特异切割番茄 1-氨基环丙烷羧酸合成酶mRNA的核酶基因序列的合成与克隆 Cloning of a Hammerhead R
核酸内切酶和核算外切酶的名词解释
核酸内切酶和核酸外切酶是生物学领域中常见的两种酶类，它们在DNA和RNA分子的修复、重组和剪切等生物学过程中起着重要作用。
本篇文章将对这两种酶的名词解释进行详细介绍，包括定义、功能、特点、应用等方面的内容，以便读者更好地理解这两种关键酶的作用机制和意义。
一、核酸内切酶的定义和功能1. 核酸内切酶是一类能够在核酸分子中切割特定的磷酸二酯键的酶，其作用是将核酸分子切割成两个或多个片段，并广泛参与DNA和RNA的修复、复制和重组等生物学过程。
2. 核酸内切酶可识别核酸分子中特定的核酸序列，并在该序列特定的位置上将其切割成两个相对应的片段，从而实现对核酸分子的精确修饰和分解。
3. 核酸内切酶在细胞分裂、DNA修复和RNA剪切等生物学过程中发挥着重要作用，是维持细胞遗传信息稳定性和正常功能的关键因素。
二、核酸外切酶的定义和功能1. 核酸外切酶是一类能够在核酸分子中切割磷酸二酯键的酶，其作用是在核酸分子的末端位置对核酸链进行切割，从而在DNA和RNA分子的修复、降解和重组等生物学过程中发挥着重要作用。
2. 核酸外切酶通常通过识别特定的核酸序列或结构，在核酸分子的末端位置将其切割成两个或多个片段，促进DNA和RNA分子的进一步修复和降解。
3. 核酸外切酶在细胞的免疫防御、DNA降解和RNA后修饰等生物学过程中发挥着重要作用，对维持细胞内核酸分子稳定性和功能性具有重要意义。
三、核酸内切酶和核酸外切酶的应用1. 核酸内切酶和核酸外切酶在分子生物学研究中广泛应用，包括DNA 和RNA的分子克隆、限制性酶切图谱分析、基因组定位、DNA指纹分析、基因突变检测等方面，成为分子生物学实验的重要工具。
2. 核酸内切酶和核酸外切酶在基因工程和基因编辑技术中发挥着关键作用，如CRISPR/Cas9基因编辑技术就利用了核酸内切酶的特定识别和切割能力，实现对目标基因的精准编辑和修饰。
3. 核酸内切酶和核酸外切酶的应用不仅局限于科研领域，在医学诊断、药物研发和生物工业生产等领域也具有重要意义，为相关领域的发展和进步提供了有力支持。
mrna选择性剪接的分子机制
mrna选择性剪接的分子机制mrna选择性剪接的分子机制：细胞核内前体mRNA的剪接的执行者是剪接小体，它能够在成熟mRNA出核和翻译之前识别剪接信号，移除不编码内含子，并将能够编码蛋白的外显子拼接在一起。
细胞核内前体mRNA的剪接需要经历2次转酯化反应化步骤去掉内含子才能将相邻的外显子拼接成成熟的mRNA。
在前体mRNA上有三个反应区域分别在5'剪接位点(5'SS)，3'剪接位点(3'SS)以及分枝位点（图1）。
除了这三个反应区域外，在多细胞生物体的内含子上还拥有保守性的多聚嘧啶束，它位于3'剪接位点以及分枝位点之间。
图1选择性剪接发生过程示意图选择性剪接由内含子5'剪接位G和U2个核昔酸点以及3'剪接位点A和G2个核昔酸介导。
分支点A 核昔酸非常保守的，一般位于3'剪接位点上游20-50个核营酸。
剪接反应的过程发生2次转酶化反应，这个过程中需要5个snRNPs复合物(Ul，U2,U4,U5,andU6)。
这些复合物能够聚集在前体mRNA 上形成大分子的聚合物剪接小体，核内最大的RNP复合物，能够识别这些反应位点并催化前体mRNA发生剪接。
剪接小体中主要的模块是snRNPs复合物。
剪接小体一般包含5种snRNPs：U1、U2、U4，U5和U6 snRNP。
每一个snRNP包含了单个snRNA和至少7种蛋白亚基。
这些snRNP和另外的非snRNP相关蛋白（例如SF1、U2AF和Prp19复合物）一步步有序的聚集在前体mRNA上依次形成前剪接小体E，A，B以及C复合物（图1）。
在这有序的过程中，这些snRNP以及非snRNP相关蛋白和反应位点之间发生复杂的结合与去结合过程，这些复杂的过程为核小体提供了多次检查的机会以保证它们结合的准确性从而提高位点选择的精确性。
在核小体组装之前，U1 snRNP占据5'剪接位点，而SF1结合在分枝位点，这2个过程是ATP依赖的并最终形成前剪接小体E复合物（图1）。
基因工程名词解释
名词解释一RNase:RNA水解酶Restriction endonucleasr：限制性核酸内切酶RBS:核糖体结合位点SD sequence：SD序列。
可结合原核生物旳核糖体。
Ori：复制起始原点Promptor：启动子Klenow fragment：大肠杆菌pol1旳大片段Reverse tranecriptase：反转录酶Transferred DNA：转移DNAMCS（multiple cloning site）：多克隆位点IPTG: 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷X-gal：5-溴4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷GUS：β-葡萄糖苷酸酶X-gluc：5-溴4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯Ampr（ampicillin resistance gene）：氨苄青霉素抗性基因Cmr：氯霉素抗性基因Tetr：四环素抗性基因Kanr：卡那霉素抗性基因Ermr:红霉素抗性基因Neor:新霉素抗性基因supF:琥珀突变克制基因phagemid：噬菌粒plasmid：质粒YAC ( yeast artificial chromosome)：酵母人工染色体BAC(Bacterial Artificial Chromosome）：细菌人工染色体PAC（P1 artificialchromosome）：P1人工染色体TEL: 端粒反复序列CEN:着丝粒ARS: 自主复制序列Cosmid：黏粒PCR（Polymerase Chain Reaction）:聚合酶链式反应dNTP:脱氧三磷酸核苷RT-PCR:反转录(reverse transcriptase)PCR或实时定量(real-time)PCR DD(RT)-PCR:差异(反转录)显示PCRTAIL PCR：热不对称相错PCRRACE: cDNA末端旳迅速扩增RAPD：随机扩增多态性DNAAFLP:扩增片段长度多态性SSH：克制性扣除杂交FISH:荧光原位杂交Vector:载体Blunt end：平末端Match end/cohesive end:匹配黏端/黏性末端Deoxyribonuclease：脱氧核糖核酸酶TAP：烟草算焦磷酸酶SDS：十二烷基磺酸钠PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳PFGE：脉冲电场凝胶电泳PEG：聚乙二醇DEPC：焦碳酸二乙酯GFP：绿色荧光蛋白Competent cell:感受态细胞PNA：肽核酸Ptac：乳糖操纵子和色氨酸操纵子旳杂合启动子GST(Glutathione S-transferase)：谷胱甘肽-S-转移酶DDT:二硫苏糖醇Tag：标识蛋白Polyhis-6：六聚组氨酸肽名词解释二1 同裂酶（isoschizomer）识别相似序列旳限制酶称同裂酶同尾酶（isocaudarner）许多不一样旳限制酶切割DNA产生旳末端是相似旳，且是对称旳，即它们可产生相似旳黏性突出末端。
加工番茄马铃薯Y病毒一步法RT—PCR检测及CP基因的克隆与序列分析
ｖ ａ ｒ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｓ ａ ｍｏ ｎ ｇ ｄ ｉ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ Ｐ ＶＹ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗｅ ｅ ｒ ｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｄ ｕｐ ．Ａｃ ｃ ｏ ｒ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｅｓ ｒ ｕ ｌ ｔ ｓ．Ｐ ＶＹ ｗ ｈ ｉ ｃ ｈ ｉ ｌ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｉ ｎ Ｘｉ ｎ —
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｓ ｐ ｏ ｔ ａ ｔ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ Ｙ ｐ ｅｖ ｒ ａ ｌ ｅ ｎ ｃ ｅ ｏ ｆ ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｉ ｎ Ｘ ｉ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｂ ｙ ｔ ｈ ｅ ｏ ｎ ｅ ・ － ｓ ｔ ｅ ｐ ｅｖ ｒ ｅ ｓ ｒ ｅ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｃ ｒ ｉ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ ・ － ｐ ｏ ｌ ・ ・ ｙ ｍ ｅ ａｓ ｒ ｅ ｃ ｈ ａ ｉ ｎ ｅａ ｒ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ （ Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ） ，ｔ ｈ ｅ ｅｓ ｒ ｕ ｌ ｔ ｓ ｈ ｏ ｗ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ２ ５％ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｍ ａ ｔ ｏ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ｂ ｅ ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｄ ｅ ｗ ｉ ｔ ｈ Ｐ Ｖ Ｙ．Ｔ ｈ ｅ Ｃ Ｐ ｇ ｅ ｎ ｅ ｉ ｎ ｃ ｌ ｕ ｄ ｅ ｄ
桑树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)启动子功能分析
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2017, 43(6): 839-848/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2017.00839桑树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)启动子功能分析余建刘长英赵爱春王传宏蔡雨翔余茂德*西南大学生物技术学院 / 西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室, 重庆 400715摘要: 1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作为关键酶, 能够催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。
为探究桑树MnACO基因在桑树生长发育和抵御外界胁迫中的功能, 本研究构建了pMnACO::GUS的植物表达载体并转化拟南芥。
采用GUS组织染色法鉴定转基因拟南芥不同生长阶段及胁迫处理后的GUS活性。
通过PCR克隆得到MnACO1和MnACO2启动子片段, 它们分别为1518 bp和1429 bp, 启动子区域有大量的TATA-box、CAAT-box和其他响应外界刺激的顺式作用元件。
GUS活性分析显示MnACO启动子能驱动GUS在拟南芥中表达; MnACO1启动子能驱动GUS在拟南芥的根、叶片、花瓣、花药、花丝、柱头以及果荚中表达, 且活性较MnACO2强; MnACO2启动子不能驱动GUS在果荚中无表达。
转MnACO1和MnACO2植株经不同逆境处理后GUS表达活性不同, 转MnACO1植株的GUS活性随处理延长时间而减弱, 转MnACO2植株GUS活性随处理时间延长而增强。
qRT-PCR检测2周苗龄的桑幼苗在经过胁迫处理后MaACO1和MaACO2的基因表达量, 发现MaACO基因的表达模式与MnACO启动子GUS活性变化趋势一致。
本研究结果表明, MnACO为诱导型启动子, MnACO1兼具组成型启动子特性, MnACO2兼具组织特异型启动子特性。
高中生物核心知识一本通(选三部分)--现代生物科技专题
4.目的基因的检测与鉴定：
类型
检测内容
检测方法
导入 目 的 基 因 是 否 检测 导入受体细胞 DNA 分子杂交
转录 分子水平检测
检测
分子杂交
目的基因是否
转录出 mRNA
（DNA 和 mRNA 分子杂交）
翻译 目 的 基 因 是 否 检测 翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交
步骤 提取出转基因生物的 DNA，解旋 成单链与用放射性同位素标记或 荧光分子标记目的基因探针混合 提取出转基因生物的 mRNA，与 用放射性同位素标记或荧光分子 标记的目的基因探针混合
不同点
苷酸连接到已有的核酸片段上
DNA 片段连接起来
相同点
均形成磷酸二酯键
三、基因进入受体细胞的载体（运载体）——“分子运输车”
质粒：存在于细菌、酵母菌等拟核 DNA 或核 DNA 外的，能够自主复制的小型环状 DNA
选
1.种类：λ 噬菌体的衍生物
修 三
动植物病毒
2.作用：携带目的基因进入受体细胞，使目的基因在受体细胞稳定存在并表达。
温馨提示：同一种限制酶切割产生相同的黏性末端，但产生相同黏性末端不一定都是用同一种限制酶
切割。
二、DNA 连接酶——“分子缝合针”
E.coli DNA 连接酶 ( 只能连接互补的黏性末端 )
1.种类： T4 DNA 连接酶 ( 能连接黏性末端和平末端 )
2.作用：形成磷酸二酯键，把相同黏性末端的两个 DNA 连接起来形成重组 DNA（重组质粒）。 温馨提示：通常要产生相同的黏性末端，要用同一种限制酶对目的基因和质粒进行切割。
中 生
DNA 聚合酶（Taq 酶，耐高温）从引物起始进行互补链的合成（高温解旋、低温复性、中温延伸）。
基因工程名词解释
基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程：广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
限制性核酸内切酶：是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶回文结构：每条单链以任一方向阅读时都与另一条链以相同方向阅读时的序列是一致的，例如5'GGTACC3' 3'CCATGG5'.同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列（BamH I 和Bst I具有相同的识别序列G↓GATGC）同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般情况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。
BamH I 识别序列： G↓GATCCBgl II 识别序列： A↓GATCT黏性末端 (cohesive terminus/sticky ends)：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为黏性末端。
平末端（blunt ends）： DNA片段的末端是平齐的。
星活性（star activity）：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。
易产生星活性的内切酶用*标记。
如：EcoR I*底物位点优势效应:酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同。
连杆/衔接物（linker）：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。
新疆加工番茄条斑坏死病原黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析
第２卷 ４
第 ４期
Ｊｕｎ石河子大学学报ｒ自然科学版 ｃ ｎｅ ｏｒａ ｏ ｈ ｅｉ ｎｖ （ ｙＮ ｔ ａ Ｓ ｃ ） ｌ ｆ ｉ ｚ Ｕ ｉ ｓ （ ａ ｒｌ ） Ｓ ｈ ｅｉ ｔ ｕ ｉ ｅ
Ｖ１ ４ ｏ４ ｏ． Ｎ ． ２
要 病原 。
田间大量 采集 的 样 品 冷藏 于 一７ ￣ 通 过 摩擦 ０Ｃ， 接种 心 叶烟 ， 多次单 斑 分 离 后 ， 后 接种 心 叶 烟 ， 最 保 存毒 源 。 １ １２ 载体 与菌株 ．． ＰＣ－ Ｕ ｍＴ载体 购 自上 海 ｓｎｏ ａｇｎ公 司 ， 肠 杆 菌 大
近 年来 ， 加工 蕃 茄 条斑 坏 死病 毒 病 的 发生 日益
严重， 成为制约加工蕃茄生产的重要 因素。在新疆 的奎屯 、 河 子 、 拉 斯 等 地 普遍 大 面积 发 生 ， 的 石 玛 有 地块 发病 率 高 达 １０ ， 成 产 量 下 降 ， 至 绝 产 。 ０％ 造 甚
利 用生 物学 、 电镜 观察 、 血清 学 和部分基 因序列测 定 等 方法 ， 从引 起 条斑 坏 死 的加 工 番茄 中 ， 离出黄 瓜 分 花 叶病毒 ， 其 进 行 了 初 步 研究 ，发现 黄 瓜 花 叶 病 对
摘要 ： 从表现花叶 、 畸形以及坏 死症状 的加工 番茄病株 上获得黄瓜花 叶病毒分离物 ， １ Ｃ Ｖ Ｃ 用 对 Ｍ Ｐ基 因引物进行 Ｒ －Ｃ 扩增得到 了 ７６ ｐ的特异性核苷 酸片段 。将 Ｐ Ｒ产物插入到克隆载体 Ｐ Ｃ － ＴＰ Ｒ． ７ｂ Ｃ Ｕ ｍＴ中转 化大肠杆菌 Ｄ Ｓ 。经 ＨＱ
限制 酶酶切鉴 定 ， 重组 克隆 中含有与 ｆ Ｒ产 物大小相 同的 ７６ ｐ的插 入片段 。ｃ Ｎ ２ ７ｂ Ｄ Ａ全序列 分析 表明，重组克隆含
新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达
新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达张强;崔百明;郑银英;向本春【摘要】[目的]克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考.[方法]利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STV CP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP.将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达.[结果]成功克隆了STV CP基因,其长度为1 134 bp.构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1 mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47 ku 的蛋白.[结论]成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(043)004【总页数】5页(P118-122)【关键词】南方番茄病毒;外壳蛋白基因;原核表达【作者】张强;崔百明;郑银英;向本春【作者单位】石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子832003【正文语种】中文【中图分类】S432.41加工番茄属于普通番茄的一种类型，在新疆有“红色产业”之称。
近些年，随着种植面积的逐年加大，加工番茄已成为新疆经济的支柱性产业之一，也是新疆经济增长速度最快的产业之一[1-2]。
加工番茄由于枝繁叶茂、种植密度大、品种抗病能力不一、栽培时间长、连作和重茬地增多等因素，导致其病毒病日趋严重。
对加工番茄的病毒病进行调查发现，加工番茄病毒病类型主要有花叶型、蕨叶型、条斑型、巨芽型、卷叶型和黄顶型等。
生物化学(12.2)--作业RNA的生物合成(附答案)
说出下列各核酸序列的名称和各序列与转录的关系。 ①……TTGACA……TATAAT…… ②TATA ③AAA……AAA……(polyA) ④-CCA-OH-3′ ⑤UUU……UUU(polyU) [答案] ① 原核生物启动子的一致性序列，即转录起始点－35 区和－10 区的序列，－10 区 序列又称为 Pribnow Box。是转录起始 RNA-pol 辨认和结合 DNA 模板的位点。 ②真核生物启动子或启动子的一部分。属于顺式作用元件，称为 TATA box。其出现位置不如 原核生物那样相对固定，也不是所有转录都必须 TATA 盒： ③真核生物的 polyA(聚腺苷酸)尾巴，是转录终止与转录后修饰两个过程同时发生的现象 。 polyA 尾巴在翻译时逐渐变短，说明它在维持 mRNA 稳定性上发挥一定作用。 ④ tRNA 3′ 末端的序列，由转录后加工加上去的，其功能是在翻译过程中与 tRNA 反密码子 相对应的氨基酸结合，生成氨基酰-tRNA。 ⑤是原核生物非依赖 Rho 因子转录终止的转录产物 3′ 末端序列，跟在茎环结构的下游。其 功能与 RNA 脱离转录模板 DNA 有关。因为转录过程 RNA 3′ 端是与模板链互补结合的，AU 配对不稳定，RNA 中出现多聚 U，使 RNA 易于从模板链上脱落。
问答题 列表比较转录与复制的异同点。 [答案] 见表。
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相同点
①都是酶促的核苷酸聚合过程 ②都是以 DNA 为模板
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３ ０
遗
传 Ｈ Ｒ ＤＩＡ （ｅｉ ） ８ Ｅ Ｅ Ｔ Ｓ ｉ ｇ １９ Ｂｊ ｎ ９
２卷 ０
２ ． ３感受态细胞的制备及连接物的转化 ２ ．感受态细胞的制备 ．１ ３ 参考Ａｅａｄ： ｌ ｎｅ等报道的 ｘ 方法〔 ， ９ 挑取大肠杆菌Ｊ １ 单菌落 ） Ｍ ０ ９ 接种于５ ｌ ｘ ｍ ２ Ｔ Ｙ
摘 要 根据番茄 １氨基环丙烷梭酸合成酶（ Ｃ － Ａ Ｃ合成酶） 基因ｃ ＤＮＡ序列， 按照锤头状核酶作用模式， 设计合成长度分别为４ｍ ｒ ８ ｒ ０ ｅ 和４ｍｅ的一对引物， 经体外退火、延伸、连接， 插人质粒 ｐ Ｅ ３ ｆ ） Ｇ Ｍ－ Ｚ（ 的 ＋ Ｋ ｎ 和 Ｂｍ 位点之间， ｐＩ ａ ＨＩ 经菌落原位杂交、双酶切、聚丙烯酞胺凝胶电泳和序列分析证明， 人工合成了
ｇａ ｄ ｏ ｎ ａｄ ｍ Ｉ ｏ ｖｃ ｒ Ｅ ｒｔ ｉ Ｋ Ｉ Ｂ Ｈ ｓｅ ｅｔ ｐ Ｍ－ ｆ ）Ｆ ｕ ｐｓｉ ｃ ｎｓ ｒ ｇｔｎ ｉ ｅ ｎ ｐ ｎ ａ ｔ ｉ ｆ ｏ Ｇ ｔ ３ （ ． ｒ ｉｖ ｌ ｅ ｗ ｅ ｔ ｂ ｎ Ｚ ＋ ｏ ｏ ｔｅ ｏ ｅ ｏ ｅ ｙ
液体培养基（ 每升含 ５ 酵母抽提物，ｏ 蛋白陈，ＯＮ Ｃ） ７ ｇ ｌｇ ｌ ａ Ｉ ｇ 中３℃过夜培养， ０ ｍ１ 取 ． 培养物接种于５ｍ ２ Ｔ ５ ０ ｌ Ｙ ｘ 液体培养基中３℃培养 ３ ７ 小时左右至Ｏ ０ 值约为０ ， Ｄ６０ ． 冰浴 １ ４ 小时，５０ ３０ ｒｍ离心 ２ ｐ 分钟， 将离心收集的菌体 充分悬浮于 ２ｍ 溶液Ｉ Ｏ ｏ／ ａ １ ７ｍｍ ｌ Ｌ Ｃ２ ４ｍ ｌ Ｌ Ａ ， ． 中， ５ ｌ （Ｏｍｍ ｌ Ｌ Ｃ２ ０ ｏ／ Ｉ Ｃ ， Ｍｎ ｌ ０ ｍｏ／ ａ Ｃ ｐ ５ 冰浴 ４ 分钟， ， Ｎ Ｈ５ ） ５ 再以同样方法离心收集菌体， 将菌体充分悬浮于 ２ ｍｌ ． 溶液Ｉ ０ｍｍ ｌ Ｃ Ｃ２ ７ｍｍ ｌ Ｃ２ ５ Ｉ （ ０ ｏ／ ａ １ ０ ｏ／ １ １ Ｌ ， Ｌ Ｍｎ ， ４ｍ ｏ／ Ａ ， ０ ｍ ｌ Ｎａ Ｃ １％甘油，Ｈ ．中， Ｌ ５ ｐ ５ ） 以每管 ２０１ ５ ０，分装于Ｅ ｐｎｏｆ ｕ ｐｅｄｒ管内，７℃保存备用。 －０ ２． ．２连接物的转化 ３ 向冰浴 １分钟的２０ ０ ０风感受态细胞中加人连接混合物 ２川， ０ 冰浴 ４ 分钟，２ ５ ４℃热冲击９ ０ 秒， 加人 Ｉ Ｌ ｍｌ Ｂ培养基，７ ３ ℃水浴保温 １ 小时， 期间轻摇几次， 然后取２０ ０川涂布于含 Ｘ ｇｌ ＩＴ Ａ 的Ｌ －ａ Ｐ Ｇ， ， ｍｐ Ｂ 平板上，７ ３℃培养 １ 小时， ４ 挑选白色菌落待进一步检测。
１１０ｎ ／ １ １ ｘ ＤＮ ｌａｅ ｆｒ ， Ａ Ｐ５ ｏ／ ， Ｂ Ａ ０ｇ ｐ）Ｉｌ ＤＮ ｌａｅ ｐ １０ｇ ｊ） ０ ４ Ａ ｓｂｆ ２１２１ （ （ ｉ ， Ｔ ｉ ｇ ｕｅ ， ， Ｔ ｍｍ ｌ ）２１ （ ｎ ／ １ ＦＴ ｕ ｕ ｕ ， Ｓ ５ １ ｕ ０ ， ４ Ａ ｓ ｉ ｉ ｇ （Ｕ １， ｄ ２ ６ ／ 用ｄＨ０补齐至２ｐ， ｕ ，） ０１１℃反应 １小时．连接物４ ２ ６ ℃保存备用。
ｇｎ ｓｑ ｅｃ ｈ ｓ ｎ ｔｉ ｄ ｅｅ ｕｎｅ ｂｅ ｏ ａ ｅ ． ｅ ａ ｅ ｂ ｎ Ｋ ｙ ｏｄ ｌａ ｉｏｙｌｐｏ ａｅ ｌｃｒｏｙ ｔｓｎｈｓ， ｏｙ ｅ ｅ ｗ ｒｓ － ｍ ｎ ｃｃ ｒｐ ｎ－ －ａｂ ｘｌ ｅ ｔａｅ Ｒｂ ｚｍ ｏ ａ ｙ ｉ
乙烯是植物的内源性激素， 是果实成熟和衰老过程中调节基因表达的最重要最直接的物质．其中乙烯的直接 前体 卜氨基环丙烷狡酸（Ｃ ） Ａ Ｃ的合成是由Ａ Ｃ合成酶这个限速酶催化完成的。１７ 年， ｄｍｓ Ｃ ９９ Ａ ａ 等阐明了乙烯生
１ 期
王永胜 等：特异切 割番茄 １ 氨基环丙烷梭酸合成酶 ｍＲ － ＮＡ 的核酶基 因序列的合成与克隆
２ ９
可能性。一 些研究表明 核酶有优于反 ， 义核酸 之处〔 许多研究者都成功的 ”， 利用人 造核酶在体外实现了对目 基 的
因ｍ ＮＡ的特异性切割， Ｒ 应用核酶尤其是锤头状核酶进行阻断基因 表达的研究越来越广泛。 Ａ Ｃ合成酶基因是一个多基因家族。本文据 Ｒ ｔ ａｎ等 〔 报道的番茄 Ａ Ｃ合成酶的 Ｌ － Ｃ ２ Ｃ ｏｔ ｎ ｍ ６ 〕 Ｃ ＥＡ Ｃ ｍ ＮＡ序列， Ｒ 体外合成并克隆了针对第６７ ６ 位点 Ｇ Ｃ序列特异性切割的长为６ｎ的锤头状核酶， ６－６９ Ｕ ２ｔ 为体外
１川１ ／ ） ｄ ２ 至４川 ３Ｃ 切３ 时 利 低 点 法〔 回 核 片 。 用 脂 凝 浓 ． （Ｕ 川， Ｈ０补 ０。 ７ ５ ５ 用ｄ 酶 小 ，用 熔 胶 ’ 收 酶 段 所 琼 糖 胶 度 〕
为 ２ ％。 ． ５
２． ．３连接反应 ２
在 ２１ 反应体 系中加人载体 Ｍ－Ｚ（） ０１ ＧＥ ３ ｆ 质粒 ＤＮ １１０ｎ／ ， ＋ Ａ （ ０ｇ １ 核酶片段 １１ １ ）
ｓｕ ｂｉ ｚｔ ｎ Ｔ ｅ ｏ ｂｎ ｔ ｔ ｓ ｄ ｗ ｒ ｄｇｓ ｄ ｔ ｒ ｔｃｏ ｅｄ ｎ ｃ ａｅ ｎ ａ ｄ ｉ ｈ ｒ ｉ ｉ ． ｒ ｍ ｉ ａ ｐ ｍｉ ｅ ｉ ｔ ｗ ｈ ｒ ｔ ｎ ｏ ｕｌ ｓ Ｋ Ｉ ｔ ｙ ｄ ａｏ ｈ ｅ ｃ ａｎ ｌ ａ ｓ ｅ ｅ ｅ ｉ ｅ ｉｉ ｎ ｓ ｅ ｐ ｎ
ｔａ Ｃｅ ｖｓ ＮＡ Ｔ ｍａｏ Ｃ ｎｈ ｓ ｈ ｔ ａｅ ｍＲ ｌ ｏ ｏ ｔＡ ｆ Ｃ Ｓ ｔａｅ ｙ
Ｕ ｘ ｎ ＬＵ ｎｄ ＨＵ ｇ ｏ ｕ ａ ｈ ｉ ＷＡＮＧ ｎ ｓｅｇ Ｉ ｏ ｅ ＱＩ Ｒ ｎｉ ｇ Ｉ Ｚ ｏｇ ａ Ｔｎｍａ Ｙｏ ｇｈ ｎ Ｌ Ｈａ ｇ
发夹状（ａｐ ） Ｈ ｉｉ核酶结构模式〔 。锤头状核酶是目 ｒｎ ’ 〕 前已知核酶中最简单的一类。Ｈ ｓｏ 等提出 ａ ｌｆ ｅｆ 只需 １个 １保 守核昔酸的 锤头状（ａ ｍｒ ａ） Ｈ ｍ ｅ ｅｄ ｈ 核酶结构 模式〔 ， ａ 为从全新角度设计、合成序列特异性人造核酶提供了实 ７ 现的
①国家自然科学基金和 内蒙古 自 然科学基金资助项 目 。
Ｂａｍ Ｈ Ｉ
引物 由中国科学院微生物研究所 ＤＮＡ 自动合成仪合成。
１ ． ３菌种和载体质粒
ＥｃｌＪ ０ 为本实验室保存菌种，Ｇ Ｍ－Ｚ（） ． ｉ ９ ｏ Ｍ１ ｐ Ｅ ３ｆ 载体质粒购自 ＋ 北京华美生物工程公司。
２实
验
方
法
２ ． １载体质粒 ｐ Ｅ ３ ｆ ）ＮＡ的提取与酶切 Ｇ Ｍ－ Ｚ（ Ｄ ＋ 按碱裂解法提取质粒ｐ Ｅ ３ｆ） Ｎ （ 。ｐ Ｅ ３ｆ ） Ｇ Ｍ－Ｚ（ 的Ｄ Ａ Ｇ Ｍ－Ｚ（质粒Ｄ Ａ用Ｋｎ和Ｂｍ Ｉ ＋ ７ ） ＋ Ｎ ｐＩ ａ Ｈ 进行双酶
特异切 割 Ａ Ｃ合成 酶 ｍＲ Ａ 第 ６７ ６ 位 点 ＧＵ Ｃ Ｎ ６ －６９ Ｃ序 列的核酶基 因序列。
关健词 １氨基环丙烷梭酸合成酶， 一 核酶
中图 分类号 Ｑ ２， ３ ５２Ｑ ４ ９
Ｃｏ ｉ ｏ ａ ｍ ｅ ｅｄ ｏｙ ｅ ｎ Ｓ ｑｅｃ ｌ ｎ ｆ ｎ ｇ Ｈａ ｍ ｒ ａ Ｒｂｚｍ Ｇ ｅ ｕｎｅ ｈ ｉ ｅ ｅ
ａ ｖ ｉ ｕ １ （ ｐｒ ｅ ｔ ｉｌｇ， ｎ ｅＭｏ ｇ ｌ Ｕｎ ｅｓｙ Ｈ ｈｏ ０ ０２） Ｄｅａｔ ｎ ｏ Ｂｏｏ ｙ Ｉｎｒ ｎｏｉ ｉ ｒｔ， ｈ ｔ ０１ ｍ ｆ
Ａ ｓａｔ ｎ ｅ ｔ ｉｔｒｐｎ ｔｅ Ｃ ｎｈｓ ａｔｉ ｉ ｔｍ ｔ， ａ ｍ ｒｅｄ ｏｙ ｅ － ｂｔ ｃ Ｉ ｏｄｒ ｎｅ ｕｔｇ Ａ ｓ ｔａ ｃｉｔ ｎ ａｏ ａ ｍ ｅｈａ ｒ ｚｍ ｔｒ ｒ ｒ ｏ ｒ ｉ ｈ Ｃ ｙ ｅ ｖｙ ｏ ｈ ｉ ｂ ａ
计合成 ３端部分互补 的一对 引物 。 ＇ 引物 １５ Ｇ ＧＴ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ ＧＴ Ｔ Ｔ ＧＴ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ ３ ４ｍ ｒ ： ＧＧ Ａ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ Ａ ＧＧ － ＇ ｅ ＇ － ０ Ｋｎ ｐＩ 引物 ２５ Ｇ ＧＡ Ｃ Ｔ Ｇ Ｔ ＧＴ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ － ＇ ｅ ： ＧＧ Ｔ Ｃ ＧＴ Ｔ Ｇ Ｔ ＧＴ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｃ ＧＡ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ ＧＡ ＧＡ ３４ｍ ｒ ＇ － ８
ｇｔ ｇ ｃ ａｅ Ｃ ｉｅ ａ ｔｅ ｉｏ ６７ ９ ｏ Ａ Ｃ ｎｈｓ ｍ ＮＡ ｓ ａ ｌｈｄ ｄ ｅ ｅ ｎ ｔ ｌ ｖ ＧＵ ｔｐ ｔ ｈ ｐｓ ｉ ６ 一６９ Ｃ ｓ ｔａｅ ｉ ｏ ｅ ｒ ｌ ｔ ｏ ｔ ｎ ｆ ｙ Ｒ ｗ ｅｔｂｓｅ ａ ｉｔ ａ ｓ ｉ ｎ ｎ－
切割实验及进一步探研核酶一 反义核 酸嵌合基 因的合成与作用奠定了基础。
１实
验
材
料
１ ． １试剂
限制性 内切酶、 Ｋｅｏ ｌ ｗ酶 、Ｔ Ｄ Ａ 连接酶和 Ｒ ａｅ 购 自北京华美生物 工程 公司， ４多核昔酸激 ｎ ４ Ｎ ＮＡ ｓ Ａ均 Ｔ
酶、 － －－ ３０４节－ 一 ５｝ ４氯－－９ ｝ １ Ｄ 半乳糖昔（－ａ、异丙基 Ｘ ｇｌ ） 硫代节－ 一 Ｄ 半乳糖昔（ Ｔ ） ｒｍｇ公司产品 硝 Ｉ Ｇ为Ｐｏ ｅ Ｐ ａ ，
Ｂｍ ． ｐｌ ｃ ｌ ｄ ｇｌｅｃ ｏｈｒ ｉａｄ ｕｎｅ ｌ ｉ ｔ ｓｅ ｔｅ ｕｎｅ ｏｅ ａ ＨＩＢ ｏｙ ｒａ ｅ ｓ ｔ ｐｏｅｓ ｓｑｅｃａａ ｓ， ｉ ａｄ ｓ ｅｃｏ ｎ ｏ ｙ ａ ｙ ｍｉ ｅ ｌ ｒ ｅ ｓ ｎ ｅ ｎ ｙｓ ｈ ｚ ｎ ｈ ｅ ｅ ｑ ｆ ｆ ｔｅ ｅｔ ｐｏｕｔ ｔｅ ｅ ｔｏｅ ｗ ａｗ ｅｐｃ ｄＴ ｅｅ ｕｓ ｗｄ ｔ ｒ ｏｙ ｅ ｈ ｄ ｓｄ ｄｃｗ ｓ ｓｍ ａ ｈｓ ｏ ｈｔ ｘｅｔ ． ｓ ｒ ｌ ｓｏ ｅ ｔａ ｔ ｉ ｚｍ ｉ ｅ ｒ ｇ ａ ｈ ａ ｓ ｆ ｅ ｅ ｈ ｅ ｔ ｈ ｓ ｈ ｈ ｂ ｅ
遗传 Ｈ Ｒ ＤＩＡ （ｅｉｇ ２（） ２一３ １９ Ｅ Ｅ Ｔ Ｓ ｉｎ ） １ ８ ２ ８ Ｂｊ ０ ： ９
特异切割番茄 １ 氨基环丙烷梭酸合成酶 一 ｍ Ｎ Ｒ Ａ的核酶基因序列的合成与克隆①
王 永胜 李浩 戈 仇 润祥 刘 中大 危廷 茂