青藏高原特有昆虫-草原毛虫生殖行为研究
高寒牧区机械防控草原毛虫试验
高寒牧区机械防控草原毛虫试验随着草原虫害专业化统防统治工作的不断推进，传统的小型背负式喷雾器械已经不能满足快速发展的专业化防治需求，为了适应草原虫害防治专业化趋势，作业效率高、防治效果好，适用范围广，节水、节药环保型，用工少的大中型植保机械和农业航空植保得到了快速发展。
草原毛虫(Gynaepheraqinghaiensis)属鳞翅目(Lepidoptera)DU蛾科(Lymantriidae)草原毛虫属(Gynaephora)，是青藏高原草地上的特有危害虫种，在XX省高寒草甸草地上均有分布，为害面积占全省草地虫害面积的73%以上，重度为害区在省内三江源地区，其中XX县是全省草原毛虫的重发区和常发区。
通过采用无人机、直升飞机与大型器械等现代化器械防治草原毛虫的示范研究，将为高寒牧区草地虫害的有效治理和草地生态保护以及草地畜牧业的可持续发展开辟一条有效途径，从而为高寒牧区大面积防治草地虫害提供先进、可靠的技术支撑。
为此，我们在青XX部的XX县进行了先进器械防控毛虫研究，现简报如下，供参考。
1试验地概况试验区选择在黄南州XX县优干宁镇的天然草地，海拔3600m 左右，地势较为平坦。
气候属高原亚寒带湿润气候区，年均气温在9．2～14．6℃，年降水量597．1～615．5mm。
草地植被为高寒草甸类。
试验区在优干宁镇的南旗、阿木乎、参玛、德日隆和泽雄村。
草原毛虫平均密度90．6头/m2，最高密度237头/m2，为害较为严重，防控期多为3～4龄期。
2器械与药剂2．1器械与设备XF615六轴无人机、MG1S八轴无人机、AS－350直升飞机、AJ－401大型牵引喷雾器以及GPS、抽水泵、拉水车、配药灌、车辆通讯工具、界旗、观测设备等物资。
2．2药剂2%噻虫啉微囊悬浮剂，由XX天人生态有限责任公司提供。
3试验研究方法防治前调查各防治区草原毛虫的虫口密度。
于20XX年7月通过采用XF615六轴无人机、MG1S八轴无人机、AS－350直升机、巴西AJ－401大型器械防治。
草原毛虫雌蛾性信息素粗提物对雄蛾引诱效果研究
Ｅｆ ｆｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｆ ｆ ｅ ｍａ ｌ ｅ’ Ｓ ｓ ｅ ｘ ｐ ｈｅ ｒ ｏ ｍｏ ｎ ｅ ｏ ｆ Ｇｙ ｎ ａ ｅ ｐ ｈｏ ｒ ａ ａ ｌ ｐ ｈｅ ｒ ａ ｋ ｉ ｉ ｏ ｎ ａ ｔ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ ｍａ ｌ ｅ ｍｏ ｔ ｈ
ａ ｔ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｄ ｅ ｈｅ ｔ ｌ ｏ ｗｅ ｓ ｔ ．Ｍｅ ｎｗ ａ ｈ ｉ ｌ ｅ ．ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｗａ ｓ ａ ｃ ｉ ｔ ｅ ａ ｄ ｉ ａ ｎ ｒ ｈ ｙ ｈ ｍ ｔ ｉ ｎ ｄ ｉ ｅ ｔ ｈ ｙ ｌ ｅ ｔ ｈ ｅ ｒ ’ ｓ ｅ ｘ ｒ ｔ ａ ｃ ｉ ｔ ｏ ｎ ｔ ｅ ｓ ｔ ，ｔ ｈ ｅ ｎ ｕ ｍｂ ｅ ｒ ｏ ｆ ａ ｔ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｓ ｓ ｉ ｇ ｎ ｉ ｉ ｆ ｃ ｎｔ ａ ｌ ｙ
１ ０
青 海畜 牧兽 医 杂志
２ ０ １ ５年第 ４ ５卷 第 ３期 （ 总第 ２ ３ 引诱效果研究
鲍根 生 ， 王 宏 生
（ 青 海省 畜牧兽 医科 学院 ， 西宁， ８ １ ０ ０ １ ６ ）
摘 要： 草原毛虫 （ Ｇ ｙ ｎ ａ ｅ ｐ ｈ ｏ ｒ ａ ａ ｌ ｐ ｈ ｅ ｒ ａ ｋ ｉ ｉ ） 属 鳞 翅 目（ Ｌ ｅ ｐ ｉ ｃ ｉ ｏ ｐ ｔ ｅ ｒ ａ ） 、 毒蛾科 （ Ｌ ｙ ｍ ａ ｎ Ｌ ｄ ｉ ｄ ａ ｅ ） 、 草 原毛虫 属 （ Ｇ ｙ ｎ ａ ｅ ｐ ｈ ｏ ｒ ａ ） 的 昆虫 ， 是青藏高原高寒草甸危害最严重的重大害虫。 草 原 毛 虫 雌 蛾 具 有 原 地 释 放 性 信 息 素 引诱 雄 蛾交 配 的 特 点 。基 于 此 本 研究通过乙醚 、 乙酸乙酯 、 甲醇 和 二 氯 甲烷 四种 有 机 溶 剂 粗 取 草 原 毛虫 性 信 息 素 ， 并 检 测 四 种性 信 息 素 粗 油 在 野 外 环境 下 对 雄 蛾 的 引诱 效 果 。结 果 表 明 ： 四种 有 机 溶 剂 的性 信 息素 粗 提 物 对 雄 蛾 的 引诱 效 果 存 在 差 异 ， 表现为 ： 乙 醚粗 油 ＞ 乙 酸 乙 酯 粗油＞ 二 氯 甲烷粗 油＞ 甲 醇粗 油 。同时 ， 引诱 效 果 最 佳 的 乙 醚粗 油对 草 原 毛虫 雄 蛾 引诱 效 果 存 在 节 律 性 ， １ １ ： ３ ０和 １ ５ ： ３ ０出 现 两个高峰 ， 显著高于其他时 间的 引诱数量（ ． ０ ５ ） 。由此可见 ， 草原毛虫雌蛾 乙醚性信 息素粗油对 草原毛虫雄蛾具有 良好 的 引诱 作 用 ， 有 望 成 为 草 原 毛 虫 生 物 防 治 的 新 方法 。 关键 词 ： 草原毛虫 ； 性信息素 ； 粗油 ； 引诱 ；
211014134_青海草原毛虫气味结合蛋白基因与生物信息学分析
第31卷 第3期V o l .31 No .3草 地 学 报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2023年 3月M a r . 2023d o i :10.11733/j.i s s n .1007-0435.2023.03.008青海草原毛虫气味结合蛋白基因与生物信息学分析南彦斌,张 月,何啟玥,陈 帅,周渊涛*(青海大学农牧学院,青海西宁810016)摘要:青海草原毛虫(G y n a e p h o r a q i n g h a i e n s i s )是危害青藏高原高寒草甸最重要的害虫之一㊂本研究通过第二代高通量测序技术对青海草原毛虫4龄幼虫㊁雌雄成虫进行转录组测序并进行基因功能注释,同时筛选获得其气味结合蛋白基因(G qi n O B P s )并进行生物信息学分析㊂结果表明:转录本经过组装之后总计得到63335条u n i g e n e s ,在全部u n i g e n e s 中筛选并鉴定出17个G q i n O B P s 基因,通过生物信息学分析发现这些气味结合蛋白为热稳定性蛋白,亚细胞定位主要在胞外,二三级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成,多序列比对显示G q i n O B P s 具有昆虫O B P s 的半胱氨酸模式识别序列;系统分析表明,G q i n O B P s 基因与同是鳞翅目昆虫的桃蛀螟㊁小线角木蠹蛾和沙棘木蠹蛾亲缘关系较近㊂该研究首次公开并分析青海草原毛虫转录组数据,同时挖掘出其气味结合蛋白基因,为进一步研究青海草原毛虫的基因功能奠定基础㊂关键词:青海草原毛虫;转录组测序;气味结合蛋白;生物信息学分析;系统发育树中图分类号:Q 943 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2023)03-0688-11B i o i n f o r m a t i c sA n a l y s i s o n t h eO d o r a n t B i n d i n g Pr o t e i nG e n e s i n G y n a e p h o r a q i n gh a i e n s i s N A N Y a n -b i n ,Z H A N G Y u e ,H E Q i -yu e ,C H E NS h u a i ,Z H O U Y u a n -t a o *(S c h o o l o fA g r i c u l t u r e a n dA n i m a lH u s b a n d r y ,Q i n g h a iU n i v e r s i t y ,X i n i n g ,Q i n gh a i P r o v i n c e 810016,C h i n a )A b s t r a c t :T h e G y n a e p h o r a q i n gh a i e n s i s i so n eo f t h em o s th a r m f u l p e s t s e n d a n g e r i n g t h ea l p i n em e a d o w s o n t h eQ i n g h a i -T i b e tP l a t e a u .I n t h i s s t u d y ,t r a n s c r i p t o m e s e q u e n c i n g of f o u r t h -i n s t a r l a r v a e ,m a l e a n d f e -m a l e a d u l t s o f G .q i n gh a i e n s i s w a s p e r f o r m e db y s e c o n d -g e n e r a t i o nh i g h -t h r o u g h p u t s e q u e n c i n g ;a n d t h e o -d o r a n t b i n d i n gp r o t e i n (G q i n O B P s )g e n e sw e r es e l e c t e df u r t h e ru n d e r w e n tb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 17G q i n O B P s g e n e sw e r es c r e e n e da n d i d e n t i f i e da m o n g a t o t a l o f 63335a s s e m b l e d u n i g e n e s .T h e s eO B P sw e r e r e v e a l e d t ob e t h e r m o s t a b l e a n dd i s p l a y s a n e x t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o nb y b i o i n -f o r m a t i c s a n a l y s i s .T h e s e c o n d a r y a n d t e r t i a r y s t r u c t u r e c o n s i s t sm a i n l y o f αh e l i c e s a n d a n i r r e g u l a r c o i l .M u l t i p l e s e q u e n c ea l i g n m e n t s u p p o r t e d t h a tG q i n O B P s s h o w e dc o n s e r v e dc o n s t i t u t i o n p a t t e r no f c ys t e i n e r e s i d u e s a s i nm o s t i n s e c t s .E v o l u t i o n a r i l y ,G q i n O B P s g e n e i s c l o s e l y r e l a t i v e t o t h e D i c h o c r o c i s p u n c t i fe -r a l i s ,H o l c o c e r u s i n s u l a r i s S t a u d i n g e r a n d H o l c o c e r u s h i p p o ph a e c o l u s ,w h i c h a r e a l s o l e p i d o p t e r a c o u n t e r -p a r t s .T h i s s t u d y f i r s t r e p o r t e d t h e t r a n s c r i p t o m i c p r o f i l i n g o f t h e G .q i n gh a i e n s i s ,a n d t h e i d e n t i f i c a t i o no f t h e o d o r -b i n d i n gp r o t e i n g e n e s ,w h i c h w o u l dl a y o u taf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d y onf u n c t i o n so f t h e g e n e s i n t h e G .q i n gh a i e n s i s .K e y w o r d s :G y n a e p h o r a q i n g h a i e n s i s ;T r a n s c r i p t o m e s e q u e n c i n g ;O d o r a n t b i n d i n g p r o t e i n ;B i o i n f o r m a t i c s a -n a l y s i s ;P h y l o g e n e t i c t r e e 收稿日期:2022-10-10;修回日期:2022-11-21基金项目:青海省科技厅青年基金项目,草原毛虫嗅觉感受分子机理的研究(2022-Z J -949Q )资助作者简介:南彦斌(1997-),男,汉族,甘肃会宁人,硕士研究生,主要从事昆虫化学生态学研究,E -m a i l :3028356591@q q.c o m ;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e ,E -m a i l :1282186715@q q.c o m 昆虫气味结合蛋白(O d o r a n tb i n d i n gp r o t e i n ,O B P )属于水溶性小分子蛋白家族,它们在昆虫的化学感受器淋巴液中大量分布,被认为是昆虫化学感受过程中气味和信息素的载体[1],通常在昆虫的触角㊁口器等感觉器官中大量存在[2]㊂O B P s 的典型特点是由120~150个氨基酸组成,N 端出现信号肽,在有脊椎和无脊椎动物中都有分布,但脊椎动物和昆虫的O B P s 序列来源完全不同[3]㊂昆虫的O B -P s 与脊椎动物的O B P s 折叠模式完全不同,在脊椎动物中,其O B P s 由8个β筒状结构和羧基末端1Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第3期南彦斌等:青海草原毛虫气味结合蛋白基因与生物信息学分析个α螺旋组成;然而在昆虫中,其O B P s通常由6个α螺旋组成,排列紧凑且包围出1个疏水腔[4-5]㊂昆虫的O B P s结构稳定性是由3个二硫键控制的,二硫键的存在使其热稳定性与保守性更好㊂O B P s传递气味分子的功能是在研究鳞翅目昆虫触角的过程中发现的,此后学界展开多种昆虫的体内克隆研究,多种昆虫体内均得到了O B P s基因,且其在不同种类间存在极大差异[6]㊂O B P s的类型是通过O B P s 氨基酸序列中半胱氨酸的数量和间距来确定的[7],目前O B P s主要分为5个类型:C l a s s i cO B P s,D i-m e rO B P,P l u s-C O B P s,M i n u s-C O B P s,A t y p i c a l O B P s[8]㊂C l a s s i cO B P s中有6个保守的半胱氨酸残基,3个其他氨基酸残基存在于第二个和第三个半胱氨酸残基之间,8个其他氨基酸残基存在于第五个和第六个半胱氨酸残基之间㊂D i m e rO B P s中有两组6个保守的半胱氨酸㊂P l u s-C O B P s由6个保守的半胱氨酸残基㊁2个额外的半胱氨酸残基和1个保守的脯氨酸组成㊂M i n u s-C O B P s缺失2个保守的半胱氨酸位点㊂A t y p i c a lO B P s中有9~10个半胱氨酸残基[8]㊂昆虫气味结合蛋白具有种类多㊁功能多样的特点,因此需要探明其类型和数量,并在此基础上进一步研究气味结合蛋白在调控昆虫取食中的作用[9-10]㊂青海草原毛虫(G y n a e p h o r a q i n g h a i e n s i s)俗称红头黑毛虫,草原毒蛾,隶属于鳞翅目,毒蛾科,草原毛虫属[11]㊂目前草原毛虫属在全世界分布有15个种,主要分布在北半球的高山以及北极的冻土地带,尤以高海拔超过3000m的地区居多[12]㊂草原毛虫属在中国有8个种,主要分布于青海省北部的高寒草甸,原因在于青藏高原上的高寒草甸类草地上生长着十分丰富的莎草科㊁嵩草科及禾本科植物,这些植物为其提供了适宜的生存发展条件[13-14]㊂根据我们的调查与现有数据资料发现,青海草原毛虫在青海地区重点分布在门源㊁海晏㊁天俊㊁泽库㊁玛多㊁甘德㊁祁连㊁杂多和治多等地方,其危害主要集中在影响人畜安全㊁改变草地生态结构㊁加速草地生态环境的恶化[15]等方面,是青藏高原畜牧业健康发展的重大阻碍[16]㊂青海草原毛虫具有毒性,防治难度系数高[17],当前对它的研究主要集中在无人机和直升机施药[18-19],食性及其空间格局[20],全线粒体基因组序列测定与分析[21],高海拔胁迫的基因表达和分析[22]等方面,缺乏对其化学感受机制的研究㊂本研究首次公开并分析青海草原毛虫转录组原始数据,同时挖掘出气味结合蛋白基因,通过生物信息学分析进一步确定这些基因的理化性质㊁亚细胞定位㊁二级结构㊁三级结构㊁多序列比对㊁系统发育情况,为进一步研究青海草原毛虫气味结合蛋白对外界化学气味分子的识别及行为反应机理提供前提依据㊂1材料与方法1.1供试虫源2020年6-7月从青海省海北州(36ʎ59'06.6ᵡN,100ʎ52'19.1ᵡE,海拔3095.1m)采集青海草原毛虫的3,4龄幼虫至实验室,饲养至7龄幼虫,再到雌雄蛹,最后至雌雄成虫㊂饲养条件:温度(26ʃ1)ħ,光周期16Lʒ8D,相对湿度60%~80%㊂选4龄幼虫及雌雄成虫各3头收集到2m L的E P管中,使用液氮快速冷冻后于 80ħ超低温冰箱中保存㊂1.2试验方法1.2.1 R N A提取与检测取青海草原毛虫样品通过T r i z o l法提取R N A,用1%琼脂糖凝胶电泳分析样品R N A完整性及是否存在D N A污染;采用荧光分光光度计测定R N A浓度;利用超微量分光光度计检测R N A纯度;A g i l e n t2100b i o a n a l y z e r精确检测R N A完整性,当O D260n m/O D280n m的范围为1.8 ~2.2,28S/18S>2,O D260n m/O D230n m>1.8,R N A 完整值>8.5,表明提取的R N A合格㊂1.2.2c D N A文库构建与质检建库起始R N A 为总R N A,首先通过O l i g o(d T)磁珠富集带有p o l y A尾的m R N A,随后在F r a g m e n t a t i o nB u f f e r 中用二价阳离子将得到的m R N A随机打断㊂以片段化的m R N A为模版,随机寡核苷酸为引物,在M-M u L V逆转录酶体系中合成c D N A第一条链,随后用R N a s e H降解R N A链,并在D N A p o l y m e r a s e I 体系下,以d N T P s为原料合成c D N A第二条链㊂纯化后的双链c D N A经过末端修复,经过末端修复㊁加A尾并连接测序接头,用AM P u r eX Pb e a d s 筛选370~420b p左右的c D N A,进行P C R扩增并再次使用AM P u r eX Pb e a d s纯化P C R产物,最终获得文库㊂文库构建完成后,先使用Q u b i t2.0F l u-o r o m e t e r进行初步定量,稀释文库至1.5 n g㊃μL-1,随后使用A g i l e n t2100b i o a n a l y z e r对文库的i n s e r t s i z e进行检测,i n s e r t s i z e符合预期后, q R T-P C R对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2n m o l㊃L-1),以保证文库质量㊂质检合格后进行I l l u m i n a H i s S e q T M2000测序㊂北京诺禾986Copyright©博看网. All Rights Reserved.草 地 学 报第31卷致源科技股份有限公司协助完成文库构建与质检㊂1.2.3 转录组数据组装及基因注释 对R N A -s e q 测序获得的r a wr e a d s 进行质量过滤,过滤的内容包括:(1)接头的r e a d s ;(2)无法确定碱基信息比例大于10%的r e a d s ;(3)质量较低的r e a d s ㊂过滤后获得测序数据c l e a nd a t a ㊂利用T r i n i t y 2.5.1软件对c l e a nd a t a 进行组装,使用I n c h w o r m ,C h r y s a l i s 和B u t t e r f l y 等3个独立软件模块组装成最终的转录本㊂利用B L A S T2.5(h t t ps ://b l a s t .n c b i .n l m.N i h .g o v /B l a s t )软件,将u n i ge n e s 序列与7大数据库进行比对,7大数据库包括N R 蛋白数据库㊁N T核酸数据库㊁P f a m 蛋白家族㊁K O G /C O G 直系同源基因簇㊁S w i s s -P r o t 数据库㊁K O 数据库和G O 数据库㊂1.3 青海草原毛虫O B P s 基因序列生物信息学分析本试验通过第二代高通量测序技术对青海草原毛虫4龄幼虫㊁雌雄成虫进行转录组测序,基于此3个转录组数据库和青海草原毛虫转录组数据总库,以 O B P 和 o d o r a n tb i n d i n gp r o t e i n 为关键词进行查找,为确定候选基因将所有气味结合蛋白基因序列在N C B I 网站的数据库中进行B L A S T n 比对㊂利用O R F f i n d e r (h t t p s ://w w w.n c b i .n l m.n i h .go v /o r f f i n d e r /)预测出O R F 完整的核苷酸和氨基酸序列,之后在N C B I 中对预测出的O R F 氨基酸序列进行B L A S T p 验证,设定e 值小于10-5,相似性大于40%㊂利用E x P A S y -P r o t P a r a mt o o l (h t t p://w e b .e x p a s y .o r g /p r o t pa r a m /)软件对气味结合蛋白氨基酸序列组成㊁相对分子量㊁等电点㊁正负电荷残基数㊁不稳定系数㊁脂肪系数和总平均疏水性进行计算[23]㊂采用S i g n a l p 4.1S e r v e r (h t t p ://c b s .d t u .d k /s e r v i c e s /S i g n a l p/)预测其信号肽㊂采用WO L FP S O R T (h t t p s ://w o l f p s o r t .h gc .j p/)进行蛋白质的亚细胞定位预测分析[24]㊂采用S O P MA (h t t p s ://n p s a -p r a b i .i b c p .f r /c g i -b i n /n p s a _a u t o m a t .p l p a g e =n p s a %20_s o pm a .h t m l )进行蛋白质二级结构预测;S W I S S MO D E L (h t t ps ://w w w.s w i s s m o d e l .e x p a s y .o r g /)进行蛋白质的三级结构预测[25]㊂采用D N AMA N 6.0软件进行氨基酸多序列比对[26]㊂采用M E G A 7.0软件的N J 法构建系统发育树㊂构建物种有:桃蛀螟(D i c h o c r o c i s p u n c t i fe r a -l i s ),二化螟(C h i l o s u p pr e s s a l i s ),小线角木蠹蛾(H o l c o c e r u si n s u l a r i s S t a u d i n ge r ),沙棘木蠹蛾(H o l c o c e r u sh i p p o ph a e c o l u s ),冈比亚按蚊(A -n o p h e l e s g a m b i a e ),红火蚁(S o l e n o p s i s i n v i c t a B u -r e n )㊂设置参数为:重复频次1000,空缺数据95%部分删除,其他参数默认[27]㊂2 结果与分析2.1 青海草原毛虫转录组序列组装青海草原毛虫雌雄成虫㊁4龄幼虫转录组数据测序筛选后总碱基数分别为7.04G b ,7.29G b ,5.95G b ;Q 20(质量值ȡ20碱基所占百分比)分别为98.20%,98.10%,98.23%,均高于98%;Q 30(质量值ȡ30碱基所占百分比)分别为94.66%,94.40%,94.73%,均高于94%;G C 含量分别为40.88%,39.92%,42.12%(表1)㊂该项数据表明,测序得到的数据质量较好,具有极高的可信度,可用于后续的数据分析㊂表1 青海草原毛虫样品转录组数据测序结果T a b l e 1 R e s u l t s o f t r a n s c r i p t o m e d a t a f r o m G y n a e p h o r a q i n gh a i e n s i s s a m p l e s 样品名称S a m pl e n a m e 原始总读数T o t a l r a wr e a d s 筛选后总读数T o t a l c l e a n r e a d s筛选后总碱基数T o t a l c l e a nb a s e s /G bQ 20/%Q 30/%G C 含量G Cc o n t e n t/%雌成虫F e m a l e a d u l t s 24220069234725707.0498.2094.6640.88雄成虫M a l e a d u l t s25613202243161697.2998.1094.4039.924龄幼虫4t h -i n s t a r l a r v a e21205148198300595.9598.2394.7342.12组装后的测序序列共有135434条转录本,其N 50(拼接转录本按照长度从长到短排序,累加转录本的长度,到不小于总长50%的拼接转录本的长度)的长度为2068b p ,平均长度为1273b p㊂转录本经过组装后得到63335条全部u n i g e n e s ,其中长度超过1000b p 的有19926条,占全部u n i ge n e s 的31.46%,从中可以看出其组装完整性较高(表2),在后续生物学分析中可以运用㊂096Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第3期南彦斌等:青海草原毛虫气味结合蛋白基因与生物信息学分析表2 青海草原毛虫转录组组装结果T a b l e 2 R e s u l t s o f t h e t r a n s c r i p t o m e a s s e m b l y o f G .q i n gh a i e n s i s 长度范围L e n g t h r a n g e /b p转录本T r a n s c r i pt s U n i ge n e s 数量N o .百分比P e r c e n t a ge /%数量N o .百分比P e r c e n t a ge /%300~5004462732.952430938.38500~10003775827.881910030.161000~20002826420.871120617.69>20002478518.30872013.77合计T o t a l135434633352.2 U n i ge n e 的功能注释在N R ,N T ,Pf a m ,K O G /C O G ,S w i s s -P r o t ,K O 和G O7大数据库中将青海草原毛虫转录组分别进行注释,结果表明在所有数据库中均注释成功的u n i ge n e s 有3792(5.98%)个,至少在一个数据库中注释成功的u n i ge n e s 有35571(56.16%)个㊂通过数据统计发现未获得注释的u n i g e n e s 有27764个,占全部u n i g e n e s 43.84%㊂在7大数据库中,获得注释基因最多的是N R 数据库(26738个,42.21%),最少的为K O G 数据库(9521个,15.03%),其后依次为P F A M 注释(18593个,29.35%)㊁G O 注释(18588个,29.34%)㊁N T 注释(16956个,26.77%)㊁S w i s s -P r o t 注释(16036个,25.31%)㊁K O 注释(10903个,17.21%)(表3)㊂通过比对N C B IN R 数据库发现,青海草原毛虫的基因序列与棉铃虫(H e l i c o v e r paa r -m i g e r a )㊁粉纹夜蛾(T r i c h o pl u s i a n i )㊁斜纹夜盗虫(S p o d o p t e r a l i t u r a )㊁绿棉铃虫(H e l i o t h i s v i r e s c e n s )㊁柑橘凤蝶(P a p i l i o x u t h u s )等昆虫基因序列相似性较高,相似度分别为13.0%,12.7%,12.5%,10.3%和5.5%㊂表3 青海草原毛虫转录组基因功能注释统计T a b l e 3 S t a t i s t i c s o f g e n e f u n c t i o n a l a n n o t a t i o n f o r t r a n s c r i p t o m e s f r o m G .q i n gh a i e n s i s 数据库D a t a b a s e独立基因数量N u m b e r o f u n i ge n e s 百分比P e r c e n t a ge /%在所有数据库中均注释成功A n n o t a t e d i na l lD a t a b a s e s37925.98至少在一个数据库中注释成功A n n o t a t e d i no n eD a t a b a s e a t l e a s t3557156.16G O 注释A n n o t a t e d i nG O1858829.34K O 注释A n n o t a t e d i nK O 1090317.21K O G 注释A n n o t a t e d i nK O G 952115.03N R 注释A n n o t a t e d i nN R2673842.21N T 注释A n n o t a t e d i nN T1695626.77P F AM 注释A n n o t a t e d i nP F AM1859329.35S w i s s -P r o t 注释A n n o t a t e d i nS w i s s -P r o t1603625.312.3 青海草原毛虫O B P s 的生物信息学分析从青海草原毛虫的转录组数据库中筛选出17个O B P s (表4),经O R F f i n d e r 与B L A S T p 验证后,其核苷酸长度大小介于363~570b p 之间,将青海草原G q i n O B P s 与其他昆虫O B P 序列相似性进行比较,其中G qi n O B P 5基因与斜纹夜蛾基因序列(G e nB a n k 登录号为X P _022826781.1)相似度最高,达到95.65%㊂其次,G q i n O B P 4基因与甜菜夜蛾S p o d o p t e r a e x i g u a 基因序列(G e nB a n k 登录号为A G H 70105.1)的相似度达到了88.72%㊂G qi n O B P s 基因与其他昆虫物种相似性高于60%的有11个,占总数的64.7%,表明G q i n O B P s 与其他昆虫序列相似性相比较一致性较高㊂采用软件T r a n s D e c o d e r 预测出该17个青海草原毛虫气味结合蛋白的编码区序列是完整的㊂采用在线网站S i g n a I P 4.1预测其信号肽,结果表明G q i -n O B P 8,G q i n O B P 16,G q i n O B P 17三个基因没有信号肽㊂196Copyright ©博看网. All Rights Reserved.草 地 学 报第31卷表4 青海草原毛虫O B P s 生物信息学分析T a b l e 4 B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o f o d o r a n t b i n d i n gp r o t e i n s (O B P s )i n G .q i n gh a i e n s i s 基因ge n e s G e n B a n k 登录号G e n B a n ka c c e s s i o nN o .核苷酸长度N u c l e o t i d el e n g t h /b p 信号肽S i gn a l p e p t i d e C D S 完整性C D Si n t e g r i t y 氨基酸长度Am i n oa c i d l e n g t h /a a B l a s t P 验证B l a s t Pt e s t a n dv e r i f y物种名称B L A S Ta n n o t a t i o n登录号G e n B a n ka c c e s s i o nN o .o f h o m o ge n o u s p r o t e i n E 值E -v a l u e相似性I d e n t i t y /%G qi n O B P 1O N 36552138719是Y e s129C o n o ge t h e s p i n i c o l a l i s Q E E 82709.18e -5059.23G q i n O B P 2O N 36552244419是Y e s 148A t h e t i s d i s s i m i l i s Q C F 41930.13e -5460.71G q i n O B P 3O N 36552346524是Y e s 155S p o d o p t e r a e x i g u a A GH 70101.15e -2645.00G q i n O B P 4O N 36552439917是Y e s 133S p o d o p t e r a e x i g u a A GH 70105.13e -8288.72G q i n O B P 5O N 36552555221是Y e s 184S p o d o p t e r a l i t u r a X P _022816506.14e -11995.65G q i n O B P 6O N 36552642620是Y e s 142M y t h i m n a s e p a r a t a AWT 22237.15e -7073.94G q i n O B P 7O N 36552742020是Y e s 140H e o r t i a v i t e s s o i d e s A Z B 49383.14e -6566.19G q i n O B P 8O N 365528363无N o n e 是Y e s 121S p o d o p t e r a l i t u r a X P _022826781.12e -6376.86G q i n O B P 9O N 36552942020是Y e s 140H e l i c o v e r p a z e a X P _047028345.12e -6565.47G q i n O B P 10O N 36553040219是Y e s 134G r e g o p i m p l a k u w a n a e U E N 71172.14e -5572.65G q i n O B P 11O N 36553150129是Y e s 167S p o d o p t e r a e x i g u a AK T 26499.13e -6672.86G q i n O B P 12O N 36553257018是Y e s 190D a n a u s p l e x i p p u s X P _032516798.16e -4543.33G q i n O B P 13O N 36553344418是Y e s 148S p o d o p t e r a e x i g u a AK T 26503.12e -6565.77G q i n O B P 14O N 36553443821是Y e s 146S p o d o p t e r a e x i g u a AK T 26503.19e -3743.62G q i n O B P 15O N 36553539619是Y e s 132A g r o t i s i p s i l o n A G R 39568.12e -3553.44G q i n O B P 16O N 365536483无N o n e 是Y e s 161D i o r y c t r i a a b i e t e l l a A Z T 78911.22e -8979.49G qi n O B P 17O N 365537378无N o n e是Y e s 126L o b e s i a b o t r a n aA X F 48744.17e -1940.002.4 青海草原毛虫O B P s 理化性质分析利用E x P A S y -P r o t P a r a m t o o l (h t t p ://w e b .e x p a s y .o r g /p r o t pa r a m /)软件对青海草原毛虫气味结合蛋白理化性质进行预测(表5),青海草原毛虫17个O B P s 氨基酸残基数在121~190a a 之间,相对分子量13.84~60.41k D ,理论等电点大多数位于6附近,表明这些蛋白属于偏酸性蛋白,但是G q i n O B P 1,G q i n O B P 4,G q i n O B P 7-9,G q i n O B P 11蛋白理论等电点位于8附近,表明这些蛋白属于偏碱性蛋白㊂G q i n O B P 1-17蛋白带负电荷残基总数明显比带正电荷残基总数多,蛋白不稳定系数大于40的有9个,表明这9个蛋白为不稳定蛋白(蛋白稳定参数>40为不稳定蛋白)㊂脂肪系数反映蛋白的热稳定性,青海草原毛虫17个O B P s 均为热稳定性蛋白㊂青海草原毛虫17个O B P s 平均疏水性为 0.20,说明该蛋白为两性蛋白质(正值为疏水性,负值为亲水性, 0.5~0.5之间为两性蛋白质)㊂表5 青海草原毛虫O B P s 蛋白理化性质T a b l e 5 P h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o fO B P s i n G .q i n gh a i e n s i s 基因G e n e氨基酸残基数A m i n o a c i d s相对分子量M o l e c u l a rw e i gh t /K D 等电点(P I )I s o e l e c t r i c po i n t 负电荷残基数N e g a t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e s 正电荷残基数P o s i t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e s不稳定系数I n s t a b i l i t yi n d e x脂肪系数A l i p h a t i c i n d e x总平均疏水性A v e r a ge h y d r o p a t h i c i t yG qi n O B P 112914.218.23182017.4886.20-0.330G q i n O B P 214816.686.87161631.2490.270.002G q i n O B P 315517.604.78322241.2076.13-0.419G q i n O B P 413315.149.01182432.0179.25-0.555G q i n O B P 518420.696.32272645.6184.18-0.252G q i n O B P 614216.324.41281338.9784.44-0.179G q i n O B P 714015.868.41172039.0083.77-0.064G q i n O B P 812113.848.16161845.3883.64-0.393G q i n O B P 914015.868.41172039.0083.57-0.064G q i n O B P 1013414.846.59232326.1877.91-0.407G q i n O B P 1116718.398.76192452.6190.60-0.117G q i n O B P 1219060.416.27131269.1983.210.248G q i n O B P 1314816.075.27241935.4283.72-0.084G q i n O B P 1414615.604.97181447.3398.150.043G q i n O B P 1513214.816.14191845.2188.79-0.130G q i n O B P 1616118.324.88291559.2981.68-0.083G qi n O B P 1712614.304.78241751.0669.68-0.6012.5 青海草原毛虫O B P s 的亚细胞定位预测分析采用在线网站W o L FP s o r t (h t t p s ://w o l f ps o r t .h g c .j p /)对青海草原毛虫O B P s 进行亚细胞定位预测(表6),表中数字表示W o L FP s o r t 亚细胞定位预测系统中与目标蛋白序列最相似且亚细胞定位已经确定的蛋白数目㊂数目越大表示目标蛋白可能参与的亚细胞结构间的物质交流越多㊂结果表明17个G qi -n O B P s (G qi n O B P 1-17)定位在胞外㊂另外该17个G qi n O B P s 在线粒体㊁细胞膜㊁溶酶体和细胞质中有少量分布,仅G q i n O B P 16在细胞核中有少量分布㊂296Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第3期南彦斌等:青海草原毛虫气味结合蛋白基因与生物信息学分析表6 青海草原毛虫O B P s 的亚细胞定位T a b l e 6 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no fO B P s i n G .q i n gh a i e n s i s 基因名称G e n e s 线粒体M i t o c h o n d r i o n细胞核N u c l e u s 细胞膜P l a s m am e m b r a n e 溶酶体l y s o s o m e 细胞质C y t o pl a s m 胞外E x t r a c e l l u l a rG q i n O B P 1131G q i n O B P 28123G q i n O B P 3330G q i n O B P 4131G q i n O B P 5824G q i n O B P 6131G q i n O B P 7527G q i n O B P 82327G q i n O B P 9527G q i n O B P 1032G q i n O B P 11131G q i n O B P 126125G q i n O B P 1332G q i n O B P 14131G q i n O B P 1532G q i n O B P 1641.526.518G qi n O B P 1718232.6 青海草原毛虫O B P s 的二级结构预测分析利用S O P MA (h t t p s ://n p s a -p r a b i .i b c p.f r /c g i -b i n /n p s a _a u t o m a t .p l p a g e =n p s a %20_s o p m a .h t m l )在线网站预测G q i n O B P s 二级结构(图1),青海草原毛虫的O B P s 二级结构主要由α螺旋(A l p h a h e l i x )和无规卷曲(R a n d o mc o i l)组成,残基间氢键的相互作用调解着蛋白质的二级结构㊂青海草原毛虫O B P s 蛋白的二级结构预测结果表明,α螺旋的氨基酸残基占整体氨基酸比例最大,其次为无规则卷曲的氨基酸残基,β折叠和延伸链的氨基酸残基较少,由此判断青海草原毛虫O B P s 的二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲形成并维持稳定㊂图1 青海草原毛虫O B P s 的二级结构F i g .1 S e c o n d a r y s t r u c t u r e o fO B P s i nG .q i n gh a i e n s i s 注:蓝色竖线为α螺旋㊁绿色竖线为β折叠㊁红色竖线为延伸链㊁紫色竖线为无规则卷曲N o t e :T h eb l u e l i n e r e p r e s e n t sA l p h a h e l i x ,t h e g r e e n l i n e r e p r e s e n t s B e t a t u r n ,t h e r e d l i n e r e p r e s e n t s E x t e n d e d s t r a n d ,t h e p u r p l e l i n e r e pr e -s e n t sR a n d o mc o i l396Copyright ©博看网. All Rights Reserved.草 地 学 报第31卷2.7 青海草原毛虫O B P s 的三级结构预测采用S W I S S MO D E L (h t t p s ://w w w.s w i s s -m o d e l .e x p a s y .o r g/)网站同源建模得到青海草原毛虫O B P s 蛋白的三级结构模型,结果发现(图2),G q i n O B P s 三级结构极为保守,除G qi n O B P 12的三级结构有5个α螺旋外,其余16个青海草原毛虫O B P s 蛋白(G q i n O B P 1-G q i n O B P 11,G qi n O B P 13-G q i n O B P 17)有6个α螺旋,同时G qi n O B P s 拥有保守的半胱氨酸来形成二硫键,稳定气味结合蛋白的整体结构,内部空间区域较为宽阔,主要是疏水性氨基酸,这些螺旋和连接它们的回折构成了其三维结构且形成疏水结合腔,这类回折也称无规则卷曲,广泛分布于蛋白质的三级结构中,在生物学功能的实现中具有十分重要的作用㊂图2 青海草原毛虫O B P s 三级结构预测图F i g .2 P r e d i c t i o nm a p o fO B P s t e r t i a r y s t r u c t u r e i nG .q i n gh a i e n s i s 2.8 青海草原毛虫O B P s 基因的多序列比对通过D N AMA N 软件对G q i n O B P s 进行多序列比对,通过比对的17个G qi n O B P s 都具有昆虫O B P s 的半胱氨酸模式识别序列(图3)㊂G q i -n O B P 3,G q i n O B P 5,G q i n O B P 6,G q i n O B P 7,G q i -n O B P 8,G q i n O B P 9,G q i n O B P 10,G q i n O B P 13,G qi -n O B P 14,G qi n O B P 16,这10个O B P s 属于C l a s s i c O B P s 家族㊂其半胱氨酸的模式识别序列是C 1-X 25-30-C 2-X 3-C 3-X 36-42-C 4-X 8-14-C 5-X 8-C 6(C为半胱氨酸,X 为任意氨基酸),与其他报道的鳞翅目昆虫C l a s s i c O B P s 家族无差异㊂G qi n O B P 1,G q i n O B P 2,G q i n O B P 4,G q i n O B P 11,G q i n O B P 15这5个O B P s 属于M i n u s -C O B P s 家族,因为在这些蛋白序列中缺少C 2和C 5半胱氨酸㊂G qi -n O B P 17的C 2,C 3,C 6的位置不是半胱氨酸残基,无法推断其是否属于C l a s s i cO B P s 家族,但从多序列比对的总体分布可以重新划分保守的半胱氨酸残基的分布情况,图中黄色标记可看出其缺少C 2和C 5半胱氨酸㊂因此推测G q i n O B P 17属于M i n u s -C O B P s 家族㊂G qi n O B P 12缺少C 2和C 5半胱氨酸且在其C 6上游还有一个半胱氨酸,因此可以推测G qi n O B P 12也属于M i n u s -CO B P s 家族㊂496Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第3期南彦斌等:青海草原毛虫气味结合蛋白基因与生物信息学分析图3 青海草原毛虫17个气味结合蛋白O B P 1~O B P 17的氨基酸序列比对F i g .3 S e q u e n c e a l i g n m e n t o f a m i n o a c i d s o f 17o d o r a n t b i n d i n gp r o t e i n sO B P 1-O B P 17i nG .q i n gh a i e n s i s 注:黑色C 1-C 6保守的半胱氨酸残基,黄色表示推测的半胱氨酸N o t e :T h eb l a c kC 1-C 6d e n o t e c y s t e i n e r e s i d u e s ,t h e y e l l o wc o d e s i n d i c a t e p u t a t i v e c ys t e i n e 2.9 青海草原毛虫O B P s 基因的系统进化分析为了明确青海草原毛虫O B P s 与其他近缘种的进化关系,采用N J 法构建系统发育树,包括青海草原毛虫的17个O B P 氨基酸序列和其他六种昆虫的175个O B P 氨基酸序列㊂结果显示,青海草原毛虫17个O B P 在整个进化系统中分布比较分散㊂其中,G q i n O B P 6,G q i n O B P 4,G q i n O B P 10,G q i -n O B P 1,G q i n O B P 15,G q i n O B P 2,G q i n O B P 11,G qi -n O B P 17聚类到M i n u s -C O B P s 进化枝㊂G q i -n O B P 7,G q i n O B P 8,G q i n O B P 9,G q i n O B P 14,G qi -n O B P 3,G q i n O B P 13,G q i n O B P 16,G qi n O B P 12,G qi n O B P 5聚类到C l a s s i cO B P s 进化枝㊂但序列比对结果显示G q i n O B P 6和G qi n O B P 10为C l a s s i c O B P s 亚家族,G q i n O B P 12为M i n u s -C O B P s 亚家族㊂与其他鳞翅目昆虫比对发现,桃蛀螟和小线角木蠹蛾各有2个O B P 聚到同一小分支上(G qi -n O B P 2和C p u n O B P 39,G q i n O B P 16和C pu n -G O B P 2,B o o t s t r a p =99%);G qi n O B P 11和S i n -s O B P 11,G qi n O B P 5和S i n s O B P 21㊁B o o t s t r a p =99%),表明G qi n O B P s 与桃蛀螟和小线角木蠹蛾的亲缘关系最近㊂另外,G q i n O B P 1,G q i n O B P 4,G q i n O B P 10和G q i n O B P 15聚在一个分支上,与沙棘木蠹蛾的E h i p O B P 9和E h i p O B P 24关系较近㊂596Copyright ©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷图4基于氨基酸序列采用邻接法构建的青海草原毛虫气味结合蛋白与其他昆虫气味结合蛋白的系统进化树F i g.4 P h y l o g e n e t i c t r e e o fO B P s i n G.q i n g h a i e n s i s w i t h t h o s e f r o mo t h e r i n s e c t sb a s e do na m i n o a c i d s e q u e n c e sb y t h en e i g h b o r j o i n i n g m e t h o d注:Ә:G q i n O B P1~17;C p u n为桃蛀螟(60个);C s u p为二化螟(12个);S i n s为小线角木蠹蛾(23个);E h i p为沙棘木蠹蛾(23个);A g a m为冈比亚按蚊(双翅目)(57个);S i n v:红火蚁(膜翅目)(6个)N o t e:Әr e p r e s e n t s G q i n O B P1~17;C p u n r e p r e s e n t s D i c h o c r o c i s p u n c t i f e r a l i s(60);C s u p r e p r e s e n t s C h i l o s u p p r e s s a l i s(12);S i n s r e p r e-s e n t s H o l c o c e r u s i n s u l a r i s S t a u d i n g e r(23);E h i p r e p r e s e n t s H o l c o c e r u s h i p p o p h a e c o l u s(23);A g a mr e p r e s e n t s A n o p h e l e s g a m b i a e(D i p t e r-a)(57);S i n v r e p r e s e n t s S o l e n o p s i s i n v i c t a B u r e n(H y m e n o p t e r a)(6)3讨论伴随着新一代高通量测序技术的不断发展,转录组学的研究发生了重大的改变,R N A-s e q在没有预先设计探针的情况下,可对特定条件下的各种生物整体转录活动进行测序,可以完全准确的探测到基因表达情况,许多未知的分子调控机制被发现,许多重要功能基因已被发掘并加以利用[28]㊂本研究组装后的青海草原毛虫转录组测序序列总共有135434条转录本,其N50的长度为2068b p,转录本经过组装之后总计得到63335条u n i g e n e s,其N50的长度为1714b p,N50的值越大表示序列拼接的完整性越好[29],从中可以看出其组装完整性较高,保证了转录组分析的准确性㊂本研究首次从青海草原毛虫转录组数据中鉴定出17个气味结合蛋白,与其他昆虫鉴定出的O B P s 基因数目相比较发现:黑腹果蝇(D r o s o p h i l am e l a-n o g a s t e r)[30]鉴定得到51个O B P s,菜粉蝶(P i e r i s r a p a e)[1]筛选出24个O B P s,丽蝇蛹集金小蜂(N a-s o n i a v i t r i p e n n i s)[24]获得90个O B P s,家蚕(B o m-b y x m o r i)[31]比对出44个O B P s,桃小食心虫(C a r p o s i n a s a s a k i i)[32]获得26个O B P s,青海草原毛虫获得数目较少,但相对于梨网蝽(S t e p h a n i t i s n a s h i[20],12个O B P s),甘蓝蚜(B r e v i c o r y n e b r a s s i-696Copyright©博看网. All Rights Reserved.第3期南彦斌等:青海草原毛虫气味结合蛋白基因与生物信息学分析c a e[33],12个O B P s),萝卜蚜(L i p a p h i s e r y s i m i,12个O B P s)和桃蚜(M y z u s p e r s i c a e,9个O B P s),青海草原毛虫获得的数目较多,推测出现这种结果的原因可能是昆虫气味结合蛋白数据库的丰富度不同㊂对半胱氨酸序列进行模式识别分析,发现青海草原毛虫的O B P s主要分布在C l a s s i cO B P s家族,此结果与多数昆虫的O B P基因属于C l a s s i cO B P s 家族相吻合,如点蜂缘蝽(R i p t o r t u s p ede s t r i s)触角中的O B P基因有4个属于C l a s s i cO B P s家族[24],草履蚧(D r o s i c h a c o r p u l e n t a)触角的O B P基因有10个属于C l a s s i cO B P s家族[34]㊂本研究获得的G q i n O B P s为热稳定性蛋白,其二级结构主要由α螺旋和无规卷曲组成,残基间氢键的相互作用调节着蛋白质的二级结构㊂这与姚怀兵等[35]的研究双峰驼D G A T1蛋白属于非经典分泌性蛋白,二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲相一致㊂G q i n O B P s三级结构模型,除G q i n O B P12的三级结构有5个α螺旋外,其余16个G q i n O B P s有6个α螺旋,这些螺旋和连接它们的回折构成了其三维结构且形成疏水结合腔㊂气味结合蛋白的氨基酸序列折叠形成疏水性的结合腔是高度保守的㊂缺少α螺旋的蛋白可能是由于氨基酸残基的缺失造成㊂序列比对结果显示G q i n O B P6和G q i n O B P10为C l a s s i c O B P s亚家族,G q i n O B P12为M i n u s-C O B P s亚家族,但系统进化结果显示G q i n O B P6和G q i n O B P10聚在M i n u s-C O B P s分支,G q i n O B P12聚在C l a s s i cO B P s分支㊂吉帅帅等[36]认为出现该种情况的原因与C l a s s i cO B P s和M i n u s-CO B P s在进化上的同源关系相关㊂因此我们推测该情况出现的原因是G q i n O B P6和G q i n O B P10与M i n u s-C O B P s在进化上更加同源,G q i n O B P12与C l a s s i c O B P s在进化上更加同源㊂同时在结果中发现, G q i n O B P16和桃蛀螟的C p u n G O B P2聚在同一个小分枝中,且自展支持率为99%,由于C p u n-G O B P2[37]是性信息素结合蛋白,与昆虫交配㊁产卵有关,所以我们推测青海草原毛虫G q i n O B P16也在昆虫交配和产卵中起着重要作用㊂4结论昆虫气味结合蛋白在其气味识别过程中发挥着巨大的作用,本研究首次公开并分析青海草原毛虫转录组原始数据,同时挖掘出17个青海草原毛虫气味结合蛋白基因,通过生物信息学分析发现这些O B P s为热稳定性蛋白,17个青海草原毛虫气味结合蛋白的编码区序列是完整的,G q i n O B P8,G q i-n O B P16,G q i n O B P17三个基因没有信号肽,亚细胞定位主要分布在胞外,二三级结构主要由α螺旋与无规则卷曲组成,多序列比对显示17个G q i n O B P s 都具有昆虫O B P s的半胱氨酸模式识别序列,系统发育树显示,G q i n O B P s在整个进化系统中比较分散,但与同是鳞翅目昆虫的桃蛀螟㊁小线角木蠹蛾和沙棘木蠹蛾亲缘关系较近㊂参考文献[1]朱宇,刘洋.菜粉蝶气味结合蛋白和化学感受蛋白生物信息学分析[J].浙江农业学报,2019,31(1):104-112[2]I S H I D A Y,C O R N E LAJ,L E A L W S.I d e n t i f i c a t i o na n dc l o-n i n g o f a f e m a l e a n t e n n a-s p e c i f i c o d o r a n t-b i n d i n g p r o t e i n i n t h em o s q u i t o C u l e x q u i n q u e f a s c i a t u s[J].J o u r n a l o fC h e m i c a lE-c o l o g y,2002,28(4):867-871[3] P E L O S IP.O d o r a n t-b i n d i n gp r o t e i n s[J].C r i t i c a lR e v i e w s i nB i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a rB i o l o g y,1994,29(3):199-228[4] L A R T I G U E A,C AM P A N A C C IV,R O U S S E LA,e t a l.X-r a ys t r u c t u r ea n dl i g a n db i n d i n g s t u d y o fa m o t hc h e m o s e n s o r y p r o t e i n[J].T h eJ o u r n a lo fb i o l o g i c a lc h e m i s t r y,2002,277(35):32094-32098[5]M O N A C O H L,Z A N O T T IG.T h r e e-d i m e n s i o n a ls t r u c t u r ea n da c t i v e s i t eo f t h r e eh y d r o p h ob i cm o l ec u l e-b i nd i n gp r o te i n sw i t hs i g n i f i c a n ta m i n oa c i ds e q u e n c es i m i l a r i t y[J].B i o p o l y-m e r s,1992,32(4):457-465[6]桑育黎,石磊,辛跃强,等.赤拟谷盗气味结合蛋白研究进展[J].辽宁大学学报(自然科学版),2022,49(1):79-86 [7] P E L O S IP,MA S T R O G I A C OM O R,I O V I N E L L A I,e ta l.S t r u c t u r e a n db i o t e c h n o l o g i c a l a p p l i c a t i o n so fo d o r a n tb i n d i n g p r o t e i n s[J].A p p l i e dm i c r o b i o l o g y a n db i o t e c h n o l o g y,2014,98(1):61-70[8]王宏民,张静,张冲,等.绿豆象气味结合蛋白基因的克隆及表达分析[J].昆虫学报,2021,64(8):920-928[9]王晓双,唐良德,吴建辉.昆虫嗅觉相关蛋白的研究进展[J].热带作物学报,2017,38(6):1171-1179[10]赵航,吴国星,汤永玉,等.叉角厉蝽触角转录组及嗅觉相关基因分析[J].环境昆虫学报,2022,44(5):1205-1217 [11]王金昌,周敏,邓菲,等.草原毛虫核型多角体病毒新分离株的基因组测序与分析[J].病毒学报,2022,38(1):156-167 [12]王海贞,刘昕.玉树州境内草原毛虫种群分布及其对生境草场植被的影响[J].环境昆虫学报,2022,44(4):891-902 [13]白海涛,王伟,魏希杰,等.昆虫病原线虫对草原毛虫幼虫的致病力[J].环境昆虫学报,2020,42(5):1269-1274 [14]陈珂璐,余欣超,姚步青,等.不同放牧强度下门源草原毛虫在高寒草甸上的空间分布[J].草地学报,2016,24(1):191-197 [15]曹婧,徐晗,潘绪斌,等.中国草地外来入侵植物现状研究[J].草地学报,2020,28(1):1-11796Copyright©博看网. All Rights Reserved.草地学报第31卷[16]张棋麟,袁明龙.草原毛虫研究现状与展望[J].草业科学,2013,30(4):638-646[17]张勤文,莫重辉,沈明华,等.食入草原毛虫导致放牧羊口腔黏膜溃烂的病理学诊断[J].动物医学进展,2011,32(12):126-129[18]连欢欢,侯秀敏,于红妍,等.高寒牧区无人机防控草原毛虫药效试验[J].草学,2021(2):66-69[19]方毅才.碌曲县直升机飞防草原毛虫效果研究[J].甘肃畜牧兽医,2017,47(3):110-112[20]万秀莲,张卫国.草原毛虫幼虫的食性及其空间格局[J].草地学报,2006,14(1):84-88[21]Y U A N M L,Z HA N G QL,G U OZL,e t a l.T h e c o m p l e t em i-t o c h o n d r i a l g e n o m eo f G y n a e p h o r aa l p h e r a k i i(L e p i d o p t e r a: L y m a n t r i i d a e)[J].M i t o c h o n d r i a lD N A.P a r tA,D N A m a p-p i n g,s e q u e n c i n g,a n d a n a l y s i s,2016,27(3):2270-2271[22]Z H A N G QL,Y U A N M L,D E N GXY,e t a l.G e n e e x p r e s s i o na n a l y s i s o f t h e t ib e t a n g r a s s l a n dc a t e r p i l l a r s(L e p id o p te r a:L y-m a n t r i i n a e:G y n a e p h o r a)i nr e s p o n s et o h i g h-a l t i t u d es t r e s s [J].A I PC o n f e r e n c eP r o c e e d i n g s,2019,2079(1):020003 [23]王宏民,董田,郑海霞,等.梨网蝽触角嗅觉相关基因分析[J].植物保护学报,2021,48(2):367-375[24]Z H A OZG,L I UBL,R O N GEH,e t a l.B i o i n f o r m a t i c a n a l y s i so f g e n e e n c o d i n g o d o r a n t b i n d i n gp r o t e i n(O B P)1,O B P2,a n dc h e m o s e n s o r yp r o t e i n s i n G r a p h o l i t am o l e s t a[J].B i o c h e m i c a lS y s t e m a t i c s a n dE c o l o g y,2017,70:60-68[25]王亚茹,王苑馨,胡军,等.莲草直胸跳甲化学感受蛋白C S P s的生物信息学分析[J].山西农业大学学报(自然科学版), 2018,38(1):25-37[26]宋月芹,董钧锋,陈庆霄,等.点蜂缘蝽触角转录组及化学感受相关基因的分析[J].昆虫学报,2017,60(10):1120-1128[27]V I E I R AFG,F O R E TS,H EXL,e t a l.U n i q u e f e a t u r e s o f o-d o r a n t-b i n d i n gp r o te i n s of t h e p a r a s i t o i dw a s p N a s o n i a v i t r i p-e n n i s r e v e a l e db yg e n o m e a n n o t a t i o na n d c o m p a r a t i v e a n a l y s e s[J].P L o SO n e,2012,7(8):e43034[28]杨平,谢寿安,巩雪芳,等.花椒窄吉丁转录组及化学感受相关基因的分析[J].昆虫学报,2019,62(5):547-560 [29]王兴春,谭河林,陈钊,等.基于R N A-S e q技术的连翘转录组组装与分析及S S R分子标记的开发[J].中国科学:生命科学, 2015,45(3):301-310[30]H E KMA T-S C A F E D S,S C A F E C R,M C K I N N E Y A,e ta l.G e n o m e-w i d e a n a l y s i s o f t h e o d o r a n t-b i n d i n g p r o t e i n g e n e f a m-i l y i n D r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r[J].G e n o m e r e s e a r c h,2002,12(9):1357-1369[31]G O N G DP,Z H A N G HJ,P I N GZ,e t a l.T h e o d o r a n t b i n d i n gp r o t e i n g e n ef a m i l y f r o m t h e g e n o m eo fs i l k w o r m,B o m b y x m o r i[J].B M CG e n o m i c s,2009,10(1):332-332 [32]徐世才,孙勇,刘伟燕,等.桃小食心虫触角气味结合蛋白和化学感受蛋白基因的鉴定与进化分析[J].基因组学与应用生物学,2021,40(Z2):2539-2550[33]李文红,程英,金剑雪,等.甘蓝蚜和萝卜蚜O B P和C S P的生物信息学分析[J].西南农业学报,2022,35(1):130-139 [34]高倩.草履蚧触角嗅觉基因转录组及生物信息学分析[D].太原:山西大学,2016:3-6[35]姚怀兵,马强,李玲,等.准噶尔双峰驼D G A T1基因外显子8序列生物信息学分析[J].黑龙江畜牧兽医,2022(21):122-126,141-142[36]吉帅帅,庄翔麟,刘乃勇.灭字脊虎天牛触角转录组中气味结合蛋白基因的鉴定及表达谱分析[J].四川农业大学学报, 2018,36(2):193-202[37]陈秋应.暗期微弱红光促进桃蛀螟生殖的嗅觉感受机制初探[D].重庆:西南大学,2021:12-16(责任编辑闵芝智)896Copyright©博看网. 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草原黑毛虫的发生与气象条件的关系及防御对策
草原黑毛虫的发生与气象条件的关系及防御对策摘要青藏高原是国际科技界瞩目的研究气候和生态环境变化的敏感区和脆弱带，高原气候的复杂性和多样性对草原黑毛虫发生造成许多不确定性，随着气候条件发生波动时，会使草原黑毛虫的影响时期、影响程度随之而在时间和空间上发生波动，或者引起大发生、大流行，或者引起种群数量的下降。
因此，分析掌握一个地区气象条件对草原黑毛虫少生和蔓延的有利和不利因素，对科学防御草原黑毛虫灾害，提高当地生产力，促进畜牧业经济发展具有重要的参考价值。
关键词：草原黑毛虫气象防御对策1 草原黑毛虫及危害草原黑毛虫（Gynaephora alpherakii）别名红头黑毛虫、草原毒蛾，隶属鳞翅目毒蛾科草原黑毛虫属，是我国青藏高原高寒草地的主要害虫之一。
草原黑毛虫不仅分布范围广、发生密度高（通常200~500头•m-2，最高虫口密度达3000头•m-2），而且还会导致家畜中毒，严重阻碍青藏高原畜牧业的健康发展。
危害等级划分依据虫口密度和牧草损失量，将草原黑毛虫的危害等级定为生态平衡级、极轻危害级、轻度危害级、中度危害级、重度危害级、极重度危害级和猖獗危害级7个级别。
1.2 危害特点草原黑毛虫主要破坏草地植被，将成片大面积牧草连根基茎部蚕食，对牧草危害非常严重，毛虫取食时由草顶尖而向基部食之，先食嫩枝绿叶，这种多食性和选择性的取食方式，严重影响了牧草的开花，抑制了牧草的生长和正常发育，相反使毒杂草逐渐增多，导致草地退化甚至沙化。
毁坏严重的草地植被在两年内难以恢复，单位面积草地生产力和载率量大幅度下降。
材料与方法2.1研究区概况研究地点为位于三江源区的青海省黄南州河南县、果洛州玛沁县，是青海省牦牛、藏羊的主要产地，也是青海省最主要的牧业基地和草原黑毛虫重灾区。
河南县位于青海省东南部，九曲黄河第一弯，隶属黄南州，可利用草地面积60.9万hm2，平均海拔3650m。
地貌类型复杂多样，由滩地、丘陵、低山和高山组成。
青藏高原昆虫区系独特性研究
等方面对青藏高原 昆虫 区系进行研究分 析。结果表 明， 青藏高原可 以作 为一个 单独 的动物地理 区， 印青藏 区， 与其他六个 动物地
理 区并列。
关键词 ： 昆虫 区系； 独特 ； 青藏高原
中 图分 类 号 ： Ｒ ３ ８ ４ 文献标识码 ： Ａ
Ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｅｎ ｄ ｅ ｍｉ ｓ ｍ ｏ ｆ Ｉ ｎ ｓ ｅ ｃ ｔ Ｆ ａ ｕ ｎ ａ ｏ ｖ ｅ ｒ Ｑｉ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ － Ｔ ｉ ｂ ｅ ｔ ａ ｎ Ｐ ｌ ａ ｔ ｅ ａ ｕ
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ＤＯ Ｉ ： １ ０ ． １ ６ ２ １ ３ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｓ ｃ ｊ ａ ｓ ． ２ ０ １ ５ ． ０ １ ． ０ ８ ２
甘南尕海草原毛虫肠道细菌群落结构分析
甘南尕海草原毛虫肠道细菌群落结构分析王金昌;曾小琴;占智高;关丽梅;靳亮【摘要】为探讨了甘南尕海自然保护区草原毛虫(Gynaephora aureate Ghou et Ying)肠道细菌群落结构组成,采集甘南尕海高寒草地3个不同地点的4龄草原毛虫幼虫,通过Illumina HiSeq高通量测序平台对甘南尕海自然保护区草原毛虫肠道细菌群落结构组成进行分析,总共获得了206098条序列.甘南尕海草原毛虫中肠的细菌由Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Tenericutes(软壁菌门)、Verrucomicrobia(疣微菌门)、Fusobacteria(梭杆菌门)、Acidobacteria(酸杆菌)、Deino-coccus-Thermus(异常球菌-栖热菌门)和Planctomycetes(浮霉菌门)等10个门组成,优势菌群为Proteobacteria和Bacteroidetes.在属的水平上,Providencia(普罗威登斯菌)含量最丰富,其次是Brevundimonas(单胞菌属)、Bacteroides(拟杆菌属)和Methylotenera(甲基柔膜菌属).阐明了甘南尕海草原毛虫肠道细菌群落的组成,为研究草原毛虫肠道微生物和草原毛虫对人畜的危害提供理论基础.【期刊名称】《江西科学》【年(卷),期】2017(035)001【总页数】7页(P5-11)【关键词】甘南尕海;草原毛虫;肠道微生物;高通量测序【作者】王金昌;曾小琴;占智高;关丽梅;靳亮【作者单位】江西省科学院微生物研究所,330096,南昌;抚州洋洲中心小学,344000,江西,抚州;江西省科学院微生物研究所,330096,南昌;江西省科学院微生物研究所,330096,南昌;江西省科学院微生物研究所,330096,南昌【正文语种】中文【中图分类】S567.35草原毛虫为我国高原牧区的重要害虫，别名红头黑毛虫、草原毒蛾，属于鳞翅目、毒蛾科[1]。
2%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐·0.4%苏云金杆菌混合剂防治青藏高原草原毛虫药效试验
青海草业QINGHAI PRATACULTURE 第29卷第1期2020年3月Vol.29.No.l Mar.2020文章编号：1008-1445 (2020) 01-0014-032%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐・0.4%苏云金杆菌混合剂防治青藏高原草原毛虫药效试验于红妍(青海省草原总站，青海西宁810008)摘要：为了探索一种高效、低毒、低残留、对人畜安全的防控青藏高原草原虫害的生物药剂，本文应用2% 甲氨基阿维菌素苯甲酸盐・0.4%苏云金杆菌混合剂对草原毛虫进行了防治试验。
结果表明，在草原毛 虫3龄期，选用该药剂防控草原毛虫，平均防治效果达90%以上，对优良牧草安全，因此，该药剂适宜在 青藏高原防治草原毛虫中推广应用。
关键词：2%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐• 0.4%苏云金杆菌混合剂；草原毛虫；防治中图分类号：S812.6 文献标识码：A在以我国提岀“农药使用零增长”为目标，全 国开展农药减量行动的同时，青海省也积极响应 该行动，以草原虫害预测预报为基础，大力推广绿 色防控集成技术，做到适时防治、专业化统防统 治，并选用高效、低毒、低残留的生物药剂，采用轮 换用药、精准施药，有效地减少了生物药剂的用药 量'"o 草原毛虫(Gynaephora qinghaiensis )属鳞翅 目(Lepidoptera )、毒蛾科(Lymantriidae )、草原毛虫 属(Gynaephora),别名黄斑草毒蛾，是青藏高寒牧 区的主要害虫之一⑵。
由于人类超载过牧等多因 素的影响，草原毛虫大量啃食牧草,严重破坏草地 植被,加剧了对草地生态系统的破坏,导致草地进 一步退化。
近年来，突出以生物技术防控草原虫 害，防止草地环境污染，维护生态平衡，以生态优 先为主3"],探索新型高效、低毒、低残留、对人畜 安全、对非靶标物无害等特点的草原害虫防控生 物药剂是当务之急。
经过多年来试验示范技术总 结积累，草原虫害防控由原来的化学防控向多种 生物防控技术转变。
西藏聂荣县草原毛虫分布危害综合调查研究
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调 查报 告 供 了保 障 ， 冬 眠 龄幼 虫 的 越 冬 率 高 。 由 使 零 星 分布逐 步形 成 连 锁 反 应 ， 虫 数 量 迅 毛
速 增 加
《 藏 科 技 ｝ ０ ２年 ４期 （ 第 １ ８期 ） 西 ２０ 总 ０ 比例 严重 失调 ， 以天 敌形不成规 模 ， 此 所 对
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调 查 报 告
西藏聂荣县草原毛虫分布危害 综 合调 查 研 究
王俊 彪 汪 志 智 央德 扎 西 王保 山 扎 西 多吉
（ 西藏 农 牧 厅
西藏 聂 荣县
谢 相适 应 ， 是 高 原 草 原 毛 虫 在 长 期 的 演 也
同时 弄清 草原 毛 虫 对 牦牛 、 有无 毒 性 作 羊
用 ， 除 牧 民 和 人 们 对 毛 虫 为 害 牦 牛 、 的 解 羊
化过 程 中逐 渐 建 立 起来 的遗 传 性 ， 种 的 是 保守性 。草原 毛虫适应 环境 条件 的变化 幅 度狭 窄 ． 如环 境 因子 波 动 幅 度 大不 利 于 其
Ｇｙ ａ Ｐ ｏ ａ Ｔ１ ３Ｅ． ｉ ｏ ｇ ｈ ｌ ． ｏ ｔ ｎ ｅ ｈ ｒ Ｂ 、 ｎ ｅ ｒ ｎ ｅ ｓ Ｇｈ ｕ ｅ ｓ
２ 聂 荣 县 草 原 毛 虫 灾情 发 生 的原 因
２ １ 那 曲地 区 １ ９ ． ９ ６年 和 １ ９ ９ ７年 特 大 雪 灾使 巴青县 、 聂荣 县 、 多县 畜牧业 遭受 沉 安
原毛虫 综合 研究 课 题 组 ， 人 实 际 虫 灾 现 深 场调查 、 研究 ， 台 当 地 实况 综 合 分 析 ， 结 提 高对 毛虫及 其 为 害的认 识 ， 当前 和今 后 为 的防治工 作 提供 可 靠 的理 论 和实 践 依据 ：
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Hale Waihona Puke 青海 畜牧兽 医 杂志 ２ ０ １ ５年第 ４ ５卷 第 ３期 （ 总第 ２ ３ ７期 ）
青藏 高原特有 昆虫 一 草原毛虫生殖行为研究
鲍根生， 王 宏 生
（ 青 海省 畜牧兽 医科 学院 ， 西宁， ８ １ ０ ０ １ ６ ）
摘 要： 草原 毛虫 作为 青 藏 高原 区系 中特 有 的 昆 虫 种类 ， 成 为 对 草 地 危 害 最 严 重 的 有 害 昆虫 之一 。 然而 ， 关 于 草 原 毛 虫 生 殖 阶 段 的羽 化 、 求 偶 和 交 配 行 为 的研 究 报 道 尚少 。 基 于 此 研 究 通 过 室 内温 度 ２ ０ ￣ １ ℃， 相对湿度 ７ ５ ％－ ８ ０ ％、 光周期 １ ５ Ｌ ： １ ０ Ｄ条 件 下 观 察 草 原 毛 虫 成 虫 的 羽 化 、 求偶和交配活动的差异。 结 果表 明 ： 草 原 毛 虫 羽 化 行 为全 天可 见 ， 雄 虫 羽 化 高 峰 期 主 要 集 中在 １ ０ ： ０ ０ － １ ２ ： ０ ０， 而 雌 虫 羽 化 高 峰期 集 中在 １ Ｉ ： ０ ０ ～ １ ５ ： ０ ０和 １ ７ ： ０ ０ — １ ８ ： ０ ０两 个 时 间 段 。 羽 化 第 ３天 发 生 求偶 行 为 的 虫 数最多 ， 第４ ｄ后 开 始逐 渐 下 降 ， １ ， ２和 ３ 日龄 雌 蛾 求 偶 高 峰 期 在 １ ６ ： ３ ０左 右 ， 而４ ， ５和 ６日龄 求偶 高 峰 期 在 １ ６ ： ０ ０左 右 。 室 内草 原 毛 虫 交 配 集 中 在 ９ ： ３ ０ － １ ９ ： ３ ０ ， 交配高峰期出现在 １ １ ： ３ ０和 １ ６ ： ３ ０左 右 ， 交 配率 高达 ５ ５ ％和 ７ ５ ％， 且 显 著 高 于 其 他 时 间 交配率（ Ｐ ＜ Ｏ ． ０ ５ ） 。由此 可 见 ， 草原毛虫雌雄成虫羽化 、 求 偶 和交 配 行 为 存 在 差 异 性 ， 可 能 与 青 藏 高 原 特 殊 的环 境 条 件 和 昆虫 适应性进化过程有关。 关键 词 ： 青藏高原； 草原毛虫； 求偶 ； 羽化； 交 配 中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ６ ７ 文献标识码 ： Ａ 文章 编号 ： １ ０ ０ ３ — ７ ９ ５ ０ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ３ － ０ ０ ０ ４ — ０ ３
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： ｒ ｎ Ｉ ｅ ｇ ｒ ａ ｓ ｓ ｌ ａ ｎ ｄ ｃ ａ ｔ ｅ ｒ ｐ ｉ ｌ ｌ ａ ｒ（ Ｇ ｙ ｎ ａ ｅ ｐ ｈ ｏ ｒ ａ ａ ｌ ｐ ｈ ｅ ｒ ａ ｋ ｉ ｉ ） ， ｅ ｎ ｄ ｅ ｍ ｉ ｃ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ Ｑ ｉ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ － Ｔ ｉ ｂ ｅ ｔ ａ ｎ Ｐ ｌ ａ ｔ ｅ ａ ｕ ， ｉ ｓ ａ ｐ ｅ ｓ ｔ ｉ ｎ Ａ ｌ ｐ ｉ ｎ ｅ ｍ ｅ ａ ｄ ｏ ｗ ．
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Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ ｒ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｂ ｅ ｈ ａ ｖ ｉ ０ ｒ ｓ ｏ ｆ Ｇｙ ｎ ａ ｅ ｐ ｈ ｏ ｒ ａ ａ ｌ ｐ ｈ ｅ ｒ ａ ｋ ｉ ｉ— ａ ｎ ｅ ｎ ｄ ｅ ｍｉ ｃ
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