硝酸还原酶的测定方法

硝酸还原酶的测定方法

硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml 蒸馏水器中。磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水器稀释至100ml。α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水器中，稀释至100ml。NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水器溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。操作步骤 1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测 3. ．绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。实验作业1．试比较不同植物的酶活性。2．试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。参考文献1．陈薇、张德颐：1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，1980(4)：45—49。2．周树、郑相穆：1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯，1985(1)：47—49。3．Hageman,R.H.and D.P. ．Hucklesby:1971.Methods in Enzymology,23A:491—503. 4．Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332—336. 5．Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802—807 （华东师范大学张志良）参考资料：硝酸还原酶活性的测定一、材料用具及仪器药品木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、

洗耳球0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）、0.2mol/L KNO3）；磺胺试剂、a-苯胺试剂，NaNO2 标准溶液：a—萘胺试剂配制：0.2克a—萘胺加25ml浓盐酸，用稀释至100ml。磺胺试剂配制：取1克磺胺加25ml浓盐酸，用稀释至100ml. NaNO2标准溶液：1克NaNO2用溶解，定量至1000ml，然后吸取5ml，再加定量至1000ml，该溶液每ml含有NaNO25ug，用时稀释之。磷酸缓冲液：贮备液A：0.2mol/L NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4·H2O配成1000ml）。贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O或Na2HPO4·12H2O 配成1000ml）取A液16ml B液84ml，用水稀释至200ml 二、原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于NO—3还原于NO—2 NO—3 NADH NO—2 NAD H2O 产生的NO-2可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。NO-2含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。三、方法步骤1．将新鲜叶片（蓖麻、烟草、木茨叶等）水洗，用吸水纸吸干水分，然后用1cm 的钻孔器钻取的圆片，在天平上称取等量的叶圆片两份，每份0.5克，（或每份取50个叶圆片），分别置于含有下列溶液的三角瓶中，（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml 5ml。（2）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，叶圆片即沉于溶液中，（如果没有真空瓶，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器内,，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使之真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使叶圆片中的空气抽去，并沉于溶液中），将三角瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测定NO-2含量。注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可在反应溶液中加入30μmol/L 的3—磷酸甘油醛或1.6——二磷酸果糖，能显著增加NO-2的产生。2．NO-2含量的测定保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，先加入磺胺试剂2ml，后加入一萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用分光光计进行比色测定，比色时用520nm波长，记下光密度，从标准曲线上查得NO-2含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO-2表示之。3．绘制标准曲线测定NO-2的磺胺比色法很灵敏，可以检出低于1ug/ml的NaNO2含量，可于0～5ug/ml浓度范围内绘制标准曲线。吸取不同浓度的溶液（例如5、4、3、2、1、0.5ug/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及一萘胺试剂2ml。混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水浴中保温30分钟）立即于分光光色计下进行比色，（波长520nm），读取光密度，然后，以光密度为纵坐标，NO-2浓度为横坐标，于毫米方格纸上绘制光密度——浓度曲线。五、实验报告计算所测材料硝酸还原酶的活性。六、思考题1、试比较不同植物的硝酸还原酶活性。2、试比较取样前植物处于光照或黑暗条件下酶活性有什么不同。附表：xmlA ymlB.稀释至200ml PH x Y pH x Y 5.75.85.96.06.16.26.36.46.56.66.76.8 93.592.090.087.785.081.577.573.568.562.556.551.0

6.58.010.012.315.018.522.526.531.53

7.543.549.0

6.9

7.07.17.27.37.47.57.67.77.87.9

8.0

45.039.033.028.023.019.016.013.010.58.57.05.3

55.061.067.072.077.081.084.087.089.591.593.094.7 （北京大学单良）Magnet DC Current Sensor Magnet DC Current Sensor Magnet DC Current Sensor Magnet DC Current Sensor Magnet DC Current Sensor Magnet DC Current Sensor Magnet DC Current Sensor Magnet DC Current Sensor Magnet DC Current Sensor Magnet DC Current Sensor Magnet DC Current Sensor

Magnet DC Current Sensor Hall Open-loop current sensor Magnet DC Current Sensor Hall Open-loop current sensor Hall Open-loop current sensor LED显示屏LED显示屏LED显示屏计量检测仪器设备

实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定

硝酸还原酶（nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（NO 3 ˉ+NADH+H ＋→NO 2 ˉ+NAD ＋+H 2 O ）。产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α- 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物

生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝

酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以 N μg ／

（ g · h ）为单位。 NR 的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，

适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。

Ⅰ离体法

二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料

水稻、小麦叶片、幼穗等。

（二）试剂

1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO

2 0.9857 g 溶于无离子水

后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮

的 1 μg ／ mL 的标准液。

2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 30.0905

g 与 NaH 2 PO 4 · 2H 2 O 2.4965 g 加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。

3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓

盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。

4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子

水中，贮于棕色瓶中。

5 ． 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5

的磷酸缓冲液。

6 ． 0.025 mol/L pH8.

7 的磷酸缓冲液： 8.8640 g Na 2 HPO 4 · 12H 2

O ， 0.0570 g K 2 HPO 4 · 3H 2 O 溶于 1000 mL 无离子水中。

7 ．提取缓冲液： 0.1211 g 半胱氨酸、 0.0372 g EDTA 溶于 100 mL 0.025

mol ／ L pH 8.7 的磷酸缓冲液中。

8 ． 2 mg/mL NADH 溶液： 2 mg NADH 溶于 1 mL 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸

缓冲液中（临用前配制）。

（三）仪器设备

冷冻离心机，分光光度计，天平（感量 0.1 mg ），冰箱，恒温水浴，研钵，剪刀，离心管，具塞试管，移液管，洗耳球。

三、实验步骤

1. 标准曲线制作

取 7 支洁净烘干的 15 mL 刻度试管按表 11 – 1 顺序加入试剂，配成

0 ～ 2.0 μg 的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在 25 ℃下保温 30 min ，然后在 540 nm 下比色测定。以亚硝态氮（μg ）为横坐标（ x ），吸光度值为纵坐标（ y ）建立回归方程。

表 11-1 制作标准曲线时各溶液加入量

2. 样品中硝酸还原酶活力测定

（ 1 ）酶的提取称取 0.5g 鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻 30 min ，取出置冰浴中加少量石英砂及 4 mL 提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在 4 ℃、 4000 r/min 下离心 15 min ，上清液即为粗酶提取液。（ 2 ）酶的反应取粗酶液 0.4 mL 于 10 mL 试管中，加入 1.2 mL 0.1 mol/L KNO 3 磷酸缓冲液和 0.4 mL NADH 溶液，混匀，在 25 ℃水浴中保

温 30 min ，对照不加 NADH 溶液，而以 0.4 mL 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸缓冲液代替。

3 ．终止反应和比色测定

保温结束后立即加入 1 mL 磺胺溶液终止酶反应，再加 1 mL 萘基乙烯胺溶液，显色 15 min 后于 4000 r/min 下离心 5 min ，取上清液在 540 nm 下比色测定吸光度。根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量（μg ）。

四、结果计算

单位鲜重样品中硝酸还原酶活性 = [μg ／（ g · h ） ]

式中：X ——反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg 。

V l ——提取酶时加入的缓冲液体积， mL 。

V 2 ——酶反应时加入的粗酶液体积， mL 。

W ——样品鲜重， g 。

t ——反应时间， h 。

Ⅱ活体法

一、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料

植物的新鲜叶片（豌豆、王米、小麦、大豆等）。

（二）试剂

1. 1% 磺胺试剂： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。

2. α - 萘胺试剂：称取α - 萘胺 0.2 g ，用含 1 mL 浓盐酸的蒸馏水溶解，再用蒸馏水稀释至 100 mL 。

3. NaNO 2 标准液：称取 0.1 g NaNO 2 ，用蒸馏水溶解，定容至 100 mL 。之后，再吸出 5mL ，用蒸馏水稀释至 1000 mL 。此液每毫升含有 5 μg NaNO 2 ，用时再稀释。

4. 0.2 mol/L KNO 3 ：称取 KNO 3 2.002 g ，用蒸馏水溶解，移入 100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。

5. 0.1 mol/L 磷酸缓冲液， pH7.5 。

（三）仪器设备

三角瓶 50mL ，打孔器（直径 0.5 cm ），真空泵，温箱，分光光度计，移液管 5mL 3 个， 1 mL 2 个， 2 mL 2 个，台天平 1 台。

二、实验步骤

1. 绘制标准曲线

（ 1 ）把每毫升含有 5 μg 的 NaNO 2 标准液稀释成每毫升含有 0.5 ，1.0 ， 2.0 、 3.0 、 4.0 μg NaNO 2 溶液。

（ 2 ）取 6 支试管， 1 支装入蒸馏水 1 mL ，另 5 支分别装入上述不同浓度的 NaNO 2 溶液 1 mL ，然后向每支试管里加入磺胺试剂 2 mL 及α - 萘胺试剂 2 mL ，摇匀，在 25 ～ 30 ℃条件下保温 1 h ，冷却后于分光光度计在 540 nm 波长下比色，读出光密度。以光密度为纵坐标， NaNO 2 浓度为横坐标，绘制出标准曲线。

2. 样品的测定

（ 1 ）从田间取回新鲜叶片（豌豆取苗期叶片，高梁取籽粒灌浆期叶片，或取其它叶片均可），用水洗净，吸干水份，用打孔器打出直径 0.5 cm 的叶圆片，用蒸馏水冲洗叶圆片 1 ～ 2 次，用吸水纸把水吸干后，于台天平上称取等重叶圆片两份，每份重 0.5 g 。

（ 2 ）取 2 个 50 mL 三角瓶，分别装入下列溶液：① 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.5 ） 5mL, 再加蒸馏水 5 mL ，② 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（ pH7.5 ） 5 mL, 加 0.2 mol/L KNO 3 溶液 5mL, 然后把三角瓶放在真空干燥器内，接上真空泵抽气，以排除组织间隙的气体，使叶圆片沉于溶液中 , 以便底物溶液进入组织（如果没有真空泵，也可用注射器来代替，把反应液与叶圆片一起倒入 20 mL 注射器中，用手指堵住注射器出口的小孔，然后用力拉注射器使之成为真空，如此抽气、放气、反复多次，也可抽掉叶圆片中的空气，使之沉于溶液中）。放气后，把三角瓶放入 30 ℃温箱中，保温 30 min 。

（ 3 ）保温结束后，从三角瓶中，各吸取反应液 1mL ，分别放入 2 支试管中，然后各加磺胺试剂 2 mL 及α - 萘胺试剂 2 mL ，混匀，置于 25 ～30 ℃条件下反应 1 h ，冷却后，用分光光度计在 540 nm 波长下比色，读出光密度，在标准曲线上查出 NO 2 ˉ含量（μg/mL ）。

三、结果计算

酶活性（μg NO 2 ˉ／ g · h ）

式中：C 1 ——从标准曲线上查出的 1 号三角瓶里 NO 2 ˉ含量，μ

g/mL 。

C 2 ——从标准曲线上查出的 2 号三角瓶里 NO 2 ˉ含量，μg/mL 。

V ——反应液的总体积， mL 。

t ——反应时间， h 。

W ——植物鲜重， g 。

[ 注意事项 ]

1. 硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在 4 ℃下进行。

2. 取样宜在晴天进行，让植株充分照光，或施用一定量的硝态氮肥，可增加酶的活性，取样部位应一致。

3. 硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防亚硝酸盐还原为氨。

4. 从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。

树的幼果期会出现大量生理落果，主要原因是：这一时期作物那北容易产生大量脱落酸，在果蒂处形成脱落层，使幼果不能保住。如果氮素营养能跟上去，脱落酸就不容易产生。我采用的方法是，提高硝酸还原酶的活性，有利于氮的吸收，促进蛋白质的合成，并增加线粒体的形成。线粒体在有氧呼吸中起重要作用，呼吸作用加强，养分吸收增加，脱落层就很难形成。

钾元素对植物体的作用:

钾元素在光合作用中占有重要地位，钾参与光合作用产物碳水化合物的运转、贮存（特别是淀粉的形成）。钾可促进蛋白质的合成，是某些酶或辅酶的活化剂；钾与三磷酸腺苷（ATP）的活性有关，是硝酸还原酶的诱导剂