色谱学分析基础
第十二章色谱分析基础
1. 气相色谱分离过程ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
当试样由载气携带进入色谱
柱与固定相接触时，被固定相
溶解或吸附;
随着载气的不断通入，被溶
解或吸附的组分又从固定相中
挥发或脱附;
挥发或脱附下的组分随着载
气向前移动时又再次被固定相
溶解或吸附;
随着载气的流动，溶解、挥
发，或吸附、脱附的过程反复
地进行。
（2） 灵敏度高 可以检测出μ g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。
（3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。
（4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。
不足之处： 被分离组分的定性较为困难。
2020/1/31
5. 分配比与保留时间的关系
滞留因子（retardation
factor）：
RS
uS u
us：组分在分离柱内的线速度；u：流动相在分离柱内的线
速度；滞留因子RS也可以用质量分数ω表示：
RS
ms ms mM
1 1 ms
1 1 k
mM
若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分
2020/1/31
二、色谱分离过程
色谱分离过程是在色谱柱内完成的。 填充柱色谱: 气固(液固)色谱和气液(液液)色谱，两者的 分离机理不同。 气固(液固)色谱的固定相: 多孔性的固体吸附剂颗粒。 固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。 气液(液液)色谱的固定相: 由 担体和固定液所组成。 固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。 气固色谱的分离机理: 吸附与脱附的不断重复过程； 气液色谱的分离机理： 气液(液液)两相间的反复多次分配过程。
色谱理论基础
无关。k值大小可直接从色谱图上测量。有关计算式如下：
k tr t0 Vr V0
t0
V0
恒流速 t0 的测定
基本保留方程 分离因子
tr = t0 (1＋k) Vr = F tr
Vr V0 (1 k) V0 KVs
t r2 K2 k2
t r1 K1 k1
色谱分离的特征之一是组分在色谱柱上有不同程度上 的滞留。由于色谱固定相面积很大、液膜很薄, 组分通 过色谱柱时, 它们在两相间的分配被认为是达到平衡的。 优先分配在固定相的组分在柱上的保留时间最长, 而分 配系数小的组分保留时间短。换句话说，溶质的保留行 为是其平衡分配性质的函数。组分之间平衡分配性质的 差异给色谱分离提供了可能性。
G为负值, 则柱温与分配系数成反比。一般温度上升,
K值下降, 这导致组分移动速度增加, 保留值下降。
对任何色谱过程, 分配系数对温度的变化率为：
d ln K H
dTc RTc
在气相色谱中, 组分从气相转移到液相, 其H值大,
常用控制柱温来调节分离；而在液相色谱中, 组分从
液相转移另一液相（固定相）, 其H值要小得多。所
以液相色谱对温度变化不太敏感, 一般在室温下操作。
对于气相色谱分析, 柱温上升20℃，K下降一半，
低温有利于分离，高温有利于分析速度。 同样，柱温的稳定性严重影响GC的保留值，商品
仪器的柱温控制精度为±0.2℃。
问题：在色谱分析中，温度除了对分离结果 有影响外，还有其它影响吗？
补充材料
GC中的温度控制
中, uX = u，即X谱带的迁移速度与流动相分子通过色 谱柱的速度一样。
第二章色谱基础理论(本)
基础理论
46
基础理论
47
范氏方程说明：
▪ u一定时，A，B，C越小，H越小，柱效越
高，色谱峰越窄；颗粒越小，H越小，柱 效越高。
▪ U很小时，B/U项占主导，CU项可忽略 ▪ U很大时，CU项占主导，B/U项可忽略
基础理论
48
综合考虑: U实际稍高于Uopt 因为: 1.右侧曲线斜率小,U稍变化不会引起
拖尾因子（fs） x = h/20
fs =（B+A）/2A
fs = 0.95-1.05 正常峰
fs <0.95
前延峰
fs >1.05
拖尾峰
即使不进样也会出现的峰
20% - 100% MeOH
60
没有进样
15
30
问题:流动相脏
15
0
3
7
15
17
基础理论
13
二、定 性 参 数
W
(t tR )2
e 2 2
V 2
---呈正态分布 t=tR时，C=Cmax
基础理论
31
Cmax的影响因素：
进样量W愈大,则Cmax愈大，W与Cmax 成正比。 色谱柱内径愈小，填充愈紧密，Cmax/W比值愈
大。即柱愈细填充愈紧密，柱效N越高。 色谱柱愈短，Cmax值愈大。 先出柱的组分k’小，所以Cmax/W大。提高柱温 （GC），增加强洗脱剂的浓度（HPLC），可使
总结
●热力学：保留值的差 别要足够大 Sig
●动力学：色谱峰要
足够窄
Sig
基础理论
time time time 51
第四节 分子间作用力
基础理论
52
一、定向力
色谱基础
图4－7 某组分的色谱图
12
（1）色谱术语 ：保留时间、调整保留时间、 保留体积、调整保留体积
• 保留时间（retention time）:从进样到组分峰顶点之间测得的时 间，用tR表示。 • 调整保留时间（adjusted retention time）：组分的保留时间扣除 死时间后的时间。 • 保留体积（retention volume）：从进样开始到监测器中样品浓 度最大时，流动相流经色谱柱的体积。 • 调整保留体积（adjusted retention volume）:保留体积扣除死体 积后的体积。
即相对保留因子可以用来表示固定相的选择性，因 此也称为选择性系数（用α表示） ，可以用来衡量固
定相是否选择合适。
15
（1）色谱术语 ：相对保留因子(也称选择性系数)
采用相对保留因子可以消除一些仪器操作条件的 影响。只要柱温，固定相和流动相的性质保持不 变，即使柱长、柱径、填充情况及流动相的流速 有所变化，由于相对保留值在较短的时间间隔内 进行测定，实验条件队保留值的影响在分子、分 母中都存在，其比值仍基本保持不变，因此她是 气相色谱中广泛使用的定性数据。
色谱理论研究物质在色谱过程中的运动规律，如解释色谱流 出曲线的形状，色谱峰变宽的机理，从而为色谱分离条件的 选择提供理论指导。
基本 理论
塔板理论 速率理论
分离度
A、B两组分分离所要满足的条件： 1.两组分的分配系数有差异 2.区域扩宽的速率小于区域分离的速率 3.有足够长的色谱柱
19
§4-2
色谱理论简介
色谱 图
图4－4 某组分的色谱图
10
（1）色谱术语：基线与基线漂移
• 基线：在色谱操作条件下，仅有流动相通过监测器时，由 记录仪得到的信号－时间曲线。 • 基线漂移：基线随时间定向缓慢地变化。
色谱分析的基本原理
相对保留值 r2,1 或
指某组分 2 的调整保留值与另一组分 1 的调整保留值之比：
r2,1
t, R(2)
t, R (1)
VR, (2) V,
R (1)
r2,1
t R(2) t R(1)
r2,1 r2,1ttR,R,((12))ttR,R,((12VV)) RR,,((12VV)) RR,,((12))
h
Y1/2
h1/2
0.607
h
Y
图 11-2 色谱流出曲线图 标准偏差
即 0.607 倍峰高处色谱峰宽度的一半 半峰宽度 Y1/2 又称半宽度或区域宽度，即二分之一峰高处对应的峰宽度，它与标
准偏差的关系为
Y1 2 2 ln 2 2
峰底宽度 Y
自色谱峰侧的转折点所作切线在基线上的截距，如图 2-3 所
t
检
R
测
信
tM
号
时间 t
1. 基线 当色谱柱没有组分进入检测器时，在实验操作条件下，反映
检测器系统噪声随时间变化的线称为基线。稳定的基线是一条直线。 如图中的 ot 所示的线。
色谱基础知识
色谱的优点
★ 分离效率高 ★ 分析速度快 ★ 应用范围广 ★ 样品用量少 ★ 灵敏度高 ★ 分离和测定同步完成 ★ 易于自动化，可在工业流程中使用
高分子多孔微球：新型的有机合成固定相（苯乙烯/二乙烯苯共聚）。 适用于水、气体及低级醇的分析。
②气液色谱：溶质在固定相和流动相中进行分配，通过分子间作用力
（色散力、静电力、诱导力、氢键）的差异实现分离。
固定相=载体+固定液
对载体的要求：√具有化学惰性
√具有热稳定性
√具有一定的机械强度 √具有适当的比表面
ECD1A, ECD1A, 前部信号(HP5-ECD\STD-50PPB.D)
归一化 325
相交的两点之间的距离，W=1.698644× W ECD1A,ECD1A,前部信号(HP5-ECD\STD-50PPB.D)
300
1/2
归一化
275
800 700
250
600
225
500
200
W1/2
h
400 300
色谱的发展历程
1931年，Kuhn和Lederer重复了Tswett的实验，用氧化铝和碳 酸钙做固定相分离出了3中胡萝卜素（α、β、γ），此后用这种方法 分离了60多种这类色素。
1940年，Martin和Synge提出液液分配色谱法。 1941年， Martin和Synge提出用气体代替液体做流动相的可能。 此后的11年内，James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气 液色谱方法，因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。 1956年，Van Deemter提出速率理论。1965年Giddings对其进 行了总结和发展。 1957年，Golay开创了毛细管柱气相色谱法。
3--第二章色谱分析理论基础
当待分离组分随着载气进入色谱柱，组分就开始在两相间进行 分配，平衡后，再随着载气进入下一个塔板进行分配，平衡后 再进入下一个塔板。以此类推，从而不断达到分配平衡。
1.塔板理论基本假设
（1）在色谱柱中的每一小段长度H内，组分迅速达到分 配平衡，这一小段色谱柱称为理论塔板，其长度称为理论 塔板高度，简称板高，记为H； （2）载气不是连续通过色谱柱，而是脉冲式，每次进气 量为一个板体积； （3）试样开始时都加在0号塔板上，且试样沿柱纵向扩 散忽略不计； （4）分配系数在各塔板上是常数； （5）塔板与塔板之间不连续。
结论： 分配系数K是色谱分离中的一个重要参数。 两组分分配系数K相差越大，两峰分离的就越好。 不同物质的分配系数K相同时，组分不能分离。因此是色 谱分离依据。
3.分配比k
又叫容量比、容量因子。
在一定温度、压力下，在两相间达到分配平衡时，组分在 两相之间的质量比值，以k表示。
组分在固定相中的质量
k＝
分子扩散大。
3.传质阻力项C
组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻 力C包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL 。液相传质阻力 大于气相传质阻力。
C =（Cg + CL）
气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。
这一过程中试样组分将在两相间进 行质量交换，即进行浓度分配。有 的分子还来不及进入两相界面，就 被气相带走；有的则在进入两相界 面后又来不及返回气相。这样，使 得试样在两相界面上不能瞬间达到 分配平衡，引起滞后现象，从而使 色谱峰变宽。
（3）对于某确定的色谱分配体系，组分的分离最终决定于 组分在每相中的相对量，而不是决定于组分在每相中的相对 浓度，因此分配比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数。 k越大，组分保留时间越长，k=0，组分的保留时间为死时间。
第二章 色谱分析基础
三聚氰胺
原料乳中添加三聚氰胺的色谱图(浓度 原料乳中添加三聚氰胺的色谱图(浓度4.00 mg/kg) )
仪器分析 生物与化学工程学院
第一节 色谱分析法概述 根据色谱峰的个数, 1. 根据色谱峰的个数,可判断样品所含的最少组 份数. 份数. 根据色谱峰的保留值,可以进行定性分析. 2. 根据色谱峰的保留值,可以进行定性分析. 根据色谱峰的面积或峰高, 可以进行定量分析. 3. 根据色谱峰的面积或峰高 可以进行定量分析.
2 t 理论塔板数与色谱 R = 16 t R n = 5.54 Y1 参数之间的关系为: 参数之间的关系为: W 2
2 t′ t′ R n = 5.54 = 16 R Y1 W 2 2
2
有效理论塔板数: 有效理论塔板数:
有效理论塔板高度: 有效理论塔板高度:
仪器分析
生物与化学区域宽度
A. 标准偏差 σ) 标准偏差( B. 半峰宽 1/2) Y1/2 =2.354 σ 半峰宽(Y C. 峰底宽 (Wb) Wb=4 σ
仪器分析 生物与化学工程学院
第一节 色谱分析法概述 ),色谱流出曲线给出的信息 (二),色谱流出曲线给出的信息
仪器分析 生物与化学工程学院
第一节 色谱分析法概述 ),分配比 容量因子) 分配比( (三),分配比(容量因子) k
ms k= mm
组分在固定相中的质量 组分在流动相中的质量
K与k都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数. 与 都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数. 都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数 K与k都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数,数值越 与 都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数 都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数, 该组分的保留时间越长. 大,该组分的保留时间越长. k可直接从色谱图上获得. 可直接从色谱图上获得. 可直接从色谱图上获得
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一、填空：1. 氢火焰离子化检测器和热导池检测器分别属于（质量）和（浓度）型检测器。
气相色谱仪的心脏是（色谱柱）。
2. 固定液一般是按照（相似相溶）原理选择；在用极性固定液分离极性组分时，分子间作用力主要是（静电力），极性愈大，保留时间就愈（长）。
3. 固定液通常是高沸点的有机化合物，这主要是为了保证固定液在使用温度下有（较好的热稳定性及化学稳定性），防止（固定液分解）。
4. 用于气液色谱的担体主要分为（硅藻工型）。
（非硅藻工型）两类。
5. 与填充柱相比，毛细管色谱柱的相比（β）大，有利于实现快速分析。
但其柱容量（小）。
6. 在HPLC仪中，为了克服流动相流经色谱柱时受到的阻力，要安装（高压输液泵）。
7. 气相色谱分析中，载气仅起输送作用；而液相色谱分析中，流动相还要直接参加____反应____，要想提高高效液相色谱的柱效，最有效的途径是（高压输流动相）。
8. 欲分离位置异构体化合物，宜采用的高效液相色谱的分离模式是（化学键和相色谱法）。
9、色谱法中，将填入玻璃管内静止不动的一相称为（固定相），自上而下运动的一相称为（流动相），装有固定液的柱子称为色谱柱。
10、液相色谱检测器一般可用紫外检测器，（示差折光检测器）；气相色谱检测器可用（氢火焰离子检测器），（热导检测器），（火焰光度检测器）等。
简答题：色谱学分析基础：1、色谱塔板理论的假设？答：塔板理论是将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。
在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部份空间充满流动相。
组分随流动相进入色谱后，就在两相进行分配。
并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板，一个理论塔板的长度称理论塔板的高度。
经过多次分配平衡，分配系数小的组分先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。
由于色谱柱内塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小差别，仍可获得好的分离效果。
2、色谱定性的方法都有哪些？答：利用纯物质对照性；相对保留值法；加入已知物增加峰高法；保留指数定性法；其他方法。
3、内标法定量分析时，内标物选择应满足那些条件？答：①内标物应是试样中原来不存在的物质，性质与被测物质相近，能完全溶解于试样中，但不能与试样发生化学反应②内标物的峰位置应尽量靠近被测组分的峰，或位于几个被测物质的峰的中间并与这些色谱峰完全分离③内标物的质量应与被测物质质量相接近，能保持色谱峰大小差不多4、色谱分析中，固定相的选择原则是什么？相似相溶原理。
选择与试样性质相近的固定相5、色谱定量分析中为什么要用校正因子？在什么情况下可以不用?答：当两个质量相同的不同组分在相同条件下使用同一个检测器进行测定时，所得的峰面积却常不同。
因此，混合物中某一组份的质量分数并不等于该组分的峰面积在各组分峰面积总和中所占的百分率。
这样就不能直接利用峰面积计算物质的含量。
为了使峰面积能真实的反应物质的质量，就要对峰面积进行校正，即在定量计算时引入校正因子在归一化法，测定同系物或性质很相近物质，响应值大小一样的话或很接近，把他们的（相对）相应因子或校正因子看做1时，可省略定量校正因子。
测某种物质（很纯）的纯度时，因杂质含量很小，也可省略定量校正因子来计算。
6、 总结色谱法的优点。
答：①分离效能高②灵敏度高③分析速度快④应用范围广7、 色谱流出曲线可解决的问题有哪些？组分数，定性，定量，柱效，柱选择性8、 根据你所学知识，填写下表。
气相色谱：1. 气相色谱的基本设备包括那几部分,各有什么作用?答：主要包括：①载气系统②进样系统③色谱柱④温控系统⑤检测系统作用：①载气可以携带气化了的式样进入色谱柱，进行分离②进样就是把试样快速而定量地加到色谱柱上端③色谱柱是色谱仪的心脏，主要进行色谱分离④温控系统控制进样系统、色谱系统、及检测系统的温度⑤检测系统将个组分及其浓度的变化以易于测量的电信号显示出来。
2．试以塔极高度H 做指标讨论气相色谱操作条件的选择。
1）当色谱柱长度一定时，塔板高度 H 越小，则塔板数 n 越大，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。
2）不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。
3）柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离4）塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。
3. 试述速率方程式中A 、B 、C 三项的物理意义。
答：A 为涡流扩散项A=ρλd 2，与固定相颗粒大小，几何形状及装填紧密程度有关；B 为分子扩散相B=D γ2G 。
C 为传质阻力相C=C 1+C g4. 为什么可用分辨率R 作为色谱柱的总分离效能指标。
答：由R=()()[])()(21A b B b A R B R W W t t +-即分辨率R 为相邻两峰保留值之差与两峰宽之和一半的比值。
又有R=()()α4A R B R t t -(对于相邻两个峰可以人为其峰宽大至相等)。
当R=1时，峰间距离等于σ4，称为σ4分离。
此时，峰有2%的相互重叠，这已适合于多数定量分析的需要。
当R=1.5时，峰间距离等于σ6，称为σ6分离，峰重叠小于1%，可以认为两峰已经完全分离开了。
当然，若R 值越大，分离效果会更好，但会延长分离时间。
所以分辨率作为色谱柱的总分离效能指标。
5. 能否根据理论塔板数来判断分离的可能性？为什么？答：不能。
因为，在实际应用中，常常出现计算出的n 值虽然很大，但色谱柱的分离效率却不高的现象。
这是由于未将不参与柱中分配的死时间t M 扣除，即理论塔板数n 未能真实地反映出色谱柱的分离效能。
6. 对载体和固定液的要求分别是什么?答：⑴要求载体比表面积要大，化学稳定性及热稳定性好，粒度均匀，有足够的机械强度。
⑵对固定液的要求：①在使用温度下为液体，热稳定性及化学稳定性好；②在操作温度下黏度要低，以保证固定液能均匀地分布在载体上形成均匀的液膜；③能溶解被分离混合物中的各组分，使各组分有足够的分离能力。
7. 试比较红色担体和白色担体的性能,它们各使用在哪些方面?答：红色担体孔径小，表孔密集，比表面积较大，机械强度好。
适宜分离非极性或弱极性组分的试样。
白色担体颗粒疏松，孔径较大，比表面小，机械强度较差。
氮吸附性显著减小，适宜分离极性组分试样。
8. 固定液可分为哪几类？为什么这样划分？如何选择固定液。
答：①一般按化学结构类型和极性进行分类，分为烃类和硅氧烷类②以便总结出一些规律供选用固定液时参考。
③“相似相容”，选择与试样性质相近的固定液。
9. 色谱定性的依据是什么，主要有哪些定性方法。
答：各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此，保留值可以作为一种定性指标。
主要方法：①利用纯物质的对照定性；②相对保留值法；③加入已知物增加峰高法；④保留指数定性法。
10．假设一个未知油剂样品，请设计一种气象色谱分析方法，并概述分析过程。
首先根据油品性质选择合适的色谱柱和检测器。
根据相似相溶原理选择合适的色谱柱，根据所检测的物质，选择合适的检测器类型，然后再根据物质选择合适的色谱条件（包括检测器温度、进样口温度、分离度等）液相色谱：1、正相HPLC 与反相HPLC 的主要不同之处什么？各适合分离什么物质？答：①在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相。
②正相HPLC 主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。
反相HPLC 不仅可以分离不同类型的化合物，尤其适于分离同系物，非极性及极性较弱的化合物。
2、何为梯度洗脱？什么情况下采用梯度洗脱？答：梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变他们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、PH 或离子强度相应地变化，以达到提高分离效果，缩短分离时间的目的。
当两种或两种以上的溶剂结构与性质相似不易于分离时，应采用梯度洗脱。
3、液相色谱中最常用的检测器是什么检测器，它适合那些物质的检测？答：液相色谱中最常用的检测器是紫外检测器，对大部分有机化合物有响应。
4、某组分在ODS 柱上,以80％甲醇作流动相时的保留时间为10min,如果用60％甲醇作流动相，组分的保留时间是增加，还是减小？如果将80％甲醇换成80％异丙醇后，又会怎样变化呢？并请作出解释。
增加，因为降低流动相浓度，极性增大，作用时间延长。
可以增加保留时间。
如果换作异丙醇后，保留时间减小，因为异丙醇极性比甲醇极性小5、高效液相色谱法的特点？答：①高柱效②高选择性③分析速度快④灵敏度高⑤重复性好⑥应用范围广6、在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s 和12.8s ，计算分离度。
要达到完全分离，即R=1.5，所需要的柱长。
(已知n=3600) 解：8133.036002.124411=⨯==n t W R b ；8533.036008.124422=⨯==n t W R b分离度：72.08133.08533.0)2.128.12(2=+-⨯=R 2L =m L R R 34.4172.05.121212=⨯⎪⎭⎫ ⎝⎛=⨯⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛ 答：所需柱长为4.34m7、在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5 。
计算需要多少块有效塔板。
若填充柱的塔板高度为0.1 cm ，柱长是多少？ 解：18.18510021==r n 有效=1615472)18.018.1(52.1162]1[21212=⨯⨯⨯=⨯-r r R （块） L 有效=n 有效⨯H 有效=1547⨯0.1=155cm即柱长为1.55米时，两组份可以得到完全分离。