慢病毒转染PROTOCOL
Ca法转染-制备慢病毒和感染细胞protocol(完整版)
2×HBS (ul)配方：8g NaCl ，0.14g Na2HPO4•2H2O 或0.2g Na2HPO4•7H2O ，6.5g HEPS ，调节pH 值7.0， 最终溶于500ml 双蒸水中,4℃保存。
2MCacl 2配方：87.6g Cacl 2·6H 2O 溶于200ml 双蒸水中，用0.22μm 滤器过滤除菌，4℃保存，不可冻牢凝固。
^^^Day 11、在转染前24小时，在10cm dish 中（面积约为78.5cm 2）中铺3.6 x106 293T 细胞，于9ml DMEM （hyclone 高糖）+10%FBS+PS ，待次日细胞汇合度达到70%。
^^^Day 22、早上10：00转染，此时转染前无需换液。
浓度过高，混合均匀。
4、将混合好的复合物RT 5min ，加入到细胞培养液中。
5、晚上5：00换液，将培养液换成新鲜的6ml DMEM+10%FBS+PS 。
^^^Day 36、观察24h 荧光。
^^^Day 47、早上10：00观察48h 荧光，此时可以收集病毒，也可以到下午3：00-4：00再收集病毒(高压离心管和EP 管)。
Ooo 感染细胞^^^Day 11、感染细胞前，消化目的细胞，此时培养液用1640+10FBS+PS\DMEM +10%FBS+PS ，铺种在6孔板中，1 x105 cell/well ，使感染前细胞汇合到20-30%，37℃，5%CO2孵箱过夜。
在蛋白质测序中也有一定作用。
具有可高温高压灭菌特性。
用双蒸水配制，－20℃储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果)3、将细胞放入37℃，5%CO2孵箱，4-5h后换液2Ml 1640\DMEM +10%FBS+PS。
过夜。
^^^Day 34、早上换2ml新鲜的1640\DMEM +10%FBS+PS。
^^^Day 45、晚上观察48h荧光率。
（由于慢病毒表达过程比较慢，到48h才能观察到荧光）开始药筛。
转染protocol
转染protocol
注意：整个过程要防止293T细胞漂，所以动作一定要轻缓，不要急。
一、细胞准备
转染前12-18小时，铺细胞。
293T 细胞，介于1:2~~1:3传。
二、转染前换液
吸去细胞上层培养基，轻轻地加入PBS（14.5cm皿需要至少5ml培养基），缓慢地晃动培养皿，然后吸去PBS。
轻轻地加入10ml Opti-MEM。
然后放回细胞培养箱。
三、PEI稀释，DNA与PEI混匀
抗体重链与轻链质粒比例按照1：2.5混匀；质粒与PEI按照1：1混匀。
（质量比，PEI 为1ug/ul）；每14.5cm皿可以转染40ug质粒。
每皿我们需要1-2mlPEI&DNA混合液（Opti-MEM稀释）。
首先计算好抗体重链、轻链所需质粒，PEI需要量以及二者混合后最终体积。
然后，取一半体积的opti-MEM于15ml离心管中，加入PEI，Vortex，净置5分钟。
取另一半体积的opti-MEM于15ml离心管中，加入DNA，Vortex。
将PEI稀释液逐滴加入DNA稀释液中，混匀。
静置20分钟。
（尽量避光）
四、轻轻地将PEI&DNA混合液加入细胞培养皿中（1-2ml/皿）。
缓慢晃动培养皿，混匀。
然后放回细胞培养箱。
五、一小时后，吸去Opti-MEM，每皿加入20ml 293freestyle培养基。
（动作轻缓）
六、4天后，收上清。
慢病毒转染
慢病毒转染
1、实验前一天，以每毫升3-5×10 4个目的细胞接种96孔培养板中的12孔，体积为90ul。
（不使用边上的孔，保持细胞状态良好）
2、感染预实验共分为四组，每组三个不同的MOI：1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml
3、实验开始，配备1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml，如病毒滴度为1×108TU/ml，取5ul病毒液稀释到45ul的ENi.S.中，在进行一次10被稀释即可。
4、取2ul10mg/mlpolybrene稀释到400ul，备用。
5、将10ul三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。
6、再设定需要添加polybrene的孔中加入10ulpolybrene稀释液。
7、混匀后继续培养，8-12小时候观察细胞生长状态，并更换为新鲜培养基。
8、感染3-4天后，观察荧光表达情况。
9、通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。
选取效果最优的一组实验条件按相同的实验方法进行正式转染实验。
慢病毒专用转染试剂说明书
慢病毒专用转染试剂LentiFit TM使用说明书产品简介：LentiFit TM脂质体转染试剂是一种高效的阳离子脂质体转染试剂。
与其他脂质体转染试剂相比，汉恒生物独立研发的LentiFit TM脂质体转染试剂具有转染效率高，重复性好，操作简单，无明显细胞毒性，抗血清干扰等优点。
对于大多数细胞，用LentiFit TM转染后72小时内不更换培养液无明显细胞毒性。
同时，血清的存在不影响LentiFit TM的转染效率，这样可以减小无血清对细胞的损伤。
基于以上优点，LentiFit TM常用做慢病毒包装的转染试剂。
包装清单以及储存条件：试剂名货号储存条件规格有效期LentiFit TM转染试剂Let10004℃保存 1 mL12个月使用方法：1.细胞培养：以1个10 cm培养皿转染293T细胞为例，转染前一天接种细胞(20-24小时)，接种细胞约3.5×106，接种体积10 mL，确保第二天转染时细胞汇合度（confluent）能达到约50%~70%。
2.在进行转染步骤前，把10 cm培养皿中的培养液更换成新鲜细胞培养液，培养液的体积为5 mL，放回培养箱中继续培养，并准备转染体系（步骤3-6）。
3. 把LentiFit TM脂质体转染试剂轻轻混匀。
4. 对于待转染的10 cm培养皿中的细胞，取一只洁净无菌离心管，加入24 µg质粒（目的质粒和辅助质粒的比例根据不同包装系统进行调整）到500 µL DMEM溶液，用枪轻轻吹打混匀。
5. 取另一只洁净无菌离心管，加入500 µL DMEM溶液，再加入40 µL LentiFit TM，用枪轻轻吹打混匀,室温放置5分钟。
6. 将步骤4与5中的质粒溶液与LentiFit TM溶液混合，用枪轻轻吹打混匀。
不可V ortex 或离心。
室温孵育20分钟。
有可能出现絮状沉淀物，属正常现象，不会影响转染效率。
7. 将转染复合物逐滴加入到培养皿中，轻轻“8”字形摇晃混匀后，放回培养箱继续培养。
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理慢病毒转染是一种常用的基因转染方法，适用于长期表达外源基因的研究。
慢病毒转染原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并将其整合入宿主细胞基因组中，从而实现外源基因的稳定表达。
本文将从慢病毒转染的原理、步骤和应用等方面进行介绍。
慢病毒转染原理。
慢病毒转染的原理主要包括以下几个步骤，首先，将外源基因插入慢病毒载体中，构建成慢病毒表达载体；然后，将慢病毒表达载体转染至包装细胞中，利用包装细胞的辅助病毒蛋白包装慢病毒颗粒；最后，将包装好的慢病毒颗粒用于感染目标细胞，外源基因被整合入宿主细胞基因组中，实现稳定表达。
慢病毒转染步骤。
慢病毒转染的步骤包括慢病毒载体构建、包装细胞培养、病毒颗粒包装和目标细胞感染等。
首先，构建慢病毒表达载体时，需要选择合适的慢病毒载体和适当的启动子，将外源基因插入载体中，并经过序列分析和酶切验证。
其次，包装细胞的培养和病毒颗粒包装是慢病毒转染的关键步骤，需要选择合适的包装细胞系，转染慢病毒表达载体并培养包装细胞，最终收集包装好的慢病毒颗粒。
最后，利用包装好的慢病毒颗粒感染目标细胞，实现外源基因的稳定表达。
慢病毒转染应用。
慢病毒转染在基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域具有广泛的应用。
在基因功能研究中，可以利用慢病毒转染实现基因敲除、过表达和靶向修饰等，进而研究基因在生理和病理过程中的功能。
在基因治疗中，慢病毒转染可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤和传染病等，为基因治疗提供了重要的技术支持。
在细胞工程中，慢病毒转染可以用于改良细胞系，提高细胞的表达稳定性和产量，满足生物制药和工业生产的需要。
总结。
慢病毒转染是一种重要的基因转染方法，具有稳定、高效、广泛应用等特点。
通过慢病毒转染，可以实现外源基因在宿主细胞中的稳定表达，为基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域提供了重要的技术支持。
因此，深入理解慢病毒转染的原理和步骤，对于开展相关研究具有重要的意义。
慢病毒转染操作
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
慢病毒转染PROTOCOL
慢病毒转染PROTOCOL第一天病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。
加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。
在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。
注意：也可用其它型号培养板转导。
这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。
第二天准备完全培养基和Polybrene? (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 μg/ml。
移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。
注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。
Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 μg/ml）。
过长时间暴露于Polybrene （> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。
在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。
培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。
轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。
病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。
注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。
反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。
注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。
此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。
注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。
第三天移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。
孵育细胞过夜。
第四天欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。
第五－六天及以后用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。
Puromycin 筛选法：用足够剂量的Puromycin 杀死非转导的细胞。
lentivirusgeneration慢病毒转染手册
Generation o f L entivirusReagents•293T: ATCC•Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001•FBS: Invitrogen cat# 16000-044•DMEM: Invitrogen cat# 11965-118•Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155•L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156•Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050•Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024•Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058293T/fibroblast media (500 mls):DMEM (450 ml)10% FBS (50 ml)Pen/strep (5ml)L-glutamine (5ml)NEAA (5 ml)Reagent setupLentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectorsA. Production of Virus1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cellsreach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection.2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorftube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.Second generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMD2.G 5 ugpsPAX2 5 ugThird generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMDL g/pRRE 5 ugpRSV-Rev 2.5 ugpMD2.G 2.5 ug3. Add transfection mixture dropwise to cells; incubate 4 hrs to overnight (16 hours) andreplace with fresh medium.4. Collect virus-containing medium 48 hours after transfection and replace with freshmedium. Collect virus every 12 hours for up to 3 times total. Keep all viral media at 4Cuntil all collections are done. Pass viral media through a 0.45uM low protein-binding filter.At this point, the viral supernatant can be used to infect cells, frozen at -80C orconcentrated.Concentration using Amicon Ultra Centrifugal Filters:Transfer viral supernatnat to Amicon Filter and spin filter in tabletop centrifuge at 3000 rpm for 10-20 min at 4C. Concentrated virus can be aliquoted and stored at -80C. Thaw analiquot on ice before use; do not refreeze.Concentration by ultracentrifugation:1. Transfer viral supernatant to 33ml Beckman ultracentrifugation tubes and spin for 2hrs at 24,000 rpm using SW32Ti or SW28Ti.2. Pour off supernatant carefully and resuspend viral pellet using 100-ul pipette tip withappropriate amount of DMEM to concentrate virus 100x. It may take 30 min toovernight at 4C for the pellet to completely dissolve.3. Store virus in aliquots at -80C. Thaw an aliquot on ice before each use; do notrefreeze.。
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理慢病毒转染是一种使用病毒来传播特定基因的技术，是生物工程应用与研究的重要技术之一，具有广泛的应用领域。
慢病毒转染指的是将外源基因特异性地转染到宿主细胞中，通过利用慢病毒扩散的能力，从而促进基因的表达。
慢病毒转染通常包括：（1）获取载体和转染感兴趣的目标基因；（2）预先在质粒中构建特异性包合体；（3）将此质粒与病毒膜融合，从而制备慢病毒载体；（4）移植所获慢病毒载体到宿主细胞，由此开启转染过程，最后完成基因的表达。
慢病毒转染的具体步骤有：（1）质粒构建：首先，在可编辑的微型重组质粒中准备质粒DNA。
质粒DNA的构建一般由多个子部分组成，包括目标基因和启动子-表达尾序列等。
启动子-表达尾序列是控制基因表达水平的重要位点，启动子负责基因转录的起始，表达尾序列则参与基因识别及基因表达的正常运转。
（2）质粒载体融合：将构建好的质粒转染到慢病毒膜中，使其分离出慢病毒载体。
慢病毒载体是一类利用慢病毒传播外源基因的重要工具，由慢病毒膜表示的特异性配体在外源基因介导下特异性的融合，形成慢病毒载体，此慢病毒载体则有助于外源基因的把握及转染。
将挑选好的慢病毒载体转染到宿主细胞中，注入体内，在此过程中，外源基因和慢病毒膜进入宿主细胞，开始与宿主细胞相互作用。
当宿主细胞受到诱导时，慢病毒膜即发生膜融合并释放外源基因，基因转染开始，外源基因进入宿主细胞，并以慢病毒形式扩散，使病毒的表达物最终表达出来，形成所需的目的基因产物。
慢病毒转染是一类利用病毒传播外源基因的重要技术，已经在基因工程、实验室表达、转基因生物技术、基因治疗等研究方面发挥了重要作用，为基因工程技术提供了重要理论依据和技术支持。
慢病毒转染技术已被广泛地应用于各个领域，在医疗和药物研发方面取得了重要的成果，在包括基因治疗在内的生物技术的发展中起着重要的作用。
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第一天
病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。
加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。
在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。
注意：也可用其它型号培养板转导。
这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。
第二天
准备完全培养基和Polybrene® (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 µg/ml。
移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。
注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。
Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 µg/ml）。
过长时间暴露于Polybrene（> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。
在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。
培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。
轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。
病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。
注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。
反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。
注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。
此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。
注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。
第三天
移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。
孵育细胞过夜。
第四天
欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。
第五－六天及以后
用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。
Puromycin 筛选法：用足够剂量的Puromycin 杀死非转导的细胞。
Puromycin 浓度范围为2 到10 µg/ml 是常用计量，但对于新的细胞株建议先做Puromycin 滴度。
每3－4 天更换含有新鲜Puromycin 的培养基，直到耐药克隆可以被确认。
选择几个克隆，扩增并进行稳定shRNA 表达鉴定。
注意：因为慢病毒结构整合到细胞基因的数量不同，使Puromycin 耐药克隆可能出现不同水平shRNA 表达。
注意：用蛋白免疫印迹法（Western Blot）对shRNA 进行表达分析时，细胞裂解液准备方法如下：
用PBS 漂洗细胞一次。
细胞置于100 µl 的2x 电泳上样缓冲液（sc-24945）和PIPA 裂解液（sc-24948）的1:1 混合液并轻轻振动12 孔板或用加样器冲打以裂解细胞。
必要时冰上超声裂解。
注意：如果用RT-PCR 对shRNA 进行表达分析，请参考P. Chomczynski and N. Sacchi (1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159) 描述的RNA 分离方法或使用商品化RNA 分离试剂盒。
生物安全性
慢病毒颗粒可用于标准二级生物安全组织培养设施(并且需要按照同级别的其它传染性物质的要求进行处理）。
慢病毒颗粒是没有自我复制功能的，并且设计为当shRNA转导并且整合到宿主DNA后，丧失其活性。