硝酸还原酶的测定
硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶活性测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。
本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：1. 实验材料：- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液- 1% 硫胺素溶液- 10% 硝酸盐还原酶提取液- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液- 0.1 mol/L 醋酸溶液- 蒸馏水2. 实验仪器：- 分光光度计- 定量移液器- 离心机- 恒温水浴槽- 试管架- 显微镜实验步骤：1. 提取硝酸盐还原酶：a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一组吸光度数据。
根据吸光度与硝酸还原酶活性之间的关系，我们可以计算出样品中硝酸还原酶的活性。
在本实验中，我们采用了硫酸铵铵铁硫氰化物法测定硝酸还原酶活性。
该方法利用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再与硫酸铵铵铁硫氰化物反应生成红色沉淀。
硝酸还原酶
植物体内硝酸还原酶活力的测定P56—59硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键美，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：NO3—＋NADH＋H+ →NO2—＋NAD++H2O产生的亚硝酸盐与对—氨基苯磺酸（或对—氨基苯磺酰胺）及α—萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度计法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即ug·g—1·h—1为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性好。
一、离体法仪器与用具：冷冻离心机；分光光度计；天平；冰箱；恒温水浴锅；研钵；剪刀；离心管；具塞试管（10ml）；移液管（5、2、1ml）；洗耳球。
试剂：亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水定容至1000ml，然后再吸收5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug/ml的标准溶液；0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml；1%（W/V）溶液：1.0g对氨基苯磺酸溶于100ml 3mol/L HCl中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/L HCl）；0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶中；0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液中；0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O ，0.0570g K2HPO4·3H2O加去离子水溶解后定容至1000ml；提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸，0.0372g EDTA溶于100ml 0.025mol/L PH8.7的磷酸缓冲液中；2mg/ml NADH溶液：2mg NADH溶于1ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液（临用前配置）。
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]:硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 2422422.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml;-13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL);(0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4贮于棕色瓶中;-1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2KHOP.3HO，溶于1 000ml去离子水中; 2427( 30%三氯乙酸溶液:30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法];1. 标准曲线制作:管号 1 2 3 4 5 6 7亚硝酸钠标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 试剂蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 (ml) 1%磺胺 4 4 4 4 4 4 40.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4每管含亚硝态氮(ug) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
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首都师范大学生命科学学院实验报告实验题目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 使之还原为NO 。
NO -+ NADH + H +— NO 2- + NAD ++ H 2O产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。
NO 含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。
—、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。
4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。
5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。
课程名称植物生理实验 实验时间2010331成绩姓名唐倪文班级_3学号 1090800032NaNO 浓度为横坐标。
具试剂管号12 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)22 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 22 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.02.03.04.05.0 光密度0.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493小麦幼苗完全培养液缺N 培养液KNOHO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.7710.6540.392亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39104.1840.0424.505.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下表。
硝酸还原酶的测定方法
硝酸还原酶的测定方法硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。
红色的偶氮染料。
反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。
增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。
这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。
仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。
0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml 蒸馏水器中。
磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水器稀释至100ml。
α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水器中，稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水器溶解成1000ml。
然后吸取5ml，再加稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。
操作步骤 1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。
然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。
将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测 3. ．绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。
实验八硝酸还原酶活性的测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与讨论 • 参考文献
01
实验目的
了解硝酸还原酶的特性
硝酸还原酶是一种氧化还原酶，负责 将硝酸盐还原成亚硝酸盐，是植物和 微生物进行氮代谢的重要酶之一。
了解硝酸还原酶的特性，有助于深入 理解氮代谢的生物学过程，为农业生 产、生物固氮等领域提供理论支持。
预期结果
在实验前，根据相关文献和理论知识，预测实验 结果并制定预期目标。
结果比较
将实际实验结果与预期结果进行比较，分析两者 之间的差异和一致性。
结果分析
根据比较结果，分析实验中可能存在的问题和误 差来源，提出改进措施和建议。
05
结论与讨论
实验结论总结
硝酸还原酶活性在不同植物组织中存在 差异，表明该酶在不同组织中的功能和 作用可能有所不同。
03
04
在试管中加入适量的酶 液和硝酸盐底物。
将试管放入恒温水浴中， 设定适宜的温度进行反 应。
在反应过程中，定时取 样检测亚硝酸盐的生成 量。
通过分光光度计测定亚 硝酸盐的吸光度值，记 录数据。
数据记录和处理
1
记录每个取样的时间、亚硝酸盐的吸光度值。
2
根据吸光度值绘制亚硝酸盐生成曲线，计算酶活 性。
3
分析实验数据，得出硝酸还原酶活性测定的结果。
04
实验结果与分析
实验数据记录
实验数据记录表
在实验过程中，需要详细记录每 个实验步骤的实验数据，包括酶 液浓度、反应时间、反应温度等。
数据记录的准确性
确保实验数据的准确性是至关重 要的，因此需要使用精确的测量 工具和可靠的记录方法。
硝酸还原酶测定方法
硝酸还原酶测定方法
硝酸还原酶是一种广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体中的酶类，具有催化硝酸还原生成亚硝酸的作用。
亚硝酸可进一步催化生成氮气或氨，参与到氮循环中。
硝酸还原酶测定方法是用来量化硝酸还原酶的活性，以便研究和评价生物体中氮代谢的过程和生态系统中的氮循环。
直接测定法是通过测定硝酸还原酶催化硝酸还原生成亚硝酸的速率来评价其活性。
其中较常用的方法是通过测定硝酸盐浓度的变化来间接测定亚硝酸的含量，进而计算硝酸还原酶的活性。
具体方法如下：
1.取一定量的细胞提取液或组织，加入含有硝酸钠的反应溶液。
2.在一定的时间内，将反应溶液分别加入苯磺酰胺和二甲基苯胺的混合液中，生成偶氮染料，并在550nm波长下测定其吸光度。
3.利用已知浓度的硝酸盐标准曲线，计算出样品中硝酸盐的浓度。
4.根据硝酸还原酶反应硝酸盐生成亚硝酸的速率，计算出硝酸还原酶的活性。
间接测定法是通过测定硝酸还原酶催化还原剂（如戊二醛、甲醇、NADH等）的还原速率来评价其活性。
具体方法如下：
1.取一定量的细胞提取液或组织，加入含有硝酸钠和还原剂的反应溶液。
2.在一定的时间内，测定反应溶液中还原剂的消耗量或其产生的氧化产物（如NAD+）的生成量。
3.根据还原剂的消耗量或产生的氧化产物的生成量，计算硝酸还原酶的活性。
此外，还有一些特殊的测定方法，如溶液散射法、电化学法等，可以根据实验需要进行选择。
总结起来，硝酸还原酶测定方法是通过不同的分析手段测量硝酸还原酶的活性，从而研究和评价氮代谢的过程和生态系统中的氮循环。
不同的测定方法适用于不同的实验需求，科研人员可以根据具体情况选择合适的方法进行研究。
硝酸还原酶活性的测定.
硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
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一、原理
硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2
NO3-+NADH+H→NO2- +NAD+H2O
产生的NO2- 可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2- 的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2- 含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品
721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）
0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二
氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：
1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并
用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml
（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml
然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
注意取样前叶子已进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使酶活性降低，此时可于反应溶液中加入30uM3-磷酸甘油醛或1.6-二磷酸果糖，能显著增加NO2的产生。
2、NO2含量的测定
保温30分钟后，分别吸取反应液1ml于试管中，加入对氨基苯磺酸2ml及α–萘胺2ml 混合摇匀，静置20分钟生成红色，用比色计进行比色测定。
比色用520nm记下光密度读数，从标准曲线上查得的含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO2-微克表示。
3、绘制标准曲线
测定NO2的对氨基比色法很灵敏，可以检出1ugml的NaNO2含量，故可于0-5ug/ml
浓度范围内绘制标准曲线，注意显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关温度，酸浓度等都影响显色温度，同时也影响灵敏，所以标准与样品的测定都要在相同的条件下进行。
吸取不同浓度的NaNO2溶液（如5、5、3、1、0.5、0.1ug/mg）1ml于试管中，加入对氨基苯磺酸试剂2ml及α–萘胺试剂2ml，混合均匀，静置20分钟（或于一定的温度的水浴中保温20分钟），于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光密度，然后于坐标纸上绘制光密度—浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。