真菌漆酶异源表达研究进展

表达载体
Tram etes sanguinea[1 ]
Tram etes versicolor[19 ]
M elanocarpus albom yces[11 ] M. therm ophila[20 ]
W30321A INVSC1 和 PK113217 A
INVSC1
BJ5465
Pleurotus ostreatus[21] W30321A
11214 菌株型号 宿主菌的表型和生理特性也影响 漆酶的表达 。关于这方面的研究 ,以 P. pastoris的报道 较为全面 。已报道用于漆酶表达的 P. pastoris菌株有 X233、GS115、KM71和 SMD1168。这 4种菌株在基因型 上有 差 异 。从 已 有 的 报 道 来 看 , 一 般 采 用 GS115 (Mut+ ) 作 为 漆 酶 表 达 宿 主 都 能 得 到 可 观 的 表 达 量 [23, 24, 27, 28 ] ,但有些情况下利用蛋白酶缺陷型菌株如 SMD1168表达漆酶却能获得更高的表达量 [24 ] ,说明蛋 白酶活性对漆酶的表达有重要的影响意义 ,缺少内源 蛋白酶的菌株可以减少漆酶被降解的风险 ,尤其是在 高密度发酵时 [ 14 ] 。 11215 发酵条件 发酵条件是影响酵母表达重组漆 酶的最重要因素 。首先是发酵方式 。采用发酵罐发酵 获得的漆酶酶活是摇瓶发酵的好几倍 。 Hong等 [29 ]用 P. pastoris表达来自 T. versicolor的漆酶基因 lcc1 时 ,通 过发酵罐发酵得到的漆酶酶活是摇瓶培养的 8 倍 。发 酵罐培养比摇瓶培养得到更高漆酶酶活的原因可能是 发酵罐培养在控制相关发酵参数如温度 、pH 值和溶氧 量等方面比摇瓶培养更容易和有效 ,酵母也因此能够 获得更好的生长条件 ,从而产生更多的漆酶蛋白 [30 ] 。 其次 ,是温度 。相关的研究表明 ,降低培养温度能 提高漆酶的表达量 。 P. pastoris 表达来自 T. versicolor 的漆酶基因 lcc1时 ,培养温度从 30℃降到 28℃后 ,发酵 液的漆 酶 酶 活 提 高 了 约 4 倍 [29 ] 。类 似 地 在 表 达 P. ostrea tus的漆酶基因 lccPo1时 , 培养温度为 20℃时所产 酶活比 25℃时高 2～6 倍 [8 ] 。对于 S. cerevisia[19 ]和 K. lactis[31 ]都有相似的研究结果 。关于温度对漆酶酶活的 影响机理可能是 ( 1 )发酵液中的漆酶在高温条件下不 稳定 ,酶活性易降低 ; ( 2 )高温条件提高了内源性蛋白 酶活性 ,加快了漆酶的水解 ; ( 3)与高温培养相比 ,降低
表达量 表达基因 培养方式 发酵天数 / d
U /L mg/L
lccl 平板培养
—b)
——
lcc1 摇瓶培养
—
——
lcc2
酶分子量 / kDa — 64
lac1 摇瓶培养
3
168 3
95
— 摇瓶培养
—
300 18
110
POXA1b 摇瓶培养 POXC
—
200 —
—
lcc2 发酵罐
—
0. 66 —
—
Note: a) : native signal pep tide of laccase; b) : no detailed data; c) : α2mating factor signal pep tide
得更高的漆酶酶活 ,这可能与表达的漆酶性质有关 ,但
除了温度 , pH 值也是一个重要的影响因素 。把发 可以肯定的是 ,过高的甲醇浓度不利于漆酶表达 。
酵液的 pH 值稳定在 5～6之间 ,有利于提高 P. pastoris 最后一个值得注意的因素是铜离子的浓度 。铜离
产漆酶能力 。O ′Callaghan等 [13 ]在培养基中加入 0. 8% 子位于漆酶 的 活 性部 位 , 对 漆 酶 活 性 的 发 挥 至 关 重
作 [14 ] ; ( 2)能够对重组蛋白进行翻译后的加工修饰和 分泌表达 ; ( 3)具备完善的发酵方法 ,可进行高密度发 酵 ; ( 4)重组蛋白表达量高 [15 ] ; ( 5 )自身不含有病原体 、 病毒包涵体和热源质 [16 ] ,满足安全需要等优点 ,已成为 生产重组蛋白的重要工具 。目前 ,酵母也成为重组漆 酶的主要表达宿主 ,多种漆酶基因已成功地在酿酒酵 母 ( S. cerevisiae) (表 1) 、毕赤巴斯德酵母 ( P. pastoris) (表 2) 、甲醇毕赤酵母 ( P. m ethanolica) 、乳酸克鲁维酵 母 ( K. lactis) 和解脂耶氏酵母 ( Y. lipoly tica ) (表 3 ) 中 进行了表达 , 其中以在 P. pastoris中的表达量最高 ,达 8. 3 ×104 U /L[17 ] (本文所述酶活数值 , 如无特殊说明 , 都是以 ABTS为底物测定的酶活值 ,一个酶活单位定义 为每分钟氧化 1μmol底物所需要的酶量 ) 。 1. 1 产漆酶转化子筛选 漆酶基 因 转 化酵 母 后 , 可 通 过 含 有 愈 创 木 酚 或 ABTS的平板培养基筛选转化子 。产漆酶转化子周边 会出现微红棕色 [1 ] (愈创木酚 ) 或绿色 [11 ] (AB TS) 圈 。 一般挑选能形成最大有色圈的转化子进行漆酶发酵研 究 ,因为一般认为形成的有色圈越大 ,转化子产漆酶能 力越强 [ 18 ] 。
1. 2 影响漆酶在酵母中表达的因素 影响外源漆酶基因在酵母中表达的因素主要包括 启动子 、信号肽 、漆酶基因 、表达菌株型号和发酵条件 。 11211 启动子 酵母可以使用组成型或诱导型启动 子启动漆酶基因的表达 。有报道表明在表达漆酶时采 用诱导型 启 动 子 比 组 成 型 启 动 子 能 获 得 更 高 的 表 达 量 [ 11, 21 ] 。诱导型启动子可以控制漆酶基因的表达时 间 ,例如在 P. pastoris中常采用的 AOX1 启动子 , 它可 以在有无 甲 醇 的 条 件 下 精 确 控 制 基 因 的 表 达 或 不 表 达 ,从而避免漆酶可能对 P. pastoris生长过程产生的不 利影响 ,特别适合高密度发酵时进行漆酶诱导表达 ,从 而可以最大限度地提高漆酶产量 [23 ] 。 11212 漆酶基因 漆酶结构基因中编码漆酶多肽的 C 端界点序列 ( C2term inal extension)影响漆酶酶活 ,但学 者对此看法不一 。Bulter等 [20 ]认为 C 端界点序列对提 高漆酶活性非常重要 ,认为该序列对抑制漆酶翻译后 的活性是必需的 。而 Kiiskinen 等 [11 ]却认为 C 端界点 序列使漆酶更易被降解 。目前 ,关于 C 端界点序列对 重组漆酶表达活性的影响仍有待深入研究 。 11213 信号肽 为了便于漆酶的纯化 、降低被内源性 蛋白酶降解的风险和对酵母生长的影响 ,常采取胞外 表达的策略 ,选用的信号肽为酿酒酵母的 α因子信号 肽或漆酶基因上的本地信号肽 。对于 S. cerevisiae,采 用 α因子信号肽一般比漆酶本地信号肽得到更好的表 达 效 果 [ 11 ] , 然 而 对 于 P. pastoris[7, 18, 24 ] 和 Y. lipoly tica[25 ]情况则相反 。但也有例外的情况 , O tterbein 等 [26 ]采用本地信号肽和 α因子信号肽进行 P leu rotus safor2ca ju 的漆酶表达 , 两者表达量却没有明显差别 。 由此可见利用酵母表达漆酶时 ,最合适信号肽的选择 不能预测 。
1 漆酶在酵母中的表达
酵母表达系统因具有 : ( 1 ) 易于进行分子遗传操
收稿日期 :ห้องสมุดไป่ตู้2008209202 修回日期 : 2008211209 3 国家自然科学基金 (30671457)资助项目 33 通讯作者 ,电子信箱 : linjf@ scau. edu. cn, junfanglin2003 @ yahoo. com. cn
Tram etes. versicolor[22] INVSC1
CEN.
pRCUP2
pAJ401
—
pJRoC30 pAC1 pSAL4 pAJ401 / lcc2 / SSO2
启动子
CU P I
PGK
PGK1 GAL1
— ADH1 CU P1
PGK1
信号肽
nSpa) nSp
nSp nSp nSp α2Mfc) nSp
2009, 29 (6)
刘志明 等 : 真菌漆酶异源表达研究进展
137
培养温度能使细胞生长速度降低 ,从而蛋白质合成的 出大量的蛋白酶和其它有害物质 ,对漆酶的稳定性造
速度也随之下降 ,细胞合成的漆酶肽链有更充足的时 成不利的影响 。然而 ,张银波等 [8 ]以 1%甲醇添加量获
间进行正确的折叠 [32 ] 。
的 L 2丙氨酸 ,使 pH 值稳定在 5～6之间 ,漆酶活性明显 要 [33 ] 。铜离子的作用不在于提高细胞合成漆酶的速
比其它 pH 条件下高 2 ～3 倍 。如果不控制 pH 值 , pH 度 ,而 是 漆 酶 活 性 发 挥 需 要 铜 离 子 的 存 在 。在 O ’ 值会逐步下降 ,如果 pH 值太低 ,将不利于漆酶的表达 。 Callaghan等 [13 ]的研究中 ,在培养基中添加 0. 2mmol/L
中国生物工程杂志 China B iotechnology, 2009, 29 (6) : 135～142
真菌漆酶异源表达研究进展 3
刘志明 1 郭丽琼 1, 2 林俊芳 1, 233
(1 华南农业大学食品学院生物工程系 广州 510642 2 华南农业大学生物质能研究所 广州 510642)
摘要 由于漆酶能够氧化芳香类化合物和其它一些非芳香类有机物 ,具有广泛的底物特异性 ,因 此在纸浆漂白 、纺织品染料脱色 、有毒废弃物的去除 、生物修复和生物传感器等方面具有巨大的 应用潜力 。但是缺少大量廉价的酶源供应阻碍了漆酶商业化的应用 ,解决这个问题的一个主要 方法就是通过漆酶的异源表达来获得大量的漆酶 。综述了真菌漆酶在酵母表达系统和丝状真菌 表达系统中表达的研究结果 ,着重总结了影响漆酶异源表达的因素和提高漆酶表达的策略 。 关键词 真菌漆酶 异源表达 酵母 霉菌 中图分类号 Q819