程：首先，采集油污土壤和石油废水样品，进行富集培养；其次， 通过初筛和复筛，获得具有较强石油降解能力的菌株；最后，通过形态学和分子 生物学鉴定，确定菌株种类。
3、鉴定步骤：将筛选得到的菌株进行16S rDNA分子鉴定，利用细菌分类学 软件进行比对分析，最终确定菌株的种属。
4、石油降解特性分析：采用液体培养法测定菌株的石油降解能力，通过测 定不同时间点石油烃类物质的含量，计算菌株的降解速率和降解效率。
1、菌株筛选
从石油烃污染地区采集土壤样品，采用富集培养法，经过多步筛选，获得具 同温度、pH值、盐度等条件下，对菌株降解石油烃的能力进行测定。通 过改变环境因素，观察其对菌株降解效率的影响。同时，利用气相色谱-质谱联 用（GC-MS）等技术，对菌株降解的产物进行分析。
参考内容
一、引言
石油烃是石油和天然气的主要成分，它们在自然环境中的存在和降解对全球 碳循环和环境生态有着重要影响。厌氧降解菌在石油烃的降解过程中扮演着关键 角色。本次演示旨在筛选出具有高效石油烃厌氧降解能力的菌株，并对其降解特 性进行研究，以期为石油烃污染的生物修复提供理论依据。
二、材料与方法
石油降解菌的分离鉴定及降解能力初步研究
有两株 ， 定 名为 Ｙ Ｊ ０ ０ ３和 Ｙ Ｊ ０ ０ ４ ； 对Ｙ Ｊ ０ ０ ３和 Ｙ Ｊ ０ ０ ４进行 降解条件优 化 ， 其 适宜生长条 件为 ： 温度 ３ ３ ｏ Ｃ， ｐ Ｈ ７ ． ２ ， 原油投 加量为 ９ ｏ Ｌ 。根据形态学观察、 生理 生化指标测定 ， Ｙ Ｊ ０ ０ ３为假单胞菌 属， Ｙ Ｊ ０ ０ ４为邻单胞菌属。
研究生 ， 常州 大学环境与安全工程学 院副教授 ， 研究 方 向： 工业废 水 的处理与回用 。
２ 结果与分析
２ ． １ 菌种 富 集分离 结果
’ 通信作者简介 ： 刘杨丹（ １ ９ ８ ５ 一） ， 女， 江苏连云港人 ， 常州大学环境
与安全工程学 院硕士研究生 ， 研究方向 ： 工业废 水的处理与 回用 。
ｇ 、Ｍｇ ＳＯ４ ．Ｈ２ ０ １ ｇ、Ｃａ Ｃ１ ２ ０． ２ ｇ、ＮＨ４ Ｃ１ ２ ｇ、Ｍｎ—
三角瓶 中加入 １ ０ ０ ｍ Ｌ降解培养液 、 ０ ． ２ ｍ Ｌ灭
菌 原油 及 ３ ｍ Ｌ新 鲜菌 悬液 （ 菌数约为 １ ０ ９ ｃ ｅ ｌ ｌ ／ Ｌ ） ，
２ ０ １ ２年 １ １月 １ ２日收到
将菌株接种到 Ｌ Ｂ平板上 ， ３ ２℃培养 ， 观察菌落
石油降解菌的分离与鉴定
状， 经过分 离、 筛选、 复筛 ， 从大港油 田的石油 污染土壤 中富集分 离、 选 出 ２株石 油降解 菌， 优 并进 一步研 究了 ２株 菌 的生理生化特性． 菌株鉴 定结果表明 ， 菌株 Ｄ — Ｂ ｌ属于假 单胞杆菌属 ， 菌株 Ｄ Ｆ一１ 于曲霉 菌属 ． 属 关键词 ： 石油 ；石油污染土壤 ； 石油 降解 菌 ； 分离鉴 中图分类号 ： ５ Ｘ３ 文献标识码 ： Ａ ｄ ｉ１ ．９ ９ｊｉ ｎ １７ －９ Ｘ．０ １ ０ ．２ ｏ ：０３ ６ ／．ｓ ．６ ３ ０５ ２ １ ．４ ０ １ ｓ
Ｋｅ ｒ ｓ ｅ ｒ ｌｕ ；ｐ ｔｏｅ ｍ— ｏｌ ｔ ｄ ｓ ｉ；ｐ ｔ ｌ ｕ ｄ ｇ ａ ａｉｎ ｓｒ ｉ ｓ ｓ ｌｔｏ ｎ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｙ ｗｏ ｄ ：ｐ ｔｏｅ ｍ ｅｒ ｌｕ ｐ ｌ ｅ ｏ ｌ ｅ ｒ ｅ ｍ— ｅ ｒｄ ｔ ｔ ｎ ；ｉ ａｉｎ ａ ｄ ｉ ｅ ｔ ｉａ ｉ ｕ ｏ ｏ ａ ｏ ｆ ｏ
耐盐 性实 验 培 养 基 ： 白胨 ２ ｇ 蒸 馏 水 １０ ０ 蛋 ， ０
各三支， 一支作为空 白对照 ， 其他 两支分别接人两株
供 试菌 ， 同对 照试 管均 放 于 ３ 连 ７℃ 恒温箱 中培养 ２ ４
ｈ 观察 试 管 内培养 液 的混浊程 度 ． ， ２ 生长 曲线 的绘 制 ： ） 采用 比浊 法 ．
基 ，ｂ 为加 入 菌 株 在摇 床 中培 养 ４天 后 的 培养 基 ， （） （） Ｃ 为加 入菌株 并 在摇 床 中培养 ７天 后 的培 养 基 ． 通
过 观察 不难 发 现 ， （ ） （ ） 培 养 基 逐 渐 浑 浊 ， 从 ａ到 Ｃ ， 并
液转入新鲜 的牛 肉膏蛋 白胨液体培养基 中， 在上 述
℃ 、６ ｍｉ 条件 下 培养 １ ． １０ｒ・ ｎ ０ｄ 培养 液 明显 浑浊 ，
石油污染土壤中降解菌的分离鉴定及降解基因筛选
石油污染土壤中降解菌的分离鉴定及降解基因筛选秦薇;梁玉婷;刘勇俊;刘雨佳;赵远【摘要】为了得到高效的石油降解菌,以原油为唯一碳源配制培养基,从金南油田油污染土壤中选取4处样品富集培养,纯化出14株细菌,8株放线菌,9株真菌;通过生理生化反应以及16S rDNA鉴定,确定了C-1和H-1菌株均为芽孢杆菌属；通过降解性能实验和优化实验,初步绘制了C-1和H-1的生长曲线并确定了最佳生长条件和降解率；经查询相关文献,设计了6对降解基因引物,应用PCR的方法对所筛选出的降解菌进行基因克隆,确定C-1与H-1菌中含有可降解芳香族化合物的谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)的基因.%In order to get high degradation of oil bacteria, this study used oil as the only carbon source, chose samples from four places in the soil polluted by oil of Jinna oil field and purified the 14 strains of bacteria, 8 strains of actinomyces, and 9 strains of fungi. Through the physiological and biochemical reaction and identification of 16S rDNA, the C— 1 and H—1 strains were determined to belong to the genus bacillus. After degrading performance and optimization experiments, C—1 and H —1 growth curves were drawn and the best growth conditions and degradation rate were identified. Based on the design of 6 pairs of primers of degradation genes and the PCR method for cloning genes after referring to the relevant references, C—1 and H —1 bacteria were found out to contain genes of glutathione S—shift enzyme (GSTs) that can degrade biodegradable aromatic compounds.【期刊名称】《常州大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(024)004【总页数】7页(P1-7)【关键词】石油烃降解菌;分离鉴定;生物降解;基因【作者】秦薇;梁玉婷;刘勇俊;刘雨佳;赵远【作者单位】常州大学环境与安全工程学院,江苏常州213164;常州大学环境与安全工程学院,江苏常州213164;常州大学环境与安全工程学院,江苏常州213164;常州大学环境与安全工程学院,江苏常州213164;常州大学环境与安全工程学院,江苏常州213164【正文语种】中文【中图分类】X172石油是现代社会的重要能源，被称作工业的血液、黑色的金子[1]。
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从环境样品中分离筛选石油
降解菌的方案
引言
随着经济技术的迅速发展，石油日渐成为我过的主要能源，且需求量日益增大。
研究表明，石油生产和运输环节会对土壤造成严重污染，且污染面积不断扩大。
目前，我国石油行业每年产生的含油污泥多大八十万吨。
由于石油的粘度大、粘滞性强，会再短时间内形成小范围的高浓度污染，长期的石油污染还会影响土壤的通透性，减少土壤肥力，阻碍植物生长。
同时，石油中所含的多环芳香烃具有“三致”效应，一些挥发组分能引起人体麻醉、窒息和化学性肺炎等疾病。
因此，石油污染对土壤生态系统的平衡和人体健康都有很大的危害。
目前，针对石油污染治理的方法主要包括：物理方法、化学方法以及生物修复法，但物理方法修复费用较高，耗材较多：化学方法会使用大量化学淋洗剂，很容易造成二次污染。
相较而言，微生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染等特点而被视为一项最具有应用前景的修复技术。
而且随着分子生物学的发展，无论是DNA文库的建立，还是多态性分析方法的进步，都为污染物的生物修复提供了全新的技术支持。
既然生物修复法有诸多优点，那么就应该充分发挥其特性。
本文则是着眼于环境样品，分离筛选其中的石油降解菌，以扩大培养进行更大规模的石油降解。
摘要
在长期被石油污染的土壤中，微生物可逐渐改变自身的代谢条件以适应环境。
即以石油烃为碳源进行生长、繁殖，同时将石油烃降解。
因此在这种土壤中存在着可降解石油烃的微生物，但石油烃降解菌的筛选、分离是生物法处理石油污染的关键。
从这个角度考虑，以长期石油污染的土壤中微生物为菌源，从中筛选、分离出高效的石油烃降解菌。
要降解哪里的石油就用哪里的土壤培养石油降解菌。
目前，国内对极端条件下石油降解微生物研究较少，尤其是对低温、耐盐的石油降解菌，中国北方的大部分湿地，盐碱程度比较高，成年气温较低。
无论是来源于海上还是来源于石油化工的污染都比较严重。
本文针对大连开发区因石油泄露而被污染的白石湾，就地选取材料进行石油降解菌的筛选以及分离研究。
一、技术路线
生物修复是指利用生物的代谢活动催化降解偶记污染物，从而去除或消除环境污染的一个受控或自动进行的过程。
它利用处理系统中的生物，主要是微生物的代谢活动来减少污染现场污染物的浓度或使其他无害化的过程污染物的生物修复作用，本质上是开发利用微生物的新陈代谢能力以及基因的多样性，把污染物转化为无污染的中产物，重新进入生物地球化学循环。
1、菌种的初筛
将一定量的样品置于锥形瓶中,加入生理盐水,稀释适宜倍数后,分别在PDA培养基以及牛肉膏蛋白胨培养基上进行涂布,待表层液体被培养基吸收后,倒置,放于30℃恒温培养箱中培养。
2、菌种的富集
将平板上长势良好的20株菌接种到盛有十六烷富集培养基的锥形瓶中,加以标记,分别命名为LZX21～LZX210 (蛋白胨培养基)和LZZ21～LZZ210( PDA培养基) 。
30℃下恒温振荡培养。
3、菌种的驯化
菌种的驯化过程采用原油液体培养基中原油浓度逐渐升高的方法，取上述富集培养中长势较好的14株菌,依次接种至不同质量浓度的原油液体培养基中,于30℃下恒温振荡培养,以3 天为一个周期,进行4个周期的驯化。
驯化后进行标号。
后将其分别编号为ODZ21～ODZ27,ODX21～ODX27。
4、菌种的复筛
优势降解菌种的复筛采用观察石油降解圈的方法。
将菌种点接到一定质量浓度的原油平板培养基中,放置到恒温箱中培养。
培养一段时间后,根椐每个菌落产生的石油降解圈的大小,挑选优良菌种
二、样品采集
取大连开发区白石湾的海水样品进行分离和筛选
三、培养基成分
人工海水培养基（MMC）：Nacl 24g/L; MgSO4•7H2O7g/L;NH4NO3 1g/L;KCl0.7g/L;KH2PO4 20g/L;Na2HPO4 3.0g/L; PH7.4.
灭菌后补加适量微量元素混合液，并补以柴油作为唯一碳源。
柴油及微量元素经0.22μm滤膜过滤除菌。
高盐LB培养基(HLB)：Nacl30 g/L;胰蛋白胨10g/L;酵母提取物5g/L; PH7.0.
微量元素混合液:CaCl0.02mg/L;FeCl56H2O0.5mg/L;CuSO40.005
mg/L;MnCl2·4H2O0.005mg/L;ZnSO4·7H2O0.1 mg/L
四、培养条件
1、温度：石油烃类微生物降解可在很大的温度范围内发生，在0~70℃的环境中均发现有降解石油烃类的微生物。
大多数微生物在常温下较容易降解石油烃类，且由于某些对微生物有毒害的低分子量石油烃类在低温下难挥发，会对石油烃类的降解有一定的抑制作用，所以低温下石油烃类较难降解。
将降解培养基的初始pH调整到7. 5, 4株菌接种到50ml含油(原油质量浓度为500mg/L)无机盐培养基中,分别在25℃、30℃、35℃、40℃、50℃的恒温摇床上进行振荡培养,培养7 d后,测定原油的降解率,以确定菌株降解原油的最适温度。
2、氧气：大多数石油烃类是在好氧条件下被降解的，因为许多烃类的降解需要加氧酶和分子酶。
但也有一些降解菌能在厌氧条件下降解石油烃。
3、营养盐：氮源和碳源经常成为微生物降解烃类的限制因子。
在天然水体中，为了促进石油烃类的降解而添加水溶性的氮源和碳源也受到限制，因为有限添加的氮源和磷源在水体中被高倍稀释而难以支持微生物的生长。
目前微生物固定化技术逐渐得到应用，成为解决寡营养盐的重要方法。
4、PH:石油烃类的微生物降解一般处于中性PH值，极端的PH值环境不利于微生物的生长。
它的效率和质量还取决于石油烃类化合物存在的数量、种类及状态。
用浓度为0. 1mol/L的HCl或浓度为0. 1mol/L的NaOH 将无机盐培养基的pH值调整到5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和9. 0,灭菌后分别接种降解菌,于30℃、200 r /min摇床上恒温培养, 7 d后测定降解体系中的原油降解率,以确定菌株降解原油的最适pH值。
五、检测方法
将复筛得到的菌种接种到含原油(质量浓度为85mg/L)的无机盐培养基中, 30℃、200 r /min摇床培养,利用紫外分光光度计测量残余油吸光度值,通过标准曲线换算出残余油的质量浓度,计算出降解率。
六、参考文献
[ 1 ]张博,吴雁.原油降解菌的筛选分离及其降解性能研究.2007.11(29) - 0102 – 02
[ 2 ] 赵瑞雪,刘淑梅,郑笑秋.石油烃类的微生物降解.2006.29. 4 [ 3 ]李丽,张丽萍,张元亮.石油烃类化合物降解菌的研究概况.(2001)0520089204
[ 4 ] 白洁，张竹圆，周方.石油烃降解微生物的研究进展.中国海洋大学.266100
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