实验报告 硝酸还原酶活性的测定word文档良心出品
硝酸还原酶活性的测定
硝酸还原酶活性(ug／h·g)=C×10/t·m(鲜重)
四、实验报告
1、比较在两种不同溶液中的硝酸还原酶活性，并解释。
硝酸还原酶将N03-还原为N02-，产生的N02-可 以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中， 测定反应液中的N02-含量的多少，就表示硝酸还 原酶活性的大小。
N02-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液 中磺胺与N02-形成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺 偶联形成紫红色的偶氮染料，这种偶氮染料在 520nm处有最大吸收峰，因此选用波长520nm分光 光度法进行测定。
根据Lambert-Beer定律：物质对光的吸收，吸 收的光量与物质的浓度、溶液的厚度成比例关系， 用公式表示为
1、用直径1cm的打孔器打出油菜叶圆片100片，各投50片(先称重)至溶液
(1)磷酸缓冲液5 ml + 蒸馏水5 ml； (2)磷酸缓冲液5 ml + KNO3溶液5ml 分别将溶液(1)(2)倒入20毫升针筒内，用针筒抽气使叶圆片中的空气抽去直至叶
圆片沉于溶液中，将此溶液倒回三角瓶置于30℃恒温箱中，保温作用30min后测定 N02-含量。
叶绿体色素的性质测定和分离(P46-48)
实验三 硝酸还原酶活性的测定
一、实验原理
硝酸还原酶是植物氮代谢的关键酶，它使N03-还原成N02-，并可渗到周围的溶 液中，用磺胺显色比色法测定外界溶液中的N02-含量，可以反应该酶活性的强弱。 二、器材与试剂
油菜叶片、小白菜叶片、UV-1100型紫外/可见分光光度计、20毫升针筒 0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液、O.2M KNO3溶液、磺胺试剂、α-萘胺试剂 三、方法与步骤
2、绘制标准曲线（见P34）
3、N02-含量测定 溶液(1)1ml + 磺胺试剂2ml + α-萘胺试剂2ml
硝酸还原酶活性测定实验报告
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶活性测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。
本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：1. 实验材料：- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液- 1% 硫胺素溶液- 10% 硝酸盐还原酶提取液- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液- 0.1 mol/L 醋酸溶液- 蒸馏水2. 实验仪器：- 分光光度计- 定量移液器- 离心机- 恒温水浴槽- 试管架- 显微镜实验步骤：1. 提取硝酸盐还原酶：a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一组吸光度数据。
根据吸光度与硝酸还原酶活性之间的关系，我们可以计算出样品中硝酸还原酶的活性。
在本实验中，我们采用了硫酸铵铵铁硫氰化物法测定硝酸还原酶活性。
该方法利用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再与硫酸铵铵铁硫氰化物反应生成红色沉淀。
实验八硝酸还原酶活性的测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与讨论 • 参考文献
01
实验目的
了解硝酸还原酶的特性
硝酸还原酶是一种氧化还原酶，负责 将硝酸盐还原成亚硝酸盐，是植物和 微生物进行氮代谢的重要酶之一。
了解硝酸还原酶的特性，有助于深入 理解氮代谢的生物学过程，为农业生 产、生物固氮等领域提供理论支持。
预期结果
在实验前，根据相关文献和理论知识，预测实验 结果并制定预期目标。
结果比较
将实际实验结果与预期结果进行比较，分析两者 之间的差异和一致性。
结果分析
根据比较结果，分析实验中可能存在的问题和误 差来源，提出改进措施和建议。
05
结论与讨论
实验结论总结
硝酸还原酶活性在不同植物组织中存在 差异，表明该酶在不同组织中的功能和 作用可能有所不同。
03
04
在试管中加入适量的酶 液和硝酸盐底物。
将试管放入恒温水浴中， 设定适宜的温度进行反 应。
在反应过程中，定时取 样检测亚硝酸盐的生成 量。
通过分光光度计测定亚 硝酸盐的吸光度值，记 录数据。
数据记录和处理
1
记录每个取样的时间、亚硝酸盐的吸光度值。
2
根据吸光度值绘制亚硝酸盐生成曲线，计算酶活 性。
3
分析实验数据，得出硝酸还原酶活性测定的结果。
04
实验结果与分析
实验数据记录
实验数据记录表
在实验过程中，需要详细记录每 个实验步骤的实验数据，包括酶 液浓度、反应时间、反应温度等。
数据记录的准确性
确保实验数据的准确性是至关重 要的，因此需要使用精确的测量 工具和可靠的记录方法。
硝酸还原酶活性的测定.
硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。
NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。
二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。
0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。
1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。
1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。
对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。
α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。
三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。
分别置于含有下列溶液的小烧杯中。
（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。
硝酸还原酶活性的测定实验报告
硝酸还原酶活性的测定实验报告硝酸还原酶活性的测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内起着关键的作用。
它能够将硝酸根离子还原为亚硝酸根离子，参与到氮代谢中。
本实验旨在通过测定硝酸还原酶活性的方法，探究其在不同条件下的变化规律，从而深入了解这一酶的功能及其对生物体的重要性。
材料与方法：1. 实验材料：- 萝卜组织样品- 硝酸还原酶提取液- 硝酸还原酶底物溶液- 甲酚硫酸溶液- 氨水溶液- 高锰酸钾溶液- 氯化亚铁溶液- 硝酸铜溶液- 硫酸亚铁溶液- 硫酸铵铁溶液- 蒸馏水2. 实验方法：- 提取硝酸还原酶：将萝卜组织样品切碎并加入硝酸还原酶提取液，搅拌均匀后离心，取上清液作为硝酸还原酶提取液。
- 测定硝酸还原酶活性：将硝酸还原酶提取液与硝酸还原酶底物溶液混合，反应一段时间后，加入甲酚硫酸溶液停止反应。
然后，分别加入氨水溶液和高锰酸钾溶液，测定吸光度。
- 构建标准曲线：分别取一系列浓度的硝酸铜溶液，加入硫酸亚铁溶液和硫酸铵铁溶液，测定吸光度。
根据吸光度与浓度的关系，绘制标准曲线。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了硝酸还原酶活性的数据，并根据标准曲线计算了不同样品中硝酸还原酶的活性。
首先，我们观察到在不同温度条件下，硝酸还原酶活性的变化。
结果显示，在较低的温度下，硝酸还原酶活性较低，随着温度的升高，酶活性逐渐增加，但在一定温度范围内，酶活性会达到峰值后开始下降。
这表明硝酸还原酶对温度敏感，适宜的温度能够促进酶的活性，但过高的温度则会导致酶的变性和失活。
其次，我们研究了不同pH值对硝酸还原酶活性的影响。
结果显示，在中性pH范围内，硝酸还原酶活性较高，而在酸性或碱性条件下，酶活性明显下降。
这说明硝酸还原酶对于酸碱度有一定的适应范围，过高或过低的pH值都会影响酶的活性。
此外，我们还研究了不同浓度的底物对硝酸还原酶活性的影响。
结果显示，在一定范围内，随着底物浓度的增加，硝酸还原酶活性呈现出增加的趋势。
硝酸还原酶(NR)活性测定
实验三：硝酸还原酶（NR）活性测定一、实验目的了解硝酸还原酶的活性测定的原理，掌握活体测定硝酸还原酶地方法二、实验原理硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，于作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根根：NO3-+NADH++H+ NR NO2-+NAD++H2O产生的亚硝酸根可以从组织内渗入到外界溶液中，从而测定溶液中亚硝酸根的含量的增加即为NR活性大小测定时间磺胺与亚硝酸钠形成重氮盐，再与α-奈氨偶联形成紫色物质。
反应液的酸度和温度都会对反应产生影响。
三、试剂与器材1、材料：小白菜叶片2、试剂：0.1mol/L ph7.5磷酸缓冲液，磺胺试剂、α-奈氨、0.2mol/LKNO3、NaNO2标准溶液3、器材：分光光度计、注射器、试管、天平、烧杯、移液管、恒温箱四、实验步骤1、按下列表格配置不同浓度的NaNO2溶液2、另取7支试管编号，取上述配置好的溶液各1ml，分别加入磺胺2ml、α-奈氨2ml摇匀静置30min，在520nm处比色以NaNO2终浓度为横坐标绘制标准曲线3、将小白菜叶片剪成0.5cm2大小称取两分，每份各0.5g放入另个烧杯中，一个烧杯中加入0.1ml/L磷酸缓冲液5ml再加入蒸馏水5ml，作为对照组。
林一个烧杯中加入0.1mol/L磷酸缓冲液5ml和0.2mol/LKNO3溶液5ml作为实验组。
将材料与溶液混合置于射器中抽气至材料沉入溶液。
4、将含材料的烧杯置于30℃恒温箱中30min，之后分别取1ml溶液按第二步进行NO2-含量测定5、结果分析：酶活性（NO2- μg g-1h-1）=（实验组NO2-含量-对照组NO2-含量）/材料重量（g）/时间（h）五、实验结果实验分析及感悟:由于实验过程中，移液管的混用可能会导致部分溶液污染导致实验产生误差。
叶片剪切的由于抽气不够是结果偏小。
本次试验经历了很长时间，我们从上午10点一直做到下午一点才做完。
当然经过努力的数据分析我们最终得到了我们所渴求的实验结果。
实验3_硝酸还原酶活性测定
3）试剂
• A液：
磷酸缓冲液：水： DNP溶液：蔗糖溶液＝5： 5： 1： 1
• B液： 磷酸缓冲液：KNO3： DNP溶液：蔗糖溶液＝ 5： 5： 1： 1 • 磺胺试剂 • α-萘胺试剂
4. 实验步骤
1） 水(ck)和 KNO3 （N）处理的小麦叶片各取2份
（新鲜叶片中段），用蒸馏水洗净、搽干，剪
实验三
硝酸还原酶活性测定 （p124-127）
一、标准曲线制作 二、硝酸还原酶活性测定
植物对氮素的吸收和利用
以无机氮为主： 硝态氮（NO3-）和铵态
氮（NH4+）
– 铵态氮（NH4+）可以直接被植物利用 – 硝态氮（NO3-）在植物体内还原成铵态 氮才能被利用
硝酸盐的还原
• NO3－中的N为高度氧化态，而细胞组分中的N均 呈高度还原态，被吸收的NO3- 需经过还原后才能 被利用
3）加入磺胺和α-萘胺后要混合摇匀，静置30分 钟 4）分光光度计的使用
思考题
1. 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进 行？ 2. 公式中的0.5 h 指抽气时间还是暗藏保温时间？ 3. B液中的各种成分在本次实验中有什么作用？
实验五 叶绿素的提取、理化性质和含 量测定 （p130－136）
活性的大小。
3）NO2- 含量测定— 磺胺比色法。
• NO2-与磺胺在酸性溶液中NO2-形成重氮盐，再与 α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料，可以用分光
光度计测定OD540。
• 当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与
NO2-含量成直线关系。 NO2- 含量标准曲线：
[ NO2- ] （µmol / ml）= 0.0026＋0.359OD540
植物体内硝酸还原酶活性的测定
植物体内硝酸还原酶活性的测定目的意义：硝酸还原酶是植物氮代谢中十分重要的一个酶，植物从土壤吸收硝酸盐后，首先催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，才能进一步转化变成有机含氮化合物。
在生产中可根据植物体内硝酸还原酶的活性变化，来确定氮肥的合理用量以及植物的氮素营养状况。
一、实验原理在酸性条件下，亚硝酸盐与重氮试剂对—氨基苯磺酸（或对—苯磺酰胺）及偶联试剂α-萘基乙烯二胺反应生成红色偶氮化合物。
红色偶氮化合物的颜色在2~3h内稳定，并在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
二、材料、设备及试剂1、材料川芎叶片、根茎和根。
2、设备冷冻离心机、分光光度计、天平、冰箱、恒温水浴锅、研钵、移液管、剪刀、离心管。
3、试剂(1) 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液称取30.0905g Na2HPO4·12H2O和2.4965g NaH2PO4·2H2O 加去离子水溶后，定至1L；0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液中；（避光保存）0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液称取8.8640g Na2HPO4·12H2O和0.0570g K2HPO4·3H2O（很易吸水变潮）溶于1L去离子水中；(2) 亚硝酸钠标准溶液：准备称取分析纯NaNO20.9857g 溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5ml 定溶至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。
(3) 1%磺胺溶液：1.0g无水对氨基苯磺酸溶于100mL 3mol/L HCl 中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/L HCl)；（注：磺胺比较难容，定容后最好用超声波促进溶解。
应避光保存！）(4) 0.02%萘基乙烯胺溶液：0.02g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
(5) 提取缓冲液：0.1211g半胱胺酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液中。
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首都师范大学生命科学学院实验报告
实验题目硝酸还原酶活性的测定
一、实验原理
硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于
NO 使之还原为
NO 。
NO -+ NADH + H +
— NO 2- + NAD +
+ H 2O
产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。
因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。
NO 含量的测定----磺胺法
NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。
—、实验用品
1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗
2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤
1. 分别配制反应液于小烧杯中
(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml
(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-
的获得
(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。
(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，
内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。
4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。
5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓
度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。
课程名称植物生理实验 实验时间2010331
成绩
姓名唐倪文
班级_3
学号 1090800032
NaNO 浓度为横坐标。
具
试剂
管号
1
2 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)
0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)
2
2 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 2
2 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.0
2.0
3.0
4.0
5.0 光密度
0.015
0.052
0.104
0.202
0.302
0.396
0.493
小麦幼苗
完全培养液
缺N 培养液
KNO
HO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度
0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.771
0.654
0.392
亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性
105.39
104.18
40.04
24.50
5.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和
粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下
表。
-萘胺各2 ml,60 C 水浴20min,生成
6.计算酶活性,以每小时每克鲜重所产生的NO微克数表示(NQ-/h.g )。
X (pg)
X V1 Cml)
V2 fml)
样品中醸活性= ----------------------------------
f NOrp
g Fwg-i-h-9样品鲜童(g) x酶反应时间(h)
公式中：工一从标准曲线e出反应液中亚硝态氮总量(ug) 讥一提取酶时加入的缓冲液体积(述) V2—®反应时加入的酶液体积(1111)
完全培养液，KNQ
酶活性=[(1.791/1)*10]/[0.51*(20/60)]= 105.39
完全培养液，H0
酶活性=[(1.771/1)*10]/[0.51*(20/60)]= 104.18
缺N培养液，KNO
酶活性=[(0.654/1)*10]/[0.49*(20/60)]= 40.04
缺N培养液，HO
酶活性=[(0.392/1)*10]/[0.48*(20/60)]= 24.50
将结果填入上表。
四、实验结果分析
①在完全培养液和缺N培养液中，加KNG普遍都要比加H0的酶活性高，说明KNQ 为酶促反应提供了底物，让酶促反应进行彻底。
②在完全培养液和缺N培养液中，加KNQ相互比较，加H0的相互比较，完全培养液的酶活性都要高，说明N诱导了硝酸还原酶，使之活性增大。
五、思考题
1. 依据原理，测硝酸还原酶活性的实质是以什么物质的含量来表示的？哪一步影响NO2-的浸出量？
答：①实质是以亚硝酸根（NO-）的含量来表示的。
因为NO可以从组织内渗到外界溶液中并积累，因此测定反应溶液中NO的含量的增加，即表明酶活性的大小。
②真空泵抽气影响NO的浸出量。
因为反复抽气放气，溶液可渗入叶组织取代叶片空气，叶片便沉于溶液底部，酶促反应可以相对完全的进行。
2.为什么做两组溶液，一组培养液中加入H20和一组培养液中加入KNO的作用是? 答：①培养时做完全培养和缺N培养是因为硝酸还原酶是诱导酶。
②实验时一组加KNO一组加H0是因为KN（3为酶促反应提供底物，让反应得以彻底
进行。
3.实验前要使材料经一定时间光照，其作用是？答：让材料进行一段时间光合作用，积累有机物。
4.小烧杯置于30C，不见光保温的原因是？
答：酶促反应在暗反应下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使
亚硝酸镁把NO还原成NH。
暗反应下反应可阻止NO-的继续反应。
5.第一次30min和第二次20min的作用是? 答①阻止NO的继续反应
②让NO和磺胺，a -萘胺反应充分，显色完全。
显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色，同时也影响灵敏度。