氨基酸的离子交换柱色谱分离
氨基酸分析仪原理、分类及几种氨基酸分析仪的比较-科邦实验室
氨基酸分析仪原理、分类及几种氨基酸分析仪的比较概述氨基酸分析仪是一种分析仪器，采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。
工作原理通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。
其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。
应用全自动氨基酸分析仪主要应用:各种物质中18种氨基酸的定性定量分析。
1.饲料上的应用：质量控制：各种饲料必需氨基酸的含量和它们之间的比例必须恰当，测定原料和产品中的氨基酸含量，以达到保证质量的目的。
真伪鉴别：鱼粉氨基酸组成特点是赖氨酸、蛋氨酸含量高，氨基酸分析结果很容易就可以区别它的真伪。
2.农业、食品、饮料及玉米、大豆、小麦等农作物的氨基酸含量进行检测；对果汁、饮料进行真伪的鉴别；检验测定茶氨酸来鉴别真伪茶叶；对酱油级别的认定。
分类氨基酸分析仪按其分离和检测方法的不同可分为两大类型。
第一类是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生光度法测定的经典方法（IEC）。
此类方法于1972年获诺贝尔奖，是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。
第二类是所有基于反相色谱分离、柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相法（HPLC）以及阴离子交换分离直接安培法检测的离子色谱法（IC）。
选型指南1、原理。
基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC）。
此类方法由Stein和Moore两人1958年发明，并于1972年获诺贝尔奖，是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。
2、重要指标。
满足分析需要的技术指标如分离度、重复性等要求，而其中的分离度又是更为重要的指标，因为，色谱理论一般以分离度达到1.2作为两峰基本分离的判定前提，只有峰分开了，才有意义去讨论定性和定量的重复性。
柱色谱是较经典的有机物分离技术
柱色谱是较经典的有机物分离技术，原理和薄层色谱相同，但装置有所不同，主要由一个均匀玻璃柱和填充填料组成，填料是决定柱效的主要因素，填料必须满足具有不溶于所使用流动相、不使欲分离的样品破坏或分解、惰性大、可逆性强和吸附容量大。
同时，填料颗粒直径要均匀。
最常见的柱色谱是硅胶色谱、氧化铝色谱、离子交换柱色谱、聚酰胺柱色谱和凝胶柱色谱。
分配柱色谱是利用混合物中各组分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同，而得到分离的方法，分为正相和反相分配色谱两种类型：正相分配色谱：以水或亲水性溶剂为固定（液）相，以水不相混溶的有机溶剂作移动相的分配色谱称为正相分配色谱。
一般而言，分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物，常用正相分配色谱。
反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定（液）相，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱称为反相分配色谱。
当分离脂溶性或极性较小的成分，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常用反相分配色谱。
实践中有70%以上的分配色谱都采用反相色谱。
分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸、酚类及氨基酸的衍生物；对某些非极性化合物，如油脂、甾体等物质，可采用反相分配柱色谱法。
应用实例：狄戈辛（异羟基洋地黄毒苷）的分离支持剂：国产层析硅胶80 100目，加2/3量的水（以乙酸乙酯饱和），调匀，再以乙酸乙酯（水饱和）浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直径与长度比1:2 以上。
实验方法：取样品与1 2倍量硅胶磨匀，加入柱顶，用水饱和的乙酸乙酯（含0.5%甲醇）洗脱，分部收集，各流分均作纸色谱及薄层色谱检查，比移值相同的流分合并，减压蒸干，以甲醇结晶，得到洋地黄毒苷、羟基洋地黄毒苷、异羟基洋地黄毒苷三种单体。
吸附柱色谱是将待分离混合物样品均匀地加在装有吸附剂的柱子中，再加适当的溶剂（洗脱剂）冲洗，由于吸附剂对各组分吸附能力不同，各组分在柱中向下移动的速度不同，吸附力最弱的组分随溶剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。
柱色谱是较经典的无机物分离技巧[新版]
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柱色谱是较经典的有机物分离技术，原理和薄层色谱相同，但装置有所不同，主要由一个均匀玻璃柱和填充填料组成，填料是决定柱效的主要因素，填料必须满足具有不溶于所使用流动相、不使欲分离的样品破坏或分解、惰性大、可逆性强和吸附容量大。
同时，填料颗粒直径要均匀。
最常见的柱色谱是硅胶色谱、氧化铝色谱、离子交换柱色谱、聚酰胺柱色谱和凝胶柱色谱。
分配柱色谱是利用混合物中各组分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同，而得到分离的方法，分为正相和反相分配色谱两种类型：正相分配色谱：以水或亲水性溶剂为固定（液）相，以水不相混溶的有机溶剂作移动相的分配色谱称为正相分配色谱。
一般而言，分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物，常用正相分配色谱。
反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定（液）相，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱称为反相分配色谱。
当分离脂溶性或极性较小的成分，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常用反相分配色谱。
实践中有70%以上的分配色谱都采用反相色谱。
分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸、酚类及氨基酸的衍生物；对某些非极性化合物，如油脂、甾体等物质，可采用反相分配柱色谱法。
应用实例：狄戈辛（异羟基洋地黄毒苷）的分离支持剂：国产层析硅胶80 100目，加2/3量的水（以乙酸乙酯饱和），调匀，再以乙酸乙酯（水饱和）浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直径与长度比1:2 以上。
实验方法：取样品与1 2倍量硅胶磨匀，加入柱顶，用水饱和的乙酸乙酯（含0.5%甲醇）洗脱，分部收集，各流分均作纸色谱及薄层色谱检查，比移值相同的流分合并，减压蒸干，以甲醇结晶，得到洋地黄毒苷、羟基洋地黄毒苷、异羟基洋地黄毒苷三种单体。
吸附柱色谱是将待分离混合物样品均匀地加在装有吸附剂的柱子中，再加适当的溶剂（洗脱剂）冲洗，由于吸附剂对各组分吸附能力不同，各组分在柱中向下移动的速度不同，吸附力最弱的组分随溶剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。
离子交换柱层析法分离氨基酸
5．加样:
平衡好后，停止加入缓冲溶液，待缓冲溶 液弯月面靠近树脂顶端时，关闭下端开口。 加入0.5mL左右混合氨基酸溶液，待样品弯 月面靠近树脂顶端时，立即用少量浓度为 （0.45mol/L）的柠檬酸缓冲溶液冲洗层析 管内壁数次，再加入缓冲液约3～4厘米左 右。加样时应避免冲破树脂表面，且避免 将样品全部加在某一局限部位。
离子交换柱层析法分离氨基酸
一、实验目的和要求
1.学习采用离子交换柱层析法分离氨基酸的原 理和方法。
2.掌握离子交换柱层析法的基本操作技术， 包括树脂的装柱加样、洗脱、检查等。
二、实验原理
离子交换树脂是具有酸性或碱性的合成聚 苯乙烯-苯乙二烯不溶性高分子化合物。
各种氨基酸分子的结构不同从而导致pI点 不同。各种氨基酸在同一pH时带有不同的电 荷，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此 可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下 来，达到分离的效果。
面好
5．混合氨基酸溶液：将上述天冬氨酸、赖氨酸各溶液按1:3的比例混合。 应避免用手直接接触茚三酮。
高 平 的 8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性。
5mL水合茚三酮显色剂并混匀（加显色剂规则为：前10管都加，以后每隔一管加一次，但当出现显色时，周围几管都加。
整 层 注意：设置首管为1，若有50支管，建议末管号设置为51 ， 析 各种氨基酸在同一pH时带有不同的电荷，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到
层析管。
水浴锅内水面刚好没过试管架中层即可。
97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，pI=9.
氨基酸分析的检测方法评述
文章编号:1004-7964(2004)03-0039-05收稿日期:2003-11-05基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)经费资助,课题编号:2001AA647020四川大学青年基金,课题编号:H2002[9-057]第一作者简介:戴红,女,1966年出生,副教授。
主要研究方向:分析检验。
氨基酸分析的检测方法评述戴红,张宗才,张新申(皮革化学与工程教育部重点实验室(四川大学),四川成都610065)摘 要:对氨基酸分析常用的化学方法、电化学方法、分光光度法(包括可见光分光光度法,紫外光分光光度法和荧光分光光度法)等检测方法进行综述,以期为提高氨基酸分析的灵敏度、准确性,为快速、高效的氨基酸分析方法的建立提供参考。
关键词:氨基酸;检测;分析中图分类号:Q517;Q503 文献标识码:ADetermination M ethods of Amino A cids A nalysisDA I Hong ,ZHA N G Zong 2cai ,ZHA N G Xi n 2shen (Key L aboratory of L eather Chemist ry and Engi neeri ng(S ichuan U niversity ),M i nist ry of Education ,Chengdu 610065,Chi na )Abstract :Determination methods for amino acids ,including chemistry determination ,elec 2tric 2chemistry determination ,spectrophotometer determination and conductivity detection method were reviewed for the sake of improving the analysis sensitivity and accuracy.The paper aimed at providing useful reference to building a fast and effective amino acids aualytic methods.K ey w ords :amino acid ;analysis ;determination 氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质,氨基酸分析技术对蛋白质化学、生物化学和整个生命科学研究以及产品开发、质量控制和生产管理等具有重要意义,广泛地应用于化工、轻工、食品加工、医药卫生行业的医药、食品、保健品等的分析,并且用于皮革化学鞣革机理的研究中[1,2,3]。
实验二 氨基酸的离子交换柱色谱分离
实验二氨基酸的离子交换柱色谱分离【原理】本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。
在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
【操作】1、树脂的处理关于市售新树脂的处理见注1，关于树脂浮洗的方法参照讲义所述，本实验采用处理好的树脂。
2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。
待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到8cm高度为止。
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。
装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。
3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（pH试纸检查），这大约需要2～3倍床体积。
4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。
用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。
沿柱壁小心地加入柱中，加样时不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。
洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm 高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。
离子交换色谱法和离子色谱法
阳离子交换树脂
RSO H
3
+
X
RSO3X
+
H
不可交换离子 可交换离子 待测离子
交换平衡常数或选择性系数
RSO X H RSO X 3 3 s m s Ks RSO3 H s X m RSO3 H s / X m K A KB / H m
强酸型阳离子交换树脂：含有磺酸基-SO3 H+的树脂
OH 2.阴离子交换树脂：在骨架上引入能电离出 的
碱性基团，如季铵基、氨基、仲胺基，叔胺基。 强碱型阴离子交换树脂：含有季铵基-N(CH3)+3 OH 的树脂。
交联度和交换容量
交联度：
表示离子交换树脂中交联剂的含量大小，即合成树脂 时二乙烯苯在原料中的重量百分含量。 强酸型--2～16%：强碱性--<10%。 交联度越高。网眼越小，选择性越高，大体积离子愈 难进入树脂基体。
影响Ks的因素
1）溶质的离子电荷数越大或水合离子半径越 小，则KS ↑。 2）交换能力强、选择性大的离子组成流动相 的洗脱力越大，则tR↓, KS↓ 3) pH降低时，弱电解质的离解被抑制（弱酸 ），tR↓, KS↓ 4）交联度↑，交换容量↑， tR ↑, KS ↑
流动相
离子交换色谱多以水溶液为流动相，因为水具有使组
分离子化的特性，也可在流动相中加入少量有机溶剂（甲
醇，四氢呋喃和乙腈）以增加某些组分的溶解度进而改变 分离选择性，这对分离可离解的有机化合物尤为有利。 以水为流动相的离子色谱中，组分的保留时间和分离 度主要通过控制流动相pH和离子强度调节。
测定氨基酸的方法以及试剂
一采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸1.氨基酸测定原理：食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
2.测定氨基酸所用仪器:真空泵;恒温干燥箱;水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30mL。
用去离子水冲洗干净并烘干;真空干燥器(温度可调节);氨基酸自动分析仪。
3.测定氨基酸所用试剂及其配制方法:3.1试剂：全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
浓盐酸(优级纯);苯酚(须重蒸馏); 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)：0.00250mol/L; 不同pH值柠檬酸钠缓冲液；氢氧化锂(LiOH·H2O)；冰乙酸(优级纯)；二甲基亚砜(C2H6OS)；水合茚三酮(C9H4O3·H2O)；还原茚三酮(C18H10O6·2H2O);NaOH；高纯氮气（纯度99.99%）；冷冻剂：市售食盐与冰按1∶3混合。
3.2试剂配制方法：3.2.1. 6mol/L盐酸∶浓盐酸(3.1)与水1∶1混合而成。
3.2.2. pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)和16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。
pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。
pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
3.2.3. 茚三酮溶液pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至5.2。
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氨基酸的离子交换柱色谱分离
【原理】
本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。
在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
【操作】
1、树脂的处理
关于市售新树脂的处理见注1，关于树脂浮洗的方法参照讲义所述，本实验采用处理好的树脂。
2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。
待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到8cm高度为止。
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。
装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。
3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（pH试纸检查），这大约需要2～3倍床体积。
4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。
用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。
沿柱壁小心地加入柱中，加样时不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。
洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。
注意在调节流速时要排除流泵与柱之间连接管内的所有气泡，并且在调节时不要过猛，以免影响色谱行为。
5、收集：柱流出液可用自动分离收集器或以刻度试管人工收集按每管3ml先收集4管。
6、改换高pH洗脱收集：关闭恒流泵及柱底阀，将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成pH12 NaOH洗脱液，然后按上面同样方法继续收集到第5管到10管。
7、测定：（注2）将收集的各管编号后，分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中，加入1ml pH5.3柠檬酸洗脱缓冲液，0.5ml茚三酮试剂，混合后在100℃水浴上加热25分钟。
然后水冷却5～10分钟，加3m160％乙醇衡稀释，摇匀后用721型分光光度计在570nm处比色。
测定后，以光密度为纵坐标，收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。
8、再生，对于装好的柱使用几次后需要0.2mol/L NaOH溶液洗脱，再用蒸馏水洗至中性后重复使用。
注：1、对于市售的干树脂其处理方法为：先经水充分溶胀后，倾去上面的泥状细粒，反复洗几次直到水澄清为止，然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂，浮选后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/L NaOH依次浸洗，每次半小时，换酸或碱时用水先将树脂洗至中性，最后树脂应处理至溶液无黄色。
这时再用1mol/L NaOH使树脂转成钠型（对于其它的转型要视实验和树脂的情况而定），在蒸馏水洗至中性备用。
2、氨基酸的测定一般要求在pH5左右，这样在本实验中，改变pH后和洗脱液就不能直接进行测定。
所以在第7步测定时要加入1ml pH5.3的柠檬酸缓冲液。
【器材】
①玻璃色谱柱：长19cm，内径1.2cm，3＃砂芯。
②恒流泵（微量输液器）。
③Bs-160型部分收集器或以收度试管手工操作。
④721型分光光度计。
⑤刻度吸管、试管。
⑥水浴锅。
【试剂】
①树脂：磺酸型阳离子交换树脂（732型）
②洗脱液：0.45mol/L、pH5.3柠檬酸缓冲液，取285克柠檬酸（C6O7H8·H2O）；186克97％NaOH；105ml 浓盐酸溶于水稀释至10升。
0.01mol/L pH12NaOH缓冲液，取4克NaOH溶于10升蒸馏水。
③样品液：0.005mol/L Asp和Lys的0.02mol/L HCl混合溶液。
④显色剂
三氯化钛——茚三酮溶液：
醋酸缓冲液：水150ml，无水醋酸钠82克，无水醋酸25ml，加水定容250ml pH5.5。
乙二醇甲醚750ml，加入茚三酮20克，三氯化钛（TiCl315%）1.7ml，用醋酸缓冲液定容到1升。