2--1微生物的实验室培养

（三）、纯化培养技术 • 1．原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个 细胞，使其长成单个菌落------纯化的细菌菌落。


2．微生物接种方法
(1)平板划线法： ①原理：平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接 种环在固体平板表面上的划线和移动过程中。在线的 开始部分，微生物连在一起生长，随着线的延伸，菌 数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。
特别注意：
CO2、CO3 、HCO3 无机碳源： 2-
自养微生物
异养微生物
碳源 有机碳源： 牛肉膏、蛋白胨等 NH4＋、NO3无机氮源：
氮源
（为硝化细菌提供N源和能源）
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等 其中含C、H、O、N的有机物可以是异养型微生物的碳 源、氮源和能源。
练一练
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是： （ D ） A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量 解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生 物的具体情况分析。 对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源， 如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源 同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋 白胨。 对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如 CO2，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微 生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。 对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可 为硝化细菌提供能量和氮源。
到目前为止， 几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖 都与微生物学有关
病毒: 微生物 的类群
无细胞结构
细菌、蓝藻等 原核细胞
原核生物:
原生生物：草履虫、变形虫等 真菌:
真核细胞 如酵母菌、毛霉菌等
真核细胞
课题1
微生物的实验室培养
一.培养基：人们按照微生物对 营养物质 的不同需 求，配制出供其 生长繁殖 的营养基质。
2、基本成分： 碳源、氮源、水、无机盐 特殊营养： 维生素、碱基等（生长因子） （牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有） 3、pH、氧气的需求： 4、种类： 物理性质： 有无 凝固剂琼脂 液体培养基
固体培养基
化学成分：
分离 鉴定
天然培养基 工业 生产 合成培养基
二.无菌技术：防止外来杂菌的污染 1.消毒与灭菌： 消毒 灭菌 较为温和理化方法， 强烈的理化方法， 定义 杀死部分有害菌体 杀死所有微生物 （不包括芽孢、孢子） （包括芽孢、孢子）
旁栏思考：
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物 被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ 答：无菌技术还能有效避免操作者自 身被微生物感染。
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。 如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手 答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
培养基的种类有哪些？
2.培养基的分类
种类 特点 应用
液体培养基 物 半固体 理 培养基 性 质 固体培养基
化 天然培养基 学 成 合成培养基 分
不加凝固剂
加凝固剂
工业生产 观察微生物的运 动、分类鉴定
成分不明的天然物质
微生物的分离、鉴定、 活菌计数、保藏 工业生产
分类、鉴定 培养分离出 特定微生物 鉴别特定微生物 是否的存在
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后 再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么 总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少， 每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着 划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌 繁殖而来的菌落。
练一练 例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是( B ) A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。 A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，
整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），故正确；
B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中 不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。 C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌； D是正确的，因为发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭 菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培 养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后 的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既 可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防 止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在 皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养 微生物吗？为什么？ 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的 培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微 生物。
毛霉菌、青霉菌、曲霉菌等产生 的一种有繁殖作用的生殖细胞。 当环境适宜时，能直接发育成新 个体。【产生的是子代】
菌落
固体培养基上 单个 1.定义： 或少数菌体 大量繁殖 2.特征： 大小、形状、光泽度、 颜色、透明度等。 3.功能： 鉴定菌种的重要依据 子细胞群体
三.大肠杆菌的纯化培养的实验操作： 原理: 在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使 其长成单个菌落------纯化的细菌菌落。 （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
二.无菌技术：防止外来杂菌的污染
1.消毒与灭菌：
2.无菌范围：实验操作空间消毒 操作者的手、衣着消毒 实验用具灭菌 实验操作过程 ① ②
超净工作台
酒精灯火焰旁操作
几个重要的术语
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形 成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽 孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶 劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的 细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。 当环境适宜（如温度、水分适宜）的时 候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。 【还是原来的细菌】
1.计算：依培养基的配方计算各成分的用量。
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方 琼脂20.0g 牛肉膏 蛋白胨 Nacl H2O 5g 10g 5g
定容至1000ml
三.大肠杆菌的纯化培养的实验操作：
原理: 在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使 其长成单个菌落------纯化的细菌菌落。 （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 1.计算： 依配方计算各成分的用量 2.称量： 牛肉膏黏稠，用称量纸称取 牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖 3.溶化：牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解 →取纸 →蛋白胨、NaCl→琼脂 →补水定容 4.调pH、分装、封口： 5.灭菌：培养基、培养皿
培养基的成分有哪些？
1.培养基的成分
基本成分： 碳源、氮源、水、无机盐 有的还需要添加特殊营养物质（生长因子）
营养 物质
含义
能提供 碳元素 的物质
作用
主要来源
碳源
构成生物体的 无机物：CO2、NaHCO3； 物质，异养生 有机物：糖类、脂肪酸、石油、 物的能源物质 花生粉饼等 无机物：N2、NH3、氨盐、硝 合成蛋白质、 酸盐； 核酸以及含氮 有机物：尿素、牛肉膏、蛋白 代谢产物 胨等
Hale Waihona Puke 将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，
个的菌落。
• (2)稀释涂布平板法： • ①系列稀释操作（10倍）。 • a．将分别盛有9 mL水的6支试管
灭菌，并按101～106的顺序编号。
微量 移 液器
• b．进行梯度稀释时，从菌液开始，每次从前一试管中取1 mL
溶液注入到下一试管中混匀。
注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离 火焰1~2cm处。
三.大肠杆菌的纯化培养的实验操作： ㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 ㈡纯化大肠杆菌： 1.微生物接种最常用的方法： 平板划线法和稀释涂布平板法 ⑴平板划线法： 是通过接种环在琼脂固体培养基表 面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培 养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个 细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，也就是菌落。 常用划线方法：
②方法 （几种）

⑴平板划线操作：
接种环 菌种
防止划破培养基
划3个平板 （重复实验） 1个不划线 （空白对照）
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧 接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？ 为什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能 存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为 了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一 次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端， 从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐 渐减少，以便得到菌落。 划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。 这样能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污 染环境和感染操作者。
• 9
三.大肠杆菌的纯化培养的实验操作： ㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 ㈡纯化大肠杆菌： 1.微生物接种最常用的方法： 平板划线法和稀释涂布平板法 （1）平板划线法：
（2）稀释涂布法： 是将菌液进行一系列梯度稀释，然后 进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微 生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单
5. 配制原则
生产
科研
⑴目的明确： 根据微生物的种类、培养目的选择原料 自养型： 不加碳源（CO2碳源） 异养型： 有机碳源
⑵营养全面、浓度适宜、比例恰当
加入缓冲剂 ⑶适宜的pH值：
细菌中性或微碱性， 真菌偏酸
• 9 8
一.培养基小结：