整理)慢病毒稳转细胞株步骤
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
2020年整理)慢病毒稳转细胞株步骤
作者：空青山作品编号：89964445889663Gd53022257782215002时间：2020.12.13稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体(详细信息见附录及《质粒得扩增提取》）（大肠杆菌-８0℃保存2-3年,质粒-２0℃保存2—3年,病毒液—80℃保存１年)(１)载体质粒:两端得LＴR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp 得序列及位于env序列中得RRＥ,含宿主RNＡ聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）:包含了pｏl、gａｇ包装成分（３）包膜质粒（pＭD2、G):用其她病毒得包膜蛋白代替了ｅnv基因、三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力得病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTＲEME—ＧENＥ(－20℃保存，不可分装），一种脂质与其她组份构成得混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存)：5ＸPＥG800０／NaＣｌ溶液(聚乙二醇)：NaCl ８、766 g; PEG８00050ｇ溶解在2０0mｌMilｌi-Q纯水中,高压蒸汽灭菌＊＊也可直接从公司买来病毒液（—80℃封口膜封口冻存管保存,4℃保存３天）:滴度一般为10８TU/ml6、10ｍｇ/ml polyｂreｎｅ（-20℃分装保存）:溴化己二甲铵。
就是带正电得小分子，与细胞表面得阴离子结合,提高慢病毒对细胞得感染效率,通常加入pｏｌybrｅnｅ能提高感染效率２～1０倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度(1～１0μｇ/ｍl）7、无血清培养基:ｏｐtｉmｅn8、贴壁细胞(复苏后3代以上得细胞)９、puromｙcin:嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤＜一〉病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转)第一天１、种板,10×1０５个293Ｔ细胞，加入全培养基双抗ＤMＥM４—5ml，过夜2、配制5ＸPＥG８0０0/NaCl溶液称取NaCｌ8、766 g； PEG800０ 50g溶解在200ml Miｌli-Ｑ纯水中;1２1摄氏度３０miｎ湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天１、配管2、加入２ml全培养基DMEM3、将1加入2,孵育10ｈ，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9：00与1７：0０各收取一次5ｍｌ培养液,共20mｌ（－80℃保存)2、过滤:用孔径为０、４5mm得过滤器除去上清中得29３T细胞3、加入5ml 5ＸPEＧ８０0０/NaＣｌ溶液,每30miｎ－1ｈ上下摇匀一次4、４℃过夜第六天１、4℃,3500rｐｍ，20ｍiｎ２、弃上清,倒扣纸上静置1－2min，吸干残余液体３、加入120—１50μlＰBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶４、５0μｌ分装，—80℃保存。
慢病毒转染步骤
转染法步骤：
1分至适宜浓度的细胞到六孔板中，次日细胞应30%~50%融合
2.第二天，吸掉板中的生长培养基并加入新的含聚凝胺的培养基，加入适当数量的病毒于细胞中（见“决定慢病毒效价”部分），每孔溶液终体积为3ml
注意：考虑到细胞在自旋过程中不一定能完全被培养基覆盖，不推崇减少六孔板中的溶液终体积。
调整孔中聚凝胺的终浓度为8mg/ml.通过涡旋六孔板轻轻地混合培养基，病毒以及聚凝胺。
3.为减少自旋-转染过程中悬浮物质的形成以及孔与孔之间液体接触的情况发生，用无菌微孔密封膜封闭六孔板（直接盖在板上），封闭好后，再在密封膜上加上一层未经灭菌的密封箔，最后盖上六孔板盖。
4.在标准的组织培养离心机中，37°C，2250rpm（1200g）条件下自旋-转染细胞60min.
5.一自旋-转染后就移走密封膜和密封箔，将孔中原有的培养基换为新鲜的生长培养基（每孔2ml就足够）
6.转染24h后，吸掉孔中的培养基并每孔加入新鲜的含有嘌呤霉素的2ml生长培养基。
注意：嘌呤霉素的浓度应被每个细胞株充分利用，一般规定在1-5μg/mL
7.进一步的培养时间主要取决于细胞株的类型以及转染后的实验分析。
通常，嘌呤霉素筛选细胞需要大约48h。
下面推荐的是结合给定的细胞株和分析实验来得到的嘌呤霉素筛选
时间
>转染后实验分析嘌呤霉素筛选细胞时间> mRNA knockdown (qPCR) 2+ days
> Protein knockdown (Western) 3+ days
> Phenotypic assay 表型分析3+ days
8.检测目的感染细胞的表面分子。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃第二天2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
构建细胞稳转株
构建细胞稳转株（一）慢病毒包装：1．转染前24小时，将293T细胞以4-5×106接种于10cm的大皿中，加入10ml DMEM 完全培养基，轻轻摇晃，混匀，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
注：细胞转染前密度应达到80%-90%。
3．充分混匀，离心管1，离心管2室温孵育5分钟。
4．将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。
注意加入顺序非常重要。
5．室温孵育转染混合液15分钟6．将步骤1准备的细胞换液（95%DMEM+5%灭活FBS）。
7．将1ml转染混合液逐滴加入换液好的细胞培养皿中，前后晃动培养皿，充分混匀。
8．37℃培养。
4-6小时后，用10ml培养基换液（90%DMEM+5%灭活FBS+5%双抗）。
9．转染48小时收集细胞培养上清。
500g离心10min去除细胞碎片。
该上清可以直接用于慢病毒感染，也可进行病毒滴度测定或病毒浓缩。
如需长时间保存，可-80℃冻存。
注意每次冻融将导致病毒滴度下降2-4倍。
（二）慢病毒感染待测细胞：1.取新包装的或冻存于-80℃冰箱的慢病毒于冰上缓慢解冻。
2.慢病毒与培养基（DMEM+5%灭活FBS+1%双抗）按一定的体积混匀，加转染增强剂polybrene至终浓度为10μg/ml。
3.待转染的细胞吸去原培养液，PBS洗3次。
4.把混合好的慢病毒培养基加到细胞培养瓶中进行感染。
5.将细胞培养瓶放回培养箱中培养过夜，PBS洗3次，更换为完全培养基继续培养。
6.感染72h后，荧光显微镜观察荧光，拍照，分析细胞生长状态。
（三）稳转细胞株筛选：将慢病毒感染成功的细胞继续培养，并在培养基中加入嘌呤霉素进行筛选。
筛选持续一周，在荧光显微镜下观察，至感染效率达到80%嘌呤霉素最佳筛选浓度测定：将对数生长期的细胞消化，均匀铺在24孔板上，5×104/孔。
隔夜将细胞换液，并设置嘌呤霉素梯度：0 ug/ml；0.5 ug/ml；1.0 ug/ml；1.5 ug/ml；2.0 ug/ml；2.5 ug/ml48 h后换正常培养基。
最新整理慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤教学文案
最新整理慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤教学文案一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
稳定转染细胞株（系）详细构建流程
稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。
对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。
本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。
稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。
在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。
最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。
细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。
细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。
载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。
接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。
细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。
另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。
稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
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稳转慢病毒
令狐采学
一、所需试剂
1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）
（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分
（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分
（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env 基因.
三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞
3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒
4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物
5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌
**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，
4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml
6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）
7、无血清培养基：optimen
8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）
9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞
二、具体步骤
<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）
第一天
1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜
2、配制5X PEG8000/NaCl溶液
称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度30min 湿热灭绝30min；保存在4℃
第二天
1、配管
A+B混合室温静置20min
2、加入2ml全培养基DMEM
3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基
第四天第五天：
1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）
2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞
3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次
4、4℃过夜
第六天
1、4℃，3500rpm，20min
2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体
3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶
4、50μl分装，-80℃保存。
<二>慢病毒转染靶细胞
前期预实验MOI（步骤同正式试验）（见三2,直接订购病毒液时才需要）
前期测病毒滴度（稀释法，还有一种qPCR法见资料）
1、第一天：准备96孔板，每孔加入10000个293T，为每个病毒准备20个孔（稀释10个浓度，各2个副孔）。
放入37℃，5%CO2培养箱中培养。
2、第二天：在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入207µl
培养液，往第一个管中加入23µl病毒原液，混匀后，吸取23µl 加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。
吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
3、第三天：换液
4、第四天：观察结果并计算滴度
在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）/2/X 孔的病毒液的含量（µl ）×1000。
（前面算出的是没μl病毒量，所以乘于1000）
第一天：
1、种板（12/24孔板）需第二天为50%-70%，大约12孔板1×105
第二天
1、准备病毒液（可在第一天做）：在冰上融解
2、准备完全培养基和Polybrene混合物（1:1000-1:2000稀释，终浓度在5-10μg/ml之间），加入相应培养板中（6孔板2ml，12孔板1ml，24孔板500μl）
3、加入浓缩病毒液（12孔板30μl-50μl）（如果是直接购买病毒液需根据MOI确定病毒液量加入病毒液，自己包的病毒可以）
4、培养过夜，对polybrene毒性敏感的细胞在4-6小时候换液第三天
1、对细胞进行换液
第五天
1、用药物进行稳定株的筛选（具体筛选药物根据载体内的基因定，用氨苄青霉素0.5μg/ml-10μg/ml）
2、需设置空白对照（未处理细胞加入相同浓度氨苄青霉素，党对照全部死光为筛选周期）
第六天之后（根据筛选周期）
1、换液传代
2、观察GFP报告基因确定转染效率，或用qRT-PCR确定转染效率
三、注意事项及知识点
1、名词解释
（1）病毒感染复数（multiplicity of infectionMOI）：含义是感染时病毒与细胞数量的比值，即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染
2、慢病毒摸索时加入梯度（具体见自己的说明书）
3、慢病毒的储存与稀释:
可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）
A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度
B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中按照每次的使用量进行分装。
4、慢病毒载体示意图
《1》载体质粒（PLKO.1 抑制载体，PCDH-GFP+puro过表达载体）：
（1）5’LTR：long terminal repeat即长末端重复序列，不编码蛋白质，但含有启动子，增强子等调控元件
（2）包组信号ψ：LTR-ψ通过包装细胞的RNA聚合酶转录为RNA，通过ψ信号起始包装
（3）启动子、酶切位点和抗性基因（amp氨苄青霉素puro嘌呤霉素）
（4）stuffer：目的基因插入位点（慢病毒载体可插入5kbp左右）（5）GFP：green fluorescent protein绿色荧光蛋白
（6）WPRE：Woodchuck Hepatitis Virus (WHP) Posttranscriptional Regulatory Element 肝炎病毒转录后调控元件。
转录后可形成三级结构，促进基因的表达
（7）cPPT/CTS:逆转录病毒顺式作用区域,其中该cPPT和CTS 区域诱导三链ＤＮＡ结构
（更新于2018.11）《2》包装质粒
（1）gag基因编码病毒的核心蛋白基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白等
（2）pol基因编码病毒复制所需的酶类，如反转录酶、整合酶、
蛋白酶
（3）pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶
（4）多种酶切位点和巨细胞病毒启动子
《3》包膜载体
（1）VSV-G：水疱性口炎病毒糖蛋白G基因，用于代替env基因。