微生物菌种保藏及复壮
微生物菌种保藏及复壮
微生物菌种保藏及复壮5.1. 微生物菌种保藏在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。
微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。
具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。
5.1.1. 蒸馏水悬浮法这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。
好气性细菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面传代保藏斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。
它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。
但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。
斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。
此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。
如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。
5.1.3. 矿物油中浸没保藏此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。
特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。
是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
四节菌种退化复壮与保藏
（3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌： 无性孢子或有性孢子
（4）采用有效的菌种保藏方法
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二. 菌种的复壮 rejuvenation
狭义复壮 在菌种已发生衰退
的情况下，通过纯种分离和 测定典型性状、生产性能等 指标，从已衰退的群体中筛 选出少数尚未退化的个体， 以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施；
结（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg） → 真空封口 → 检 查真空度 → 保藏
措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类 保藏期：5-15年或更长
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5.甘油悬液低温冷冻保藏法 ▪ 方法：菌种培养 → 15-30%甘油缓冲液悬浮 → 加入保藏管中
→ 置 -70℃冰箱保藏 措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油） 适用：细菌、酵母菌 保藏期：约10年 6.液氮保藏法 ▪ 方法：菌种培养 → 保护剂悬浮 → 加入保藏管中 → 置液氮瓶
中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)
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中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部) 中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京 卫生部药品生物制品检定所(NICPBP) 中国预防医学科学院病毒研究所
中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管 理局) 中国医学科学院医药生物技术研究所 四川抗生素研究所(SIA)，四川 华北制药厂抗生素研究所(IANP), 石家庄
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三. 菌种的保藏
（一）目的 使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、
不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用 。 （二）原理
挑选典型培养物（typical culture）的优良纯 种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于 代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。
微生物的菌种保藏技术—微生物菌种的衰退与复壮
一、菌种的衰退
菌种衰退的原因
1. 有关基因的负突变 2. 育种后未经很好的分离纯化 3. 培养条件的改变 4. 污染杂菌
一、菌种的衰退
防止衰退的措施
1）减少传代次数； 2）创造良好的培养条件； 3）利用单核体传代
4）经常进行纯种分离，并对相 应的性状指标进行检查；
5）采用有效的菌种保藏方法；
二、菌种的复壮（rejuvenation）
变异有正变（自发突变）和负 变两种。
菌种退化的 主要原因是基因的 负突变。
一、菌种的衰退
衰退：菌种出现或表现出负变性状 菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变
纯菌种
自发突变
传代增殖
不纯菌种
突变个体
பைடு நூலகம்
衰退菌种 原始个体
一、菌种的衰退
菌种衰退的现象
1. 菌落和细胞形态改变 2. 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 3. 生产性能下降：代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降 4. 对生长环境的适应能力减弱
使衰退的菌种恢复原来优良性状
狭义的复壮是指在菌种已发生 衰退的情况下，通过纯种分离 和生产性能测定等方法，从衰 退的群体中找出未衰退的个体， 以达到恢复该菌原有典型性状 的措施。
广义的复壮是指在菌种的生产性 能未衰退前就有意识的经常、进 行纯种的分离和生产性能测定工 作，以期菌种的生产性能逐步提 高。实际上是利用自发突变（正 变）不断地从生产中选种。
思考与讨论、任务
思考与讨论：我学到什么？
1、菌种的退化：定义、现象原因及防 治衰退的措施 2、菌种的复壮：定义、复壮的方法
任务 1、怎样防止菌种的衰退？ 2、怎样判断菌种的衰退？
模块九 微生物的菌种保藏技术
Microbial culture preservation technology
菌种保藏和复苏-精简版
菌种保藏和复苏-精简版菌种的保藏与复苏一、菌种保藏（一）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。
菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。
（二）菌种保藏的原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。
其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。
在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。
在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。
如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。
与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。
（三）菌种保藏的方法本实验室常用菌种保藏方法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。
平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。
2.甘油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。
甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议甘油终浓度为8-10%，甘油浓度太高会导致质粒的不稳定。
第三章 菌种保藏复壮扩大培养
• （5）其他保藏方法
• 冷冻法：分低温冷冻（－20 ℃）与 超低温冷冻（－196 ℃）两种。适 用于细菌、真菌、病毒等的保藏 • 液态真空干燥法：菌体在恒温液态 条件下进行真空干燥。适用于包括 细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥 保藏效果不佳的菌种。 • 琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产 孢子细菌的保藏
（2）矿物油保藏法
将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的 液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后放于 冰箱中保存。 适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种
（3）砂土管保藏法
利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微 生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两 步。 适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏 感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以 及酵母不适用。
• 2、种龄与接种量 • 3、斜面冷藏时间 • 4、温度：温度直接影响生长和酶的合合成酶的最适pH。 培养基pH值在发酵时要受菌体代谢的影响。
• 调节方法（使之保持适当的pH值）有三种 方法： 用酸碱溶液中和法；使用缓冲溶液法； 使用生理缓冲剂；
3、新诱变因子及诱变技术
• （1）低能离子束诱变： 离子注入是20世纪80年代兴起的一种表面处理技术。这种 相互作用过程大致分为能量沉积、动量传递、离子注入和电荷 交换等四个原初反应过程，在10－19－10－13s中间时发生。 荷能离子注入除具有Y射线能量沉积引起机体损伤的特征外， 还具有动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、 重排或基因的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合 反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造 成的损伤。离子注入通常采用N+、H+、Ar＋。离子注入生物 学效应显示出一些不同于辐射生物学的特征，相当于物理和化 学诱变两者相结合的复合诱变效应 • （2）激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变
菌种的保藏与复壮
4、目的菌的筛选
• 涂布法：于分离平板上铺上一层单一的试验菌的办法用来测定各 个菌落的抗生素生产能力。
• 复印平板法：即用丝绒等把琼脂平板上的菌落转移到别的琼脂平
板上的方法。例如在检测营养缺陷性时，首先在完全培养基琼脂
平板上制备密度适当的菌落，然后把平板上的菌落转移到丝绒上， 再把它当作印章，复印在不含营养物的合成培养基琼脂平板上。 所以和原来平板上的菌落相比较，就可以很容易地检测出营养缺 陷型菌株。这种方法被广泛应用于分离突变菌株，常和诱变剂处
1、常用的细菌
•
大肠杆菌 应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。
乳酸杆菌
应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶 等的制作
枯草芽孢杆菌 应用：生产淀粉酶
2、酵母菌
种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵 母、面包酵母。 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取 蛋白质、生产脂肪。
啤酒酵母
根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。
诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。 诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三大类。经 诱变处理后，微生物的遗传物质、 DNA和 RNA的化学结构发 生改变，从而引起微生物的遗传变异。
诱变育种的一般步骤
（1）出发菌株的选择 • 自然界直接分离到的野生型菌株 • 经历过生产条件考验的菌株 • 已经历多次育种处理的菌株
4、突变菌株的筛选 （1）营养缺陷型突变株的筛选 • 生物合成途径的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成， 末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。 （2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选 • 调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不能再 和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因，因此 不再起反馈阻遏作用； • 编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物 的能力但仍具有催化活性，从而解除了反馈抑制。 • 抗反馈突变株一般通过抗结构类似物突变的方法筛选。 • 营养缺陷型的回复突变株中也可获得抗反馈突变株。
菌种的传代 保藏 复壮
借用一下标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。
适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。
依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC （B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。
储存于2～8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
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微生物菌种保藏及复壮5.1. 微生物菌种保藏在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。
微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。
具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。
5.1.1. 蒸馏水悬浮法这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。
好气性细菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面传代保藏斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。
它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。
但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。
斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。
此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。
如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。
5.1.3. 矿物油中浸没保藏此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。
特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。
是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。
以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。
所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3年也应做一次存活试验。
5.1.4. 干燥-载体保藏此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。
是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。
以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有机物，用水漂洗至中性，烘干，然后装入高度约1cm的河沙于小试管中，121℃间歇灭菌3次。
用无菌吸管将孢子悬液滴入砂粒小管中，经真空干燥8 h，于常温或低温下保藏均可，保存期为1~10年。
土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，经风干、粉碎，然后同法过筛、灭菌即可。
一般细菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。
5.1.5. 冷冻保藏冷冻保藏是指将菌种于-20℃以下的温度保藏，冷冻保藏为微生物菌种保藏非常有效的方法。
通过冷冻，使微生物代谢活动停止。
一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。
为了保藏的结果更加令人满意，通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂；同时还要认真掌握好冷冻速度和解冻速度。
冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难。
普通冷冻保藏技术(-20℃)：将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，于冰箱的冷藏室中贮藏，或于温度范围在-5~20℃的普通冰箱中保存。
或者将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分别接到试管或指管内，严格密封后，同上置于冰箱中保存。
用此方法可以维持若干微生物的活力 1~2年。
应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。
超低温冷冻保藏技术：要求长期保藏的微生物菌种，一般都应在-60℃以下的超低温冷藏柜中进行保藏。
超低温冷冻保藏的一般方法是：先离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞，再用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞，然后加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。
超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1~2℃/ min。
若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。
液氮冷冻保藏技术：近年来，大量有特殊意义和特征的高等动、植物细胞能够在液氮中长期保藏，并发现在液氮中保藏的菌种的存活率远比其他保藏方法高且回复突变的发生率极低。
液氮保藏巳成为工业微生物菌种保藏的最好方法。
具体方法是：把细胞悬浮于一定的分散剂中或是把在琼脂培养基上培养好的菌种直接进行液体冷冻，然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。
进行液氮冷冻保藏时应严格控制致冷速度。
液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤是先制备冷冻保藏菌种的细胞悬液，分装0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口。
然后以1.2℃／min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)。
待细胞冻结后，将致冷速度降为1℃／min，直到温度达到-50℃，将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相 (-156℃)中保存。
如果无控速冷冻机，则一般可用如下方法代替：将安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。
所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。
5.1.6. 真空冻干保藏真空冷冻干燥的基本方法是先将菌种培养到最大稳定期后，一般培养放线菌和丝状真菌约需7~10天，培养细菌约需24~28小时，培养酵母约需3天。
然后混悬于含有保护剂的溶液中，保护剂常选用脱脂乳、蔗糖、动物血清、谷氨酸钠等，菌液浓度为109~1019个/ml，取0.1~0.2ml菌悬液置于安瓿管中冷冻，再于减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华至1%~5%，使培养物干燥。
最后将管口熔封，保存在常温下或冰箱中。
此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一，大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。
而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。
但操作过程复杂，并要求一定的设备条件。
5.1.7. 寄主保藏适用于一些难于用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。
5.1.8. 基因工程菌的保藏随着基因工程的不断发展，越来越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由于它们的载体质粒等所携带的外源DNA片段的遗传性状不太稳定、且其外源质粒复制子很容易丢失。
另外，对于宿主细胞质粒基因通常为生长非必需，一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。
而由质粒编码的抗生素抗性在富集含此类质粒的细胞群体时极为有用。
当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。
而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。
由此看来基因工程菌最好应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。
例如，质粒pBR322。
它除了能将外源DNA 输入E．coli细胞外，还赋予E．coli细胞Ampr和Tetr。
如果在培养基中加入Amp和Tet，则培养时可选择出含pBR322质粒的细胞。
5.1.9. 菌种保藏机构1979年7月，我国成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM),委托中国科学院负责全国菌种保藏管理业务,并确定了与普通、农业、工业、医学、抗生素和兽医等微生物学有关的六个菌种保藏管理中心。
各保藏管理中心从事应用微生物各学科的微生物菌种的收集、保藏、管理、供应和交流。
以便更好地利用微生物资源为我国的经济建设、科学研究和教育事业服务。
(一)中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统:中国微生物菌种保藏管理委员会办事处：中国科学院微生物研究所内，北京。
1．普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)：中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌、细菌。
中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS—IV)：病毒。
2．农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)：中国农业科学院土壤肥料研究所，北京(ISF)。
3．工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)：中国食品发酵工业科学研究所，北京(IFFI)。
4．医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)：中国医学科学院皮肤病研究所，南京(ID)：真菌。
卫生部药品生物制品鉴定所，北京(NICPBP)：细菌。
中国医学科学院病毒研究所，北京(IV)：病毒。
5．抗生素菌种保藏管理中心(CACC)：中国医学科学院抗菌素研究所，北京(IA)和四川抗菌素工业研究所，成都(SIA)：新抗菌素菌种。
华北制药厂抗菌素研究所，石家庄(IANP)：生产用抗菌素菌种。
6．兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)：农业部兽医药品监察所，北京(CIVBP)。
(二)国外著名菌种保藏中心1．美国标准菌种收藏所(ATCC)，美国马里兰州，罗克维尔市。
2．冷泉港研究室(CSH)，美国。
3．国立卫生研究院(NIH)，美国，马里兰州，贝塞斯达。
4．美国农业部北方开发利用研究部(NRRL)，美国，皮奥里亚市。
5．威斯康新大学，细菌学系（WB）,美国，威斯康新州马迪孙。
6．国立标准菌种收藏所(NCTC)，英国，伦敦。
7．英联邦真菌研究所(CMI)，英国，丘(园)。
8．荷兰真菌中心收藏所(CBS)，荷兰，巴尔恩市。
9．日本东京大学应用微生物研究所(IAM)，日本，东京。
10. 发酵研究所(IFO)，日本，大阪。
．11．日本北海道大学农业部(AHU)，日本，北海道扎幌市。
12. 科研化学有限公司(KCC)，日本，东京。
13．国立血清研究所(SSI)，丹麦。
14．世界卫生组织(WHO)。
5.2. 菌种的退化与复壮5.2.1. 菌种的退化现象随着菌种保藏时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗传性状可能得到延续，也可能发生变异。
变异有正变（自发突变）和负变两种，其中负变即菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失均称为菌种的退化。
但是在生产实践中，必须将由于培养条件的改变导致菌种形态和生理上的变异与菌种退化区别开来。
因为优良菌株的生产性能是和发酵工艺条件紧密相关的。
如果培养条件发生变化，如培养基中缺乏某些元素，会导致产孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变；温度、pH值的变化也会使发酵产量发生波动等。
所有这些，只要条件恢复正常，菌种原有性能就能恢复正常，因此这些原因引起的菌种变化不能称为菌种退化。