中南大学湘雅医学院附属海口医院

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超声引导下肺肿块穿刺活检的临床应用

割活检标本经病理学检查均做出病理诊断。标本取
１．２仪器采用ＡＬＯＫＡ３５００超声诊断仪，凸材满意率为１００％，其中肺恶性肿瘤占８０．４％（７８ＤＩＣＡＬＪＯＵＲＮＡＬ
《海南医学）２０１０年第２ｌ卷第８期
· 医技与临床 ·
超声引导下肺肿块穿刺活检的临床应用
罗彦冰，朱才义，陈列（海口市人民医院中南大学湘雅医学院附属海口医院超声医学科，海南海口５７０２０８）
１．３术前准备患者取卧位或侧卧位，先行Ｂ
变，ＣＴ三维重建技术（ＣＴＡ）可以清楚的显示肿块的超扫查病灶部位，明确肿块大小、位置、形态、范围、
血管及分布情况，三维、四维彩超的发展可以实时动内部结构及与周围脏器关系，再行彩色多普勒检查
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｕｅｏｆｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ—ｇｕｉｄｅｄｂｉｏｐｓｙｉｎｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｐｕｌ－
ｍｏｎａｒｙｔｕｍｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉ１ｌｅｄａｔａｏｆｈｏｓｐｉｔａｌｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ—ｇｕｉｄｅｄｂｉｏｐｓｙｉｎ９２ＣａｓＣＳｗｉｔｈｌｕｎｇｍａｓｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ９２ｃａｓｅｓｗｉｔｈｐｕｌｍｏｎａｒｙｍａｓｓｗｅｒｅａｂｔａｉｎｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｎｏｎｅｔｉｍｅ，ａｎｄｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｌｅｓｉｏｎｓａｎｄｔｕｂｅｒｅｕｌｏｓｉｓａｃｃｏｕｎｔｅｄｆｏｒ５７．８％．２２．２％ａｎｄ４．４％．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＵｌｔｒａｓｏｕｎｄ—ｇｕｉｄｅｄｂｉｏｐｓｙｉＳｓａｆｅ。ｒａｐｉｄ。ａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｅｆｌｉｅｉｅｎｔｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｐｕｌｍｏｎａｒｙｍａｓｓ．

孕周相关的网织红细胞参数及参考值范围的调查

•44 •CHINESE JOURNAL OF FAMILY PLANNING &GYNECQTOKQLOGY Volume 12 Number 12 2020论著与临床孕周相关的网织红细胞参数及参考值范围的调查吴秀继•，游明，韩永基金项目：2018年海南省卫生计生行业科研项目（项目编号：18 A200020)作者单位:570208海南海口，中南大学湘雅医学院附属海口医院检验科作者简介:吴秀继，毕业于中南大学，硕士，副主任技师，主要研究方向为临床检验学•通讯作者，E-mai丨:260546952@qq. com【摘要】目的探讨正常妊娠妇女外周血网织红细胞的变化，并建立其参考值范围。

方法采用日本S y smex X N 9000全自动血细胞分析仪对2018年4月至2019年4月中南大学湘雅医学院附属海口医院658例正常妊娠妇女和100例正常非妊娠妇女的外周血网织红细胞进行检测，获得各参数网织红细胞百分比(reticulocyte percentage，R E T% )、未成熟网织红细胞指数（immature reticulocyte fraction，I R F)、低熒光网织红细胞（low fluorescence reticulocyte，L F R)、中焚光网织红细胞（m e d i u m fluorescent reticulocyte,M F R)、高荧光网织红细胞（high fluorescence reticulocyte，H F R)、网织红细胞血红蛋白（reticulocyte hemoglobin, R E T-H e)、红细胞血红蛋白（erythroryte hemoglobin，R B C-H e)、网织红细胞生成指数（reticulocyte production indcx，R P I),并用 S P S S 18.0软件进行统计分析结果，采用95%可信区间确定其参考值范围。

全程健康教育体系在冠脉支架术后患者中的效果探讨

全程健康教育体系在冠脉支架术后患者中的效果探讨俸永红;李大严;蒙漫史;陆士娟;邢波;陈希;黎福理;王茹【期刊名称】《实用临床医药杂志》【年(卷),期】2015(000)020【摘要】目的：探讨全程健康教育体系在冠脉支架术后患者中的应用效果。

方法选择本科行冠脉支架术后患者720例随机分为观察组和对照组各360例，对照组按护理常规在患者入院时和出院前进行健康教育，观察组用健康教育体系在对照组基础上实施责任护士全程跟踪式健康教育，比较2组服药依从性、二级预防知识的掌握、相关疾病知识的掌握情况、护理满意度、再入院率及病死率。

结果观察组服药依从性、冠心病二级预防知识、及相关疾病知识掌握、满意度等均优于对照组（P ＜0．05）；再入院率和病死率低于对照组（P ＜0．05）。

结论对冠脉支架术后的患者实施全程健康教育体系管理可全面减少患者的危险因素、改善生活质量、提高术后康复率，强化有效服药的依从性，纠正患者的不良生活习惯，减少再入院率，提高了护理满意度，值得临床推广。

【总页数】4页(P1-3,13)【作者】俸永红;李大严;蒙漫史;陆士娟;邢波;陈希;黎福理;王茹【作者单位】中南大学湘雅医学院附属海口医院，海南海口，570208;中南大学湘雅医学院附属海口医院，海南海口，570208;中南大学湘雅医学院附属海口医院，海南海口，570208;中南大学湘雅医学院附属海口医院，海南海口，570208;中南大学湘雅医学院附属海口医院，海南海口，570208;中南大学湘雅医学院附属海口医院，海南海口，570208;中南大学湘雅医学院附属海口医院，海南海口，570208;中南大学湘雅医学院附属海口医院，海南海口，570208【正文语种】中文【中图分类】R473.5【相关文献】1.全程健康教育模式在冠脉支架植入术后护理管理中的应用 [J], 肖翔燕;袁桂菊;李海菊2.全程健康教育在冠脉支架术后患者中的应用 [J], 赵冰艳3.全程健康教育体系在冠脉支架术后患者中的效果探讨 [J], 张黎4.全程健康教育应用于冠脉支架术后患者护理效果观察 [J], 刘红军5.移动医疗微信群在冠脉支架术后患者健康管理中的应用研究 [J], 邵丹;刘晓红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较_NormalPdf

中南大学学报（医学版）J Cent South Univ (Med Sci)2021,46(8)两种人包皮成纤维细胞分离培养方法的比较曹卉1，王薇2，肖敬川1，黄邓高1，高元慧1，朱丹1（1.中南大学湘雅医学院附属海口医院中心实验室，海口570208；2.中南大学湘雅医学院附属海口医院皮肤科，海口570208）[摘要]目的：作为理想的种子细胞，成纤维细胞的高效获取及纯化尤为重要。

本研究通过比较改良组织块培养法(improved tissue culture method ，ITCM)及酶消化培养法(enzyme digestion method ，EDM)分离培养人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts ，HFF)，以探讨两种方法的优缺点。

方法：ITCM 是将剪碎的皮肤组织置0.1%II 型胶原酶中于4℃下消化过夜，分离表皮与真皮，对真皮组织采用0.25%胰酶于室温下再次消化15min ，待组织块贴壁于培养皿后进行培养。

EDM 是将剪碎的皮肤组织置0.25%胰酶中于4℃下消化过夜，分离表皮与真皮，将真皮组织再次于4℃下用0.1%II 型胶原酶消化过夜，然后将组织块与酶的混合物一起过滤、挤压，用含有胎牛血清的培养基冲洗滤网，对得到的细胞悬液进行培养。

ITCM 与EDM 均采用两种酶进行消化，但两种酶的使用顺序、消化时间及温度不同，最终接种于培养皿中进行后续培养的分别是组织块和细胞悬液。

本研究利用ITCM 和EDM 分离、培养HFF ，观察ITCM 组和EDM 组HFF 的原代至第3代(Passage 0~Passage 3，P0~P3)的细胞形态；染色波形蛋白、CD68和角蛋白以鉴定细胞纯度；绘制P3生长曲线对比两组细胞的增殖能力。

采取120mJ/cm 2的中波紫外线(medium-wave ultraviolet ，UVB)照射P3ITCM 组和EDM 组HFF ，建立光损伤模型。

重症肺结核患者T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子的表达及其预后意义

重症肺结核患者T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子的表达及其预后意义吴多池;钟业腾;王玉峰;吴烨莹;赵庆珠【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2022(38)5【摘要】目的探讨重症肺结核患者T淋巴细胞亚群、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM-1,TIM-3)的表达及其预后意义。

方法回顾性分析2019年1月至2021年6月在我院收治的1056例重症肺结核患者为研究对象,并将其定义为重症肺结核组,另选同期在我院进行治疗的1000名轻症肺结核患者作为轻症肺结核组。

比较两组患者TIM-1、TIM-3以及外周血T细胞亚群(CD4^(+)、CD8^(+))水平;检测并比较外周血单个核细胞中TIM-1、TIM-3的mRNA水平;分析重症肺结核患者外周血T细胞亚群、TIM-1、TIM-3与患者预后的关系。

结果重症肺结核组CD8^(+)、TIM-1和TIM-3水平均高于轻症肺结核组,CD4^(+)水平低于轻症肺结核组(均P<0.001)。

重症肺结核组TIM-1 mRNA和TIM-3 mRNA水平均高于轻症肺结核组(均P<0.001)。

死亡组CD8^(+)、TIM-1和TIM-3水平均高于存活组,CD4^(+)水平低于存活组(均P<0.001)。

相关性分析发现:存活组患者TIM-1、TIM-3与CD4^(+)均呈负相关(r值分别为-0.114和-0.211,P<0.05),而与CD8^(+)均呈正相关(r值分别为0.571和0.680,P<0.05)。

结论重症肺结核患者免疫功能紊乱可能与其体内外周血T细胞亚群水平异常以及TIM-1、TIM-3表达水平升高有关。

【总页数】5页(P400-404)【作者】吴多池;钟业腾;王玉峰;吴烨莹;赵庆珠【作者单位】中南大学湘雅医学院附属海口医院;海南医学院第二附属医院;首都医科大学附属北京胸科医院【正文语种】中文【中图分类】R378.91;R521【相关文献】1.胃癌患者CD4＋／8＋T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3表达水平及意义2.脑出血患者外周血干扰素-γ、细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3 mRNA表达及意义3.脑出血患者血肿周围组织T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子－3的表达及意义4.冠心病患者外周血T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3表达变化及临床意义5.半乳糖凝集素-9和T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3在口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

四手操作技术治疗效率的临床价值

四手操作技术治疗效率的临床价值【摘要】目的了解四手操作治疗技术对医生治疗效率的影响。

方法调查医师进行四手操作治疗前后工作量的变化。

结果采用四手操作治疗技术前后,医生的工作量明显增加,有非常显着统计学意义(P<)。

结论四手操作治疗技术可明显提高医师的治疗效率,有在临床上进行推广应用的价值。

【关键词】四手操作技术;牙科医生;治疗效率四手操作技术是在口腔设备、器械不断更新,为保护口腔科医生、护士体力及健康前提下逐步完善发展起来的国际标准化口腔科操作模式。

该技术极大地提高了医疗质量和工作效率,相对减轻了医生的压力和疲劳,缩短了患者的诊疗时间,促进了医患之间的沟通,更好地为广大患者提供优质的服务。

近年来,国内外口腔四手操作配合的文献较多,尤其是关于四手操作中医护患的体位及动作、医护患的位置关系、四手操作中口腔器械的传递与交换方面、各种治疗操作的配合方面的论述较多。

对于四手操作提高医师治疗效率论述不少[2~4],但是都是从理论分析得出结论较多,并没有真正的临床调查研究报道,本研究对开展四手操作前后口腔医师的业务收入进行了统计分析。

1 资料与方法调查对象中南大学湘雅医学院附属海口医院口腔医学中心进行四手操作的医师,共7位,时间自20XX年1月~20XX年12月。

调查资料统计中南大学湘雅医学院附属海口医院口腔医学中心开展四手操作技术前后2年内7位口腔医师月经济指标的变化情况(见表1),从而形成对开展四手操作技术的综合效益评价。

2 结果调查发现,医生工作量变化具有以下特点。

就7位医生工作总量来看,四手操作后医生的工作量有明显上升,从月均元上升到元,上升幅度相当明显。

从医生个人来看,多数医生的工作量与四手操作前比较,均有不同程度的提高,但少数医生(3号和6号医生)的工作量与四手操作前比较,有不同程度的下降,见表1。

3 讨论四手操作技术是一种现代化的牙科操作和管理系统,具有高质量、高效率,保护医护劳动力的优点。

提高骨科大手术患者深静脉血栓预防措施落实率

提高骨科大手术患者深静脉血栓预防措施落实率程金焱;沈慧;陈晓虹【摘要】骨科大手术患者深静脉血栓预防措施落实率低,原因分析显示,无DVT风险评估工具,无预防DVT质控标准,无质控员考评办法,医生没有下达医嘱等为主要原因.对此,从工具、标准、办法、医嘱4方面改进,使骨科大手术患者深静脉血栓预防措施落实率从39.29％提高至89.86％,规范了骨科大手术患者DVT预防管理,达到了质量持续改进目的.%The implementation rate of preventive measures for deep vein thrombosis (DVT) in patients with major orthopedic surgery was low.The main reasons included no DVT risk assessment tool,no DVT quality control standards,no quality control staff assessment measure,and no doctor's advice.In this regard,improvements were made from four aspects of tools,standards,methods,and doctor's advice,which increased the implementation rate of preventive measures for DVT in major orthopedic surgery from 39.29％ to 89.86％.The management of DVT prevention in major orthopedic surgery patients had been standardized,which achieved the purpose of continuous quality improvement.【期刊名称】《中国卫生质量管理》【年(卷),期】2018(025)003【总页数】4页(P58-61)【关键词】骨科;大手术;深静脉血栓;预防措施【作者】程金焱;沈慧;陈晓虹【作者单位】海口市人民医院暨中南大学湘雅医学院附属海口医院海南海口570208;海口市人民医院暨中南大学湘雅医学院附属海口医院海南海口 570208;海口市人民医院暨中南大学湘雅医学院附属海口医院海南海口 570208【正文语种】中文小组概况(表1、表2)表1 小组概况小组名称点点圈成立时间2012年3月注册编号HLPG2017002课题类型管理型活动时间2016年7月-2017年2月人数(人)7活动次数(次)12活动课题提高骨科大手术患者深静脉血栓预防措施落实率表2 小组成员序号姓名学历职称/职务组内职务及分工1沈慧本科副主任护师/护士长组长,方案制定、任务分配2金旭红博士主任医师/运动医学科主任组员,调查数据收集、分析3曾玲本科副主任护师组员,调查数据收集、分析4陈晓虹本科主管护师/副护士长组员,调查数据收集、分析5范忠诚硕士主治医师组员,调查数据收集、分析6程金焱本科主管护师组员,活动记录、幻灯片制作、成果发布7符兰汝本科护师组员,活动影像资料采集1 选题理由深静脉血栓(Deep Vein Thrombosis，DVT)是指血液在静脉内不正常的凝结，使血管完全或不完全阻塞，属静脉回流障碍性疾病[1]。

Fonsecaea monophora色素毒力性研究

㊃论著㊃F o n s e c a e a m o n o p h o r a色素毒力性研究王丽王薇(中南大学湘雅医学院附属海口医院皮肤科,海口570208)ʌ摘要ɔ目的探讨黑色素是否为F o n s e c a e a m o n o p h o r a的一个重要毒力因子㊂方法从F o n s e c a e a m o n o p h o r a的分生孢子突变株(C B S122845)传代接种产生白色突变株(C B S125149)㊂透射电子显微镜(T E M)下观察到黑色素是位于分生孢子细胞壁表面上的电子致密颗粒㊂通过碱-酸法提取来自两个不同菌株的细胞壁色素颗粒㊂建立不同菌株或色素颗粒与活化巨噬细胞(R AW264.7)共培养体系,通过实时荧光相对定量P C R检测i-N O S基因的表达,格里斯法检测一氧化氮(N O)的表达结果,E L I S A检测I L-12㊁T N F-α㊁I L-10的表达结果㊂结果色素型分生孢子和其色素颗粒能够降低巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(I-N O S)基因的表达和抑制一氧化氮的合成(P<0.05)㊂提高T h2细胞因子表达,同时抑制T h1细胞因子表达(P<0.05)㊂结论黑色素可能是F o n s e c a e a m o n o p h o r a逃避巨噬细胞对其氧化应激的重要机制㊂同时黑色素下调T h1免疫应答,可能利于真菌的持续感染㊂ʌ关键词ɔ黑色素;F o n s e c a e a m o n o p h o r a;一氧化氮;I L-12;I L-10;T N F-αʌ中图分类号ɔ R379.9ʌ文献标志码ɔ A ʌ文章编号ɔ1673-3827(2021)16-0077-07S t u d y o n t h e p a t h o g e n e s i s o f m e l a n i n i n F o n s e c a e a m o n o p h o r aW a n g L i,W a n g W e i(D e p a r t m e n t o f D e r m a t o l o g y,A f f i l i a t e d H a i k o u H o s p i t a l o f X i a n g y a M e d i c a l C o l l e g e,C e n t r a l S o u t h U n i v e r s i t y, H a i k o u570208,C h i n a)ʌA b s t r a c tɔO b j e c t i v e T o k n o w w h e t h e r m e l a n i n c o n t r i b u t e s t o d i s e a s e p a t h o g e n e s i s o f F o n s e c a e a m o n o p h o r a.M e t h o d s I n t h i s s t u d y,o n e a l b i n o m u t a n t(C B S125149)w a s g e n e r a t e d f r o m a p a r e n t m e r i s t e m a t i c m u t a n t(C B S122845)o f F o n s e c a e a m o n o-p h o r a.T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y(T E M)p r o f i l e s s h o w e d t h a t m e l a n i n i n t h e p a r e n t s t r a i n s a p p e a r e d a s e l e c t r o n-d e n s e g r a n u l e s w h i c h l o c a t e d o n t h e c e l l w a l l s u r f a c e.T h e c e l l w a l l f r a c t i o n s f r o m t h e t w o d i f f e r e n t s t r a i n s w e r e e x t r a c t e d b y a n a l k a l i-a c i d m e t h o d.T h e d i f f e r e n t s t r a i n s o r i t s c e l l w a l l f r a c t i o n s w e r e i n t e r a c t e d w i t h t h e a c t i v a t e d R AW264.7.G e n e e x-p r e s s i o n o f i-N O S g e n e w a s d e t e c t e d b y r e a l t i m e P C R.E x p r e s s i o n o f n i t r i c o x i d e(N O)w a s d e t e c t e d b y G r i e s s m e t h o d. O t h e r w i s e,e x p r e s s i o n r e s u l t s o f I L-12,T N F-α,I L-10w a s d e t e c t e d b y E L I S A.R e s u l t s T h e p i g m e n t e d s t r a i n a n d i t s c e l l w a l l f r a c t i o n c o u l d r e d u c e t h e e x p r e s s i o n o f i n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e(i-N O S)g e n e a n d i n h i b i t t h e s y n t h e s i s o f n i t r i c o x i d e(N O)i n v i t r o(P<0.05).A n e x a c e r b a t e d T h2r e s p o n s e a n d i n h i b i t e d T h1r e s p o n s e o c c u r r e d i n t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n a c t i v a t e d R AW264.7w i t h t h e p i g m e n t e d s t r a i n o r i t s c e l l w a l l f r a c t i o n.C o n c l u s i o n O u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t m e l a n i n p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n f u n g a l e s c a p i n g f r o m t h e o x i d a t i v e b u r s t o f m a c r o p h a g e s.M e l a n i n c a u s e s a n e g a t i v e l y T h1i mm u n e r e-s p o n s e a n d f a v o r s t h e p e r s i s t e n c e o f t h e f u n g a l i n f e c t i o n.ʌK e y w o r d sɔ m e l a n i n;F.m o n o p h o r a;n i t r i c o x i d e;I L-12;I L-10;T N F-α[C h i n J M y c o l,2021,16(2):77-83]着色芽生菌病(c h r o m o b l a s t o m y c o s i s,C B M)是一种慢性皮肤和皮下组织肉芽肿性真菌病[1,2]㊂作者简介:王丽,女(汉族),硕士,主治医师.E-m a i l:892724685@ q q.c o m通信作者:王薇,E-m a i l:305116961@q q.c o m 该病顽固难治㊁复发率高,通常局限于皮肤和皮下组织,表现为慢性疣状㊁结节状或菜花状肉芽肿性皮肤病变㊂晚期可经淋巴管血管播散,致畸致残,甚至在慢性溃疡的基础上发生鳞状细胞癌,严重威胁人类身心健康[3]㊂㊃77㊃中国真菌学杂志2021年4月第16卷第2期 C h i n J M y c o l,A p r i l2021,V o l16,N o.2黑色素是多数病原真菌的重要毒力因子,例如白念珠菌㊁隐球菌㊁孢子丝菌㊁组织胞浆菌和曲霉等㊂其具有极强的抵御外来离子辐射㊁氧化条件变化㊁极度温度更替和p H值改变的作用[4]㊂此外黑色素还担负着增强致病真菌侵袭毒力和诱生真菌耐药性的作用,导致人体免疫防御反应性降低和抗真菌药物耐药性升高[5]㊂目前关于F.m o n o p h o r a 致病性研究相对缺乏㊂本研究通过建立不同菌株㊁细胞壁色素颗粒与小鼠巨噬细胞共培养体系,测定一氧化氮合酶基因㊁亚硝酸盐浓度㊁T h1㊁T h2细胞因子的表达,探讨黑色素是否为F.m o n o p h o r a重要毒力因素,是否在巨噬细胞与F.m o n o p h o r a免疫反应中起到相关作用㊂1材料和方法1.1菌种来源实验菌株由中山大学孙逸仙纪念医院真菌室提供,分离自81岁男性患者的皮损㊂该菌株经形态学及I T S序列检测为F.m o n o p h o r a,是1株分生孢子变异株,编号为C B S122845,在S D A培养基上,转种10余次产生其白色突变株(C B S125149)㊂1.2透视电镜观察两株菌使用无菌接种针从马铃薯斜面培养基(P D A)表面,将C B S122845,C B S125149剥离下来,放置存有P B S的试管中,用无菌玻璃吸管反复轻轻吹打菌落,制备菌悬液㊂以10000r/m i n,离心10 m i n去上清液,加入3%戊二醛固定,储存于4ħ至广州市陆军总医院电镜室制样㊁观察㊂1.3酸碱法提取F.m o n o p h o r a细胞壁色素颗粒使用无菌接种针从马铃薯斜面培养基(P D A)表面,将C B S122845,C B S125149剥离下来,放入存有0.5m o l/L N a O H的50m L离心管中,涡旋混匀10m i n,在低温摇床上震荡过夜㊂以10000 g,离心10m i n,取上清液㊂用1m o l/L H C L将上清液的p H值调至1.5㊂以5000g,离心10m i n,去沉淀,用双蒸水反复冲洗,离心后沉淀3~5遍后㊂将沉淀重悬于0.1m o l/L H C L溶液中,用0.1m o l/L H C L反复冲洗,离心后沉淀3~5遍后,直至上清液清亮无色㊂取沉淀,溶于0.1m o l/ L H C L中,用双蒸水透析,将装有透析液的离心管放置-80ħ冰箱过夜,隔日用冷冻干燥机将透析液冻干,将冻干粉储存于-20ħ冰箱将从C B S122845提取的细胞壁颗粒命名为 F1 ,将从C B S125149提取的细胞壁颗粒命名为 F0 ,将上述冻干粉置于0.5m o l/L N a O H溶液中,用1m o l/L H C L中和溶液p H值,至p H值调至6~7之间,冻干粉完全溶解㊂再加入P B S缓冲液,将F1/F0浓度调至5μg/m L㊁10μg/m L㊁20μg/m L㊁50μg/m L㊂1.4共培养的建立小鼠单核-巨噬细胞系R AW264.7细胞购自武汉大学中国典藏物保存中心(C C T C C)㊂R AW264.7细胞经培养传代2~3次状态稳定后,用含E D T A的0.25%胰酶消化,以6ˑ105/ m L密度转至六孔板,每孔板1.8m L,加用50U/ m L I F N-γ㊁100n g/m L L P S预刺激细胞,将六孔板置于含5%C O237ħ培养箱24h后㊂根据实验分组在每培养孔加入分生孢子悬液或F1/F0溶液共200μL(其中分生孢子与巨噬细胞的数目比例均为5ʒ1)轻轻摇匀,置于培养箱培养24h㊂实验分组(Ⅰ)R AW264.7与F1共培养; (Ⅱ)R AW264.7与F0共培养;(Ⅲ)R AW264.7与C B S122845共培养;(Ⅳ)R AW264.7与C B S125149共培养;(Ⅴ)R AW264.7与C B S125149及F1共培养㊂对照组培养液中只含有R AW264.7,未添加任何分生孢子及色素颗粒㊂1.5实时荧光相对定量P C R检测i-N O S基因的表达主要试剂、仪器 R N A提取试剂㊁逆转录试剂盒㊁S Y B R P r e m i x E X T a q T M I I荧光R e a l-T i m e P C R试剂盒都购自T a K a R a公司㊂R e a l t i m e-P C R仪(L i g h t C y-c l e r480)㊂引物合成由T a K a R a 公司完成:i-N O S的引物:扩增产物长度为185b p,上游引物:5 -C A A G C T G A A C T T G A G C G A G-G A-3 ,下游引物:5 -T T T A C T C A G T G C C A G A A G C T G G A-3 ;内参照β-a c t i n的引物:扩增产物长度为171b p,上游引物:5 -C A T C C G T A-A A G A C C T C T A T G C C A A C-3 ,下游引物:5 -A T G G A G C C A C C G A T C C A C A-3S Y B R G r e e n R e a l-t i m e P C R法检测i-N O S基因的表达 ①组织总R N A的提取和c D N A的合成:各组培养的细胞弃上清,并以P B S冲洗2遍,每孔加T r i z o l1m L,严格按照说明书操作提取组织总R N A,用紫外分光光度仪测定其纯度,D (260)/D(280)值在1.8~2.1之间,之后进行逆转㊃87㊃中国真菌学杂志2021年4月第16卷第2期 C h i n J M y c o l,A p r i l2021,V o l16,N o.2录,按照逆转录试剂盒说明操作,每10μL反应体系中加入500n g总R N A,反应体系为20μL,反转录条件:37ħ,15m i n;85ħ,5s;4ħ㊂反应后c D N A置于-20ħ冰箱保存备用㊂②S Y B R实时荧光定量P C R及数据处理:应用L i g h t C y-c l e r480实时荧光定量P C R仪检测i-N O S基因相对表达量,按照T A K A R A荧光定量P C R试剂盒操作说明进行,20μL P C R反应体系:其中c D N A含量为2μL,反应条件为95ħ预变性30s;P C R反应40个循环,95ħ5s,60ħ20s㊂循环结束后,绘制溶解曲线95ħ1m i n,65ħ15s;降温37ħ30s㊂由L i g h t C y c l e R e a l-T i m e P C R软件自动记录荧光曲线并分析计算出C t值㊂采用相对定量2-әәc t法计算目的基因的相对表达量,根据以下公式计算:әәC t=(C t目的基因-C t内参基因)未知样本组-(C t目的基因-C t内参基因)对照组,以β-a c t i n作为内参,以2-әәC T法分析进行组间相对定量分析㊂统计学分析应用S P S S16.0统计软件,各组数据以均数ʃ标准差( xʃs)表示采用两组独立样本t检验,比较R AW264.7与一定浓度的F1/ F0反应中所表达一氧化氮合酶基因的差异;比较R AW264.7与C B S125149体系中添加不同浓度F1,所表达一氧化氮合酶基因的差异㊂P<0.05具有统计学意义㊂1.6格里斯法检测一氧化氮(n i t r i c o x i d e,N O)的表达采用格里斯法测定不同培养体系亚硝酸盐和硝酸盐(N O2-/N O3-)的总量来计算一氧化氮的表达㊂实验方法参照一氧化氮测试盒(B i o a s s a y S y s-t e m s,D2N O-100,美国)㊂整个实验严格按说明书进行操作㊂MK3全自动酶标仪(德国生产)在492 n m波长处测定吸光度值,根据标准曲线和每个样本的吸光度值计算其含量,样品浓度计算如下: [N i t r i t e a n d n i t r a t e]=(O D S AM P L E-O D-B L A N K)/S l o p e(μm o l/L),O D S AM P L E和O D-B L A N K分别是样品和水的吸光值㊂统计学分析以上实验均重复3次,数据用( xʃs)表示,使用S P S S16.0统计学软件进行数据分析㊂采用方差分析(A N O V A),多个样本均数两两比较的t检验,P<0.05为差异有统计学意义㊂1.7 E L I S A检测I L-12㊁T N F-α㊁I L-10的表达E L I S A检测不同培养体系R AW264.7细胞I L-12㊁T N F-α㊁I L-10的表达采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验,参照E L I S A检测试剂盒(R a y-B i o t e c h,美国),整个实验严格按说明书进行操作㊂MK3全自动酶标仪德国生产在450n m波长处测定吸光度值,根据标准曲线和每个样本的吸光度值计算其含量㊂统计学方法以上实验均做3个复孔,数据用均数ʃ标准差表示,使用S P S S16.0统计学软件进行数据分析㊂采用方差分析(A N O V A),多个样本均数两两比较的t检验,P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1 C B S122845㊁C B S125149大培养㊁显微电镜㊁透视电镜下形态,提取的色素颗粒形态将C B S122845㊁C B S125149接种于P D A培养基,26ħ培养箱培养13~15d后,C B S122845生长成黑色菌落,C B S125149生长成白色菌落㊂两株菌菌落均表现为干燥㊁堆积㊁质脆㊂C B S122845菌落表面较为粗糙,C B S125149较为光滑(见图1a㊁b)㊂C B S122845生长较C B S125149较慢㊂倒置显微镜下观察,C B S122845分生孢子相对于C B S125149分生孢子个体较大,排列较紧密(见图1c㊁d)㊂透视电镜下观察,C B S122845细胞壁表面存在致密颗粒,但C B S125149缺乏这类颗粒,表面光滑(见图1e㊁f)㊂通过酸碱法,我们提取了C B S122845分生孢子细胞壁成分 F1 ,提取C B S125149分生孢子细胞壁成分 F0 ㊂ F1 呈黑色, F0 呈白色(见图1g㊁h)㊂2.2实时荧光相对定量P C R检测i-N O S基因的表达结果实时荧光定量P C R溶解曲线分析见图2a, R AW264.7细胞中目的基因i-N O S的表达结果见图2b㊁c㊂以R AW264.7细胞(50U/m L I F N-γ㊁100 n g/m L L P S预刺激24h后)i-N O S m R N A表达为基点,设为1㊂不同浓度细胞壁色素颗粒F1/F0与激活状态的R AW264.7细胞共培养,F1组(10μg/m L㊁20μg/m L)与F0组(10μg/m L㊁20μg/ m L)相比, F1 能显著降低R AW264.7细胞一氧化氮合酶基因的表达㊂同一浓度下,两组之间进行比较,差异具有统计学意义㊂且当 F1 浓度调整为10μg/m L时,R AW264.7细胞一氧化氮合酶基㊃97㊃中国真菌学杂志2021年4月第16卷第2期 C h i n J M y c o l,A p r i l2021,V o l16,N o.2图1a.C B S122845大培养形态;b.C B S125149大培养形态;c.C B S122845倒置显微镜下形态;d.C B S125149倒置显微镜下形态;e.C B S122845透视电镜下形态;f.C B S125149透视电镜下形态;g. F1 冻干粉;h. F0 冻干粉图2a.目的基因i-N O S㊁内参基因β-a c t i n r e a l-t i m e P C R产物的溶解曲线图;b.不同浓度细胞壁色素颗粒F0/F1与激活状态的R AW264.7细胞共培养,R AW264.7细胞中目的基因i-N O S的表达;c.C B S125149及不同浓度F1与激活状态的R A W264.7细胞三者共培养㊂R A W264.7细胞中目的基因i-N O S的表达F i g.1 a.C B S122845c u l t u r e s f o r2w e e k s a t26ħ;b.C B S125149c u l t u r e s f o r2w e e k s a t26ħ;c.L i g h t m i c r o s c o p i c a p p e a r a n c e o f C B S122845;d.L i g h t m i c r o s c o p i c a p p e a r a n c e o f C B S125149;e.T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f C B S122845;f.T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f C B S125149;g.T h e c e l l w a l l f r a c t i o n F1 f r o m C B S122845;h.T h e c e l l w a l l f r a c t i o n F0 f r o m C B S125149F i g.2a.T h e d i s s o l u t i o n c u r v e s o f t a r g e t g e n e i-N O S a n d i n t e r n a l r e f e r e n c e g e n eβ-a c t i n r e a l-t i m e P C R p r o d u c t s;b.E x p r e s s i o n s o f i-N O S g e n e i n t h e a c-t i v e d R AW264.7i n t e r a c t e d w i t h t h e c e l l w a l l f r a c t i o n F0/F1.T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e c e l l w a l l f r a c t i o n F0/F1w a s a d j u s t e d t o5μg/m L,10μg/m L,20μg/m L,a n d50μg/m L;c.E x p r e s s i o n s o f i-N O S g e n e i n t h e a c t i v e d R AW264.7i n t e r a c t e d w i t h C B S125149s u p p l e m e n t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n o f F1.T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e c e l l w a l l f r a c t i o n F1w a s a d j u s t e d t o5μg/m L,10μg/m L,20μg/m L,a n d50μg/m L因的表达量受抑制程度达到最低㊂白色突变株C B S125149与R AW264.7细胞共培养,i-N O S基因相对值为9.64ʃ0.99,在该共培养体系中,添加不同浓度色素颗粒F1,随着F1浓度从5μg/m L 逐渐升至50μg/m L,R AW264.7细胞i-N O S基因的表达量逐步下降㊂2.3格里斯法检测一氧化氮的表达结果由于N O化学性质不稳定,本次实验通过测量N O2-/N O3-总浓度以评估N O释放量㊂实验结果显示,对比于白色突变株C B S125149,色素株C B S122845与R AW264.7细胞反应,能显著抑制R AW264.7细胞产生N O(P<0.05)㊂对比于 10μg/m L F0 ,10μg/m L色素颗粒 F1 能显著抑制R AW264.7细胞产生N O(P<0.05)㊂在白色突变株与R AW264.7细胞反应体系中,加入10μg/ m L色素颗粒 F1 后,R AW264.7细胞N O的释放量出现明显下调(P<0.05)(见表1)㊂2.4 E L I S A检测I L-12㊁T N F-α㊁I L-10的表达结果实验结果见图3,对比白色突变株C B S125149㊁色素株C B S122845与R AW264.7细胞反应,能显著抑制R AW264.7细胞产生I L-12㊁㊃08㊃中国真菌学杂志2021年4月第16卷第2期 C h i n J M y c o l,A p r i l2021,V o l16,N o.2表1各组R AW264.7细胞共培养体系上清液中,亚硝酸盐和硝酸盐浓度的总表达量T a b.1 N i t r i t e a n d n i t r a t e c o n c e n t r a t i o n s a f t e r f u n g a l o r p i g m e n t a l f r a c t i o n i n t e r a c t i o n w i t h R AW264.7实验分组(与R AW264.7细胞共培养)亚硝酸盐和硝酸盐浓度(μm o l/L)10μg/m L浓度的 F1 1.95ʃ1.7210μg/m L浓度的 F0 23.57ʃ3.32C B S1*******.29ʃ0.88C B S1*******.07ʃ1.23C B S125149+10μg/m L浓度的 F1 6.08ʃ0.78*以上实验均重复3次,数据用 xʃs表示T N F-α,上调其产生I L-10(P<0.05)㊂对比10μg/m L细胞壁颗粒 F0 ,10μg/m L细胞壁色素颗粒 F1 能抑制R AW264.7细胞产生I L-12,上调其产生I L-10(P<0.05)㊂在白色突变株与R AW264.7细胞反应体系中,加入10μg/m L色素颗粒 F1 后,R AW264.7细胞的I L-12㊁T N F-α释放量出现明显下调,I L-10释放量出现明显上调(P <0.05)㊂3讨论F.m o n o p h o r a属于着色霉属的真菌,是近年从裴氏着色霉中分出的新种,是中国南方着色真菌病的主要病原体㊂其临床表现多样,如化脓㊁结节㊁斑块㊁疣状及肿瘤样损害㊂慢性病程可持续数年或数十年㊂可因疤痕形成而致残,甚至丧失劳动能力,久治不愈可发展为鳞癌[6],甚至可引起其他类型感染(如颅内感染[7,8]㊂F.m o n o p h o r a的发病机制目前仍不清楚㊂细胞壁成分是着色芽生菌病中真菌持续和增殖的关键因素,也是肉芽肿病变发展的重要刺激因素[9,10]㊂F o n s e c a e a的细胞壁成分主要由β-1-3-葡聚糖㊁几丁质㊁α-1-3-葡聚糖㊁半乳甘露聚糖㊁大部分蛋白质和黑色素[11]组成㊂黑色素是一类常见于微生物和动植物体内的高分子量㊁非均质㊁结构复杂的聚合体,通常分为细胞壁和细胞外黑色素两种[12,13]㊂依据合成途径不同,黑色素又分为D H N-黑色素和D O P A-黑色素两种㊂D H N-黑色素由前体物质1,8-二羟基萘(D HN)经过氧化聚合而成,多见于子囊菌纲和半知菌纲真菌,如构巢曲霉㊁黑曲霉㊁烟曲霉㊁卡氏枝孢霉㊁甄氏外瓶霉㊁紧密着色霉㊁裴氏着色霉㊁圆酵图3a.不同菌株㊁细胞壁色素颗粒与激活状态的R AW264.7细胞共培养,上清液中I L-12的表达量;b.不同菌株㊁细胞壁色素颗粒与激活状态的R AW264.7细胞共培养,上清液中T N F-α的表达量;c.不同菌株㊁细胞壁色素颗粒与激活状态的R AW264.7细胞共培养,上清液中I L-10的表达量F i g.3a.I L-12p r o d u c t i o n,a s m e a s u r e d i n t h e s u p e r n a t a n t o f t h e f o l l o w i n g c u l t u r e s;b.T N F-αp r o d u c t i o n,a s m e a s u r e d i n t h e s u-p e r n a t a n t o f t h e f o l l o w i n g c u l t u r e s;c.I L-10p r o d u c t i o n,a s m e a s-u r e d i n t h e s u p e r n a t a n t o f t h e f o l l o w i n g c u l t u r e s母样亨德逊霉㊁孢子丝菌等㊂D O P A-黑色素以酪氨酸为底物,经漆酶(酚氧化酶)的氧化作用,最后㊃18㊃中国真菌学杂志2021年4月第16卷第2期 C h i n J M y c o l,A p r i l2021,V o l16,N o.2聚合形成D O P A-黑色素,见于白念珠菌㊁组织胞浆菌㊁新生隐球菌等[14,15]㊂R o m e r o-M a r t i n e z等[16]对D H N-黑色素合成途径中P K S缺陷的孢子丝菌m e l14的研究认为,黑色素在抵抗紫外线㊁亚硝酸盐和过氧化氢等应激方面发挥重要作用㊂此外许多研究表明,黑色素可以阻碍机体免疫系统反应性氧族(R O S)的生成并抵抗巨噬细胞的吞噬作用,与病原真菌的致病力关系密切[17-19]㊂瓜类炭疽病菌㊁稻瘟病病菌的黑色素能促使附着胞膨胀压的产生,有利于真菌渗透进入植物的叶从而感染[17,18]㊂对巴西副球孢子菌的研究也表明黑色素有利于菌体抗巨噬细胞的吞噬并增强其对药物的抵抗性[22]㊂G a r c i a-R i v e r a等[23]对新生隐球菌的研究表明,黑色素能改变隐球菌细胞表面电荷而抵制宿主细胞对隐球菌的吞噬㊂这些研究均提示黑色素是多数病原真菌的毒力因子㊂但对于着色霉,黑色素的致病性研究较缺乏㊂巨噬细胞作为一种极其重要的固有免疫细胞,在抵抗着色霉属真菌感染中发挥着重要作用㊂以往研究认为巨噬细胞不能直接杀灭着色真菌菌体,但可通过氧化应激氧化应激对菌体生长起抑制作用,抑制出芽管及菌丝的形成[24]㊂N O及活性氮媒介与金属离子结合㊁与芳香残基的亲核中心结合,硝基化反应及亚硝基化反应,从而对一系列蛋白进行修饰来完成复杂的调节功能[25]㊂使c GM P增加,从而影响细胞的信号传导系统[26,27];调节氧耗量和A T P的产量,影响线粒体功能,控制细胞的凋亡[28,29];调节通道蛋白㊁结构蛋白㊁转录因子㊁激酶及许多代谢相关的酶的表达[30,31]㊂目前,在真菌学方面,R N I研究相对缺乏㊂相关研究认为N O可延迟真菌分生孢子的出芽过程[32]㊂本研究通过R e a l-t i m e P C R方法对不同实验组R AW264.7细胞中i-N O S基因表达进行相对定量分析㊂结果显示,10μg/m L㊁20μg/m L F1 能显著降低R AW264.7细胞i-N O S基因的表达,当 F1 浓度调整为10μg/m L时,R AW264.7细胞i-N O S基因的表达量最低㊂在白色突变株C B S125149与R AW264.7细胞共培养体系中添加不同浓度色素颗粒F1,随着F1浓度从5μg/m L 逐渐升至50μg/m L,R AW264.7细胞i-N O S基因的表达逐步下降㊂上述结果均表明色素颗粒可抑制R AW264.7细胞i-N O S基因的表达㊂此外,本研究通过格里斯法检测N O表达,发现色素株及细胞壁色素颗粒能抑制R AW264.7细胞N O的生成㊂在白色突变株C B S125149与R AW264.7细胞共培养体系中添加10μg/m L色素颗粒F1, R AW264.7细胞N O的释放量出现明显下调㊂我们的数据表明,当F.m o n o p h o r a入侵机体时,细胞壁色素颗粒可对菌体产生保护作用,在与巨噬细胞相互作用过程中,能下调i-N O S基因㊁抑制巨噬细胞产生N O,从而抵御巨噬细胞对F.m o n o p h o-r a氧化应激作用,使F.m o n o p h o r a逃逸巨噬细胞氧化杀伤作用㊂黑色素能够抵抗N O的免疫破坏㊂这一过程有利于真菌在组织中的持续存在,并负向调节宿主的免疫反应㊂此外,着色芽生菌病的皮损内常见的免疫细胞是C D4+T细胞㊁C D8+T细胞,B淋巴细胞和许多巨噬细胞[33]㊂研究显示,在C B M病情严重的患者中可观察到I L-10水平升高而I F N-γ水平降低,同时体外刺激并不出现T细胞增殖,反之,在病情轻的患者产生高水平I F N-γ和低水平I L-10,同时体外刺激可见T细胞增殖反应[34,35]㊂着色芽生菌病的严重程度与机体内T h1㊁T h2免疫反应的平衡程度有密切关系,机体对菌体的杀伤作用依赖于加强T h1㊁抑制T h2免疫反应,反之,菌体的生长与增殖依赖于抑制T h1㊁加强T h2免疫反应㊂L S P㊁I F N-γ就可刺激巨噬细胞合成细胞因子如I L-10㊁T N F-α㊁I L-12等,调节巨噬细胞对微生物的杀伤作用㊂研究认为宿主细胞对真菌的杀伤抑制效应,依赖于T h1细胞免疫㊂在抵御多数真菌,如组织胞浆菌[36]㊁新生隐球菌[37]㊁白念珠菌[38]的免疫反应中,T h1细胞因子被认为是抑制菌体生长㊁协同氧化杀伤菌体的调节因子㊂本实验测定了T h1细胞因子T N F-α㊁I L-12以及T h2细胞因子I L-10㊂结果发现色素株及色素颗粒能下调R AW264.7细胞表达T N F-α㊁I L-12,上调R AW264.7细胞表达I L-10细胞因子㊂这些实验结果可能揭示了F.m o n o p h o r a色素能下调机体T h1细胞免疫,上调T h2细胞免疫㊂这些数据表明,黑色素在体外抑制T h1反应,加重T h2反应㊂这一过程表明,C B M的严重程度可能与黑色素密切相关㊂综上所述,黑色素是F.m o n o p h o r a的重要致病因子㊂黑色素是F.m o n o p h o r a逃脱巨噬细胞氧化爆发的重要成分㊂黑色素抑制T h1反应和加剧T h2反应,有利于真菌的持续感染㊂㊃28㊃中国真菌学杂志2021年4月第16卷第2期 C h i n J M y c o l,A p r i l2021,V o l16,N o.2参考文献[1]M i n o t t o R,B e r n a r d i C D,M a l l m a n n L F,e t a l.C h r o m o b l a s-t o m y c o s i s:A r e v i e w o f100c a s e s i n t h e s t a t e o f R i o G r a n d ed o S u l B r a z i l[J].J A m A c a d De r m a t o l,2001,44(4):585-592.[2]D i x o n D M,P o l a k-W y s s A.T h e m e d i c a l l y i m p o r t a n t d e m a t i-a c e o u s f u n g i a n d t h e i r i d e n t i f i c a t i o n[J].M y c o s e s,1991,34(1-2):1-18.[3]Lóp e z M a r tín e z R,Mén d e z T o v a r L J.C h r o m o b l a s t o m y c o s i s[J].C l i n D e r m a t o l,2007,25(2):188-194.[4]E i s e n m a n H C,C a s a d e v a l l A.S y n t h e s i s a n d a s s e m b l y o ff u ng a l m e l a n i n[J].A p p l M i c r o b i o l B i o t e 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中南大学湘雅医学院附属海口医院
2014届硕士研究生学位论文答辩会
一、
（一）论文题目：AQP4-RNAi治疗脑创伤半暗带的病理分子机制与多模态磁共振成像的实验研究
学科专业：影像医学与核医学
答辩人：李利锋
指导教师：鲁宏教授
（二）论文题目：Carbogen气体刺激BOLD成像和PWI成像在评估经门脉微囊移植后肝组织缺血缺氧水平的应用价值
学科专业：影像医学与核医学
答辩人：周赞赞
指导教师：韩向君教授
二、答辩委员会成员
主席肖恩华教授中南大学湘雅二医院
委员涂蓉教授海南医学院第一附属医院
秦将均教授海南省农垦三亚医院
夏鹰教授湘雅医学院附属海口医院
张剑权教授湘雅医学院附属海口医院秘书战跃福主治医师湘雅医学院附属海口医院
三、时间：2017年5月27日上午9：00
地点：放射科示教室（1号楼1楼）
欢迎研究生同学参加、欢迎同行专家莅临指导！。