Ca法转染-制备慢病毒和感染细胞protocol(完整版)
转染protocol
转染protocol
注意：整个过程要防止293T细胞漂，所以动作一定要轻缓，不要急。
一、细胞准备
转染前12-18小时，铺细胞。
293T 细胞，介于1:2~~1:3传。
二、转染前换液
吸去细胞上层培养基，轻轻地加入PBS（14.5cm皿需要至少5ml培养基），缓慢地晃动培养皿，然后吸去PBS。
轻轻地加入10ml Opti-MEM。
然后放回细胞培养箱。
三、PEI稀释，DNA与PEI混匀
抗体重链与轻链质粒比例按照1：2.5混匀；质粒与PEI按照1：1混匀。
（质量比，PEI 为1ug/ul）；每14.5cm皿可以转染40ug质粒。
每皿我们需要1-2mlPEI&DNA混合液（Opti-MEM稀释）。
首先计算好抗体重链、轻链所需质粒，PEI需要量以及二者混合后最终体积。
然后，取一半体积的opti-MEM于15ml离心管中，加入PEI，Vortex，净置5分钟。
取另一半体积的opti-MEM于15ml离心管中，加入DNA，Vortex。
将PEI稀释液逐滴加入DNA稀释液中，混匀。
静置20分钟。
（尽量避光）
四、轻轻地将PEI&DNA混合液加入细胞培养皿中（1-2ml/皿）。
缓慢晃动培养皿，混匀。
然后放回细胞培养箱。
五、一小时后，吸去Opti-MEM，每皿加入20ml 293freestyle培养基。
（动作轻缓）
六、4天后，收上清。
慢病毒使用操作指南
慢使用操作指南操作指南：慢使用1、简介1.1 背景介绍1.2 慢的定义1.3 慢的应用领域2、仪器与材料2.1 实验室安全设备2.2 实验室试剂和材料2.3 慢载体和质粒3、慢的生产3.1 慢生产细胞系的选择3.2 质粒构建与筛选3.3 慢包装细胞的构建与筛选3.4 慢的生产与扩增4、慢的感染4.1 细胞培养与准备4.2 慢感染的条件优化4.3 慢感染的时间和浓度控制5、慢的转染5.1 细胞转染前的处理5.2 转染的操作条件5.3 考虑的转染效率和细胞毒性问题6、实验细胞系的维护6.1 细胞的培养和传代6.2 细胞的冻存与恢复6.3 实验细胞系的检测和验证7、实验数据记录与分析7.1 实验数据的记录和整理7.2 数据分析方法与软件使用7.3 结果的展示和解释8、安全注意事项8.1 实验操作安全措施8.2 废液处理及废弃物管理8.3 慢实验室传播的预防措施9、附件9.1 相关实验记录表格9.2 质粒和慢载体序列信息法律名词及注释：1、载体：在基因工程中，指用来携带或传递目标基因的DNA或RNA分子。
2、质粒：指自主复制的独立DNA分子，可被插入或移除目标基因，用于基因克隆、表达和操控等实验。
3、细胞培养：通过体外培养细胞的技术，提供实验所需的可控环境和条件。
4、转染：将外源DNA或RNA导入细胞内，使其表达或转录的过程。
5、传代：将细胞从一个培养器转移到另一个培养器，以维持细胞系的生长。
6、冻存：将细胞以特定的方法冷冻保存，以备将来使用。
7、废液处理：对实验过程中产生的含有有害或感染性物质的废液进行妥善处理，避免对环境和人体造成危害。
8、废弃物管理：对实验中产生的废弃物进行分类、包装和处理，符合相关法规和标准。
本文档涉及附件：1、慢生产记录表2、慢感染实验记录表3、细胞培养和传代记录表4、实验数据分析表格本文所涉及的法律名词及注释：载体、质粒、细胞培养、转染、传代、冻存、废液处理、废弃物管理。
原汁原味的慢病毒转染与感染protocol
原汁原味的慢病毒转染与感染protocol Lentivirustransfection and infectionsPackaging cell line:293FTGrowth medium:DMEM containing 10% HI FBS, 1%P/S, 0.5mg/ml G418,4 mM L-Glutamine,0.1 mM MEM Non-Essential Amino Acids,1 mM MEM sodium pyruvateLentiviral medium:DMEM containing 10% HI FBS, without antibiotics,4 mML-Glutamine, 0.1 mM MEM Non-Essential Amino Acids,1 mM MEM sodium pyruvateTargetcell medium:DMEM or other medium containing 10% HIFBS, without antibiotics.ProtocolCulturing 293FT cellsQuickly thaw the frozen 293FT cells, and immediately after thawing, transfer the cells to a 15 ml tube containing 10 ml PBS,and then pellet the cells. Resuspend the cells in growth medium, and incubat e cells at 37°C in a humidified 5% CO2 incubator.Transfection and infections1. On Day 1, prepare DNA-Lipofectamine? 2000 complexes foreach sample.a.In a sterile 5 ml tube, dilute 3 μg pLP1, 3 μg pLP2, 3 μg pLP/VSVG, and 3 μg of pLenti expression plasmid DNA (12μg total) in 1.5 ml of DMEM (noserum, no P/S). Mix gently.b.In a separate sterile 5 ml tube, dilute 36 μl Lipofectamine? 2000 (mix gently before use) in 1.5 ml of DMEM (no serum, no P/S). Mix gently and incubate for 5 minutes at room temperature.c.After incubation, combine the diluted DNA (Step a) with the diluted Lipofectamine? 2000 (Step b). Mix gently.d.Incubate for 20 minutes at room temperature to allow the DNA Lipofectamine ? 2000 complexes to form. The solution may appear cloudy, but this will not impact the transfection.e.While DNA-lipid complexes are forming, trypsinize and count the 293FT cells.Resuspend the cells at a density of 1.2x 106 cells/ml in lentiviral medium.f.Add the DNA-Lipofectamine? 2000 complexes (Step 1d) to a 10 cm tissue cultureplate containing 5 ml of lentiviral medium.g. Add 5 ml of the 293FT cell suspension from Step 2 (6 x 106 totalcells) to the plate containing media and DNA-Lipofectamine? 2000 complexes (Step 3).Mix gently by rocking the plate back and forth. Incubate cells overnight at 37°Cin a humidified 5% CO2 incubator.2.The next day (Day 2),remove and discard the medium containing the DNA Lipofectamine ? 2000 complexes and replace with 10 ml lentiviral medium.Incubate cells for 48 hours at 37°C in a humi dified 5% CO2 incubator.Note:Expression of the VSV G glyco protein causes293FT cells to fuse, resulting in the appearance of large, multinucleated cells known as syncytia. This morphological changeis normal and does not affect production of the lentivirus.3. Day 3, set up the targetcell line in target cell medium to 60mm plate so that they will be 30% confluent on the next day.4. Posttransfection (Day 4),a. harvestvirus-containing supernatants. Use a 10 ml syringe to remove the medium from the 293FT cell lines, and filter the viral supernatants through a 0.45 μm filter in 15 ml sterile tube. Replace the medium removed from the packaging cells with 10 ml lentiviral medium.b. infect target cells: 1 volume of lentiviral medium (2ml) and1 volume offiltered virus-containing supernatants(2ml), with polybrene 4 μg/ml.c.Pipet the retaining viral supernatants into 1.5 ml sterile tube in 1 ml aliquots. Store viral stocks at -80°C. When stored properly, viral stocks ofan appropriate titer should be suitable for use for up to one year. When using the frozen viral stocks, thaw frozen stocksat room temperature, rather than at 37°C, since lentivirus is temperature-sensitive.5. Day 5 or 6, second round of infection: repeat the infection as described on day 4. And throw the 293FT cells.6.Day 6 or 7, split target cells to 100 mm plate with fresh target growth medium.7. On the Day 7or 8, select cells using drug.。
慢病毒感染细胞实验原理及步骤
慢病毒感染细胞实验原理及步骤1. 实验原理慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。
2. 主要材料细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂3. 主要试剂配制（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）细胞生长培养液：临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。
4. 实验步骤（1）胰酶消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为0.5~1×105/ml（根据情况酌情调整），每孔200ul细胞悬液接种至24孔板，培养箱培养过夜。
次日进行慢病毒感染，此时细胞的融合度约为70%左右。
（2）准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬时离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。
根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量，将其稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
慢病毒转染实验流程
慢病毒转染实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 病毒液与靶细胞准备。
将慢病毒液从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化。
慢病毒感染目的细胞实验步骤
慢病毒感染目的细胞实验步骤1. 感染预实验以 24 孔培养板为例，同时进行目的细胞和工具细胞的感染预实验。
工具细胞可选择 293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其它细胞。
实验材料：培养基、24 孔培养板，移液枪，枪头， EP 管，细胞计数板、冰盒、废液缸等。
（根据目的细胞情况，可酌情使用 Polybrene）Day1：准备细胞：培养细胞至对数生长期，细胞以胰酶消化计数后，用细胞计数测出细胞密度，每孔接种5×104个细胞，添加细胞培养液至500µL。
通常情况下，该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。
（接种目的细胞时，请根据细胞的实际生长速度调整接种量，使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度）Day2：（1）准备慢病毒颗粒：计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；（2）感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度；如细胞状态较好，则开始实验：A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划 8 字的方式轻柔混匀；C. 混匀后，细胞培养板置于37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。
Day3：更换培养液：感染 12-16 小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。
（目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不可感染超过 12 小时。
）Day4：继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常。
Day5：观察（评估）慢病毒颗粒感染效率：盖紧 24 孔培养板，使用 70% 乙醇清理培养板外壁，在倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。
（如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长，荧光表达所需时间也较长，建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。
慢病毒感染细胞具体方法及详细步骤
慢病毒感染细胞具体方法及详细步骤
材料和试剂
1. 6 cm细胞培养皿(Fiosher).
2. 人类或小鼠细胞系，细胞试验所需要的生长培养基。
3. 凝聚胺(海美溴铵; Sigma H 9268)
4. 合适的选择性抗生素。
仪器
1. 细胞培养箱
步骤
慢病毒感染方法应该根据不同的细胞系和以细胞为基础的试验来进行优化。
例如，下列的参数应该在大规模的感染之前进行优化，以确定一个实验的最适条件：
1) 细胞种植密度
2) 慢病毒的数量
3) 嘌呤霉素的浓度
4) 感染时间
2. 在6cm培养皿中种植适当密度的细胞，每孔体积6ml。
1) 贴壁细胞：转染前1天种植细胞
2) 悬浮细胞：转染当天种植细胞，培养基中需要含有凝聚胺。
3. 细胞中加入病毒:
1) (贴壁细胞):弃掉培养基，加入新鲜的含有凝聚胺的培养基。
或者，弃掉部分培养基并且补充含有凝聚胺的培养基。
调整体积和凝聚胺的浓度，使得凝聚胺的终浓度为8ug/ml。
4. 病毒感染:
1) 孵育细胞过夜。
2) 感染后24h更换培养基。
弃掉培养基，换入6ml新鲜的培养基。
如果需要抗生素选择，则使用含有抗生素的新鲜培养基。
注意：嘌呤霉素的浓度应该根据每种细胞系来进行优化；常用的浓度范围为：2-5 μg/mL.
5. 孵育细胞，根据需要每隔几天更换培养基(如果需要，则要含有抗生素) 。
孵育时间的长短主要依赖于感染后的试验。
慢病毒转染PROTOCOL
慢病毒转染PROTOCOL第一天病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。
加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。
在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。
注意：也可用其它型号培养板转导。
这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。
第二天准备完全培养基和Polybrene? (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 μg/ml。
移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。
注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。
Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 μg/ml）。
过长时间暴露于Polybrene （> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。
在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。
培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。
轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。
病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。
注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。
反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。
注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。
此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。
注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。
第三天移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。
孵育细胞过夜。
第四天欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。
第五－六天及以后用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。
Puromycin 筛选法：用足够剂量的Puromycin 杀死非转导的细胞。
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2×HBS (ul)配方：8g NaCl ，0.14g Na2HPO4•2H2O 或0.2g Na2HPO4•7H2O ，6.5g HEPS ，调节pH 值7.0， 最终溶于500ml 双蒸水中,4℃保存。
2MCacl 2配方：87.6g Cacl 2·6H 2O 溶于200ml 双蒸水中，用0.22μm 滤器过滤除
菌，4℃保存，不可冻牢凝固。
^^^Day 1
1、在转染前24小时，在10cm dish 中（面积约为78.5cm 2）中铺3.6 x106 293T 细胞，于9ml DMEM （hyclone 高糖）+10%FBS+PS ，待次日细胞汇合度达到70%。
^^^Day 2
2、早上10：00转染，此时转染前无需换液。
浓度过高，混合均匀。
4、将混合好的复合物RT 5min ，加入到细胞培养液中。
5、晚上5：00换液，将培养液换成新鲜的6ml DMEM+10%FBS+PS 。
^^^Day 3
6、观察24h 荧光。
^^^Day 4
7、早上10：00观察48h 荧光，此时可以收集病毒，也可以到下午3：00-4：00再收集病毒(高压离心管和EP 管)。
Ooo 感染细胞
^^^Day 1
1、感染细胞前，消化目的细胞，此时培养液用1640+10FBS+PS\DMEM +10%FBS+PS ，铺种在6孔板中，1 x105 cell/well ，使感染前细胞汇合到20-30%，37℃，5%CO2孵箱过夜。
在蛋白质测序中也有一定作用。
具有可高温高压灭菌特性。
用双蒸水配制，－20℃储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果)
3、将细胞放入37℃，5%CO2孵箱，4-5h后换液2Ml 1640\DMEM +10%FBS+PS。
过夜。
^^^Day 3
4、早上换2ml新鲜的1640\DMEM +10%FBS+PS。
^^^Day 4
5、晚上观察48h荧光率。
（由于慢病毒表达过程比较慢，到48h才能观察到荧光）开始药筛。
6、药筛：用嘌呤霉素（puro）
Puro:储存浓度：10mg\ml(－20度保存)，使用浓度：2ug\ml。
7、药筛48h后观察48h荧光率，之后可以用2ug\ml维持培养一周后改用1ug\ml puro的培养基培养。