CrisperCas9技术介绍-修正版.pdf
CRISPR-Cas 9靶向基因操作技术
3 靶向：对特定目标(分子、细胞、个体等)采取的行动。如外源基因在宿主 细胞基因组DNA预期位置上的定向插入；药物分子对效应靶组织或细胞的定 向传送或作用 。
CRISPR-Cas系统的发现
1 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸 进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。
Cas 9
TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9 蛋白(分子质量很大的多功 能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA 或是外源质粒。
Cas9 蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc 核酸酶的活性， 一个在中部有类似HNH 核酸酶的活性。
嗜热性链球菌具有典型的TypeⅡ CRISPR/Cas 系统，它的CRISPR/Cas 系 统编码tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指导RNaseⅢ和Cas9 完成前体 crRNA 的成熟。随后tracrRNA 还能与成熟的crRNA 的重复序列配对形成 RNA 二聚体，进而和Cas9 蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解 入侵的外源DNA 功能[36]．
Cas9才会对DNA进行剪切。
2、可实现对靶基因多个位点同时敲除。
3、实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。
基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享
基因编辑技术CRISPRCas9的使用教程与最佳实践分享在现代生物学研究中，基因编辑技术的出现为研究人员提供了一种高效、精确、低成本的方式来研究基因功能和调控机制。
CRISPR-Cas9系统作为一种革命性的基因编辑工具被广泛应用于基因组编辑、疾病治疗和农业改良等领域。
本文将为您介绍CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程，并分享一些最佳实践。
CRISPR-Cas9基因编辑技术概述CRISPR-Cas9是一种依靠细菌天然的免疫机制发展而来的基因编辑技术。
CRISPR是一种特殊的DNA序列，可与Cas9酶一起，通过识别和切割DNA序列来精确编辑基因组。
CRISPR-Cas9系统的主要组成部分包括CRISPR RNA （crRNA）、转录单元结构化RNA（tracrRNA）和Cas9酶。
crRNA负责识别目标DNA序列，而tracrRNA将crRNA与Cas9酶结合起来形成活跃的CRISPR-Cas9复合物。
CRISPR-Cas9基因编辑技术的使用教程1. 设计并合成RNA引导序列在使用CRISPR-Cas9进行基因编辑之前，首先需要设计并合成RNA引导序列。
该序列用于指导Cas9酶精确识别和切割目标基因组DNA。
合成的RNA引导序列通常由crRNA和tracrRNA合成而成，也可以合成一个融合的single-guide RNA （sgRNA）。
2. 构建CRISPR-Cas9载体CRISPR-Cas9基因编辑需要将Cas9酶和RNA引导序列导入目标细胞内。
可使用载体如质粒或病毒进行基因编辑构建。
选择合适的载体需考虑目标细胞类型、转染效率和所需编辑范围等因素。
将Cas9基因和RNA引导序列克隆至载体后，可通过转染或病毒介导转染等方法将其导入目标细胞。
3. 确定编辑效果在导入CRISPR-Cas9系统后，使用分子生物学方法来验证编辑效果。
例如，PCR、测序、Western blot或免疫组化等技术可以用于检测目标基因的突变、修复或敲除效果。
CRISPR Cas 基因编辑技术简介
1.CRISPR/Cas系统概述
1.2CRISPR系统获得：
CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系 统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白 进行切割，从而达到对自身的免疫。
2.CRISPR/Cas系统结构
2.1CRISPR/Cas 主要由两部分组成：
2.CRISPR/Cas系统结构
4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座 上游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与 crRNA的加工，这个 工程亦需要RNaseIII 的参与；
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
crRNA结合相关的Cas蛋白后， 形成crRNA-Cas蛋白复合体， 通过碱基互补配对精确地 与目标DNA相结合，随后 Cas蛋白对目标DNA 进行断 裂和降解。
基因编辑技术CRISPR/Cas9
1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
CRISPRCAS9慢病毒系统概述.pdf
CRISPR/CAS9验证：
Cancer Cell. 2014 May 12;25(5):652-65. doi: 10.1016/r.2014.03.016. Epub 2014 May 1. MLL3 is a haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia
date：2014 May
Paper 2: Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with
a lentiviral CRISPR-guide RNA library.
• IF：39.08
Journal：Nat Biotechnol date：2014 Mar
Paper 1:
MLL3 is haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia.
IF：24
Journal: cancer cell
date：2014 May
MDS（骨髓发育不良症候群）和AML（急性髓细胞样白血病）常见染色体7q部分
吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍
ctl nc C1 C2
Cas9
nc G1 nc G2 nc G3
切割： Lenti-CAS9-puro 滴度可达2E+8 已成功构建两株CAS9稳定表达细胞株
让我们用心，换取您的放心！
定位：Lenti-sgRNA-EGFP 滴度可达3E+8以上 可成功引入突变
CRISPR/CAS9 VS RNAi-表型呈现
RNAi 敲减OK 无表型
CRISPRCas9
CRISPR-Cas系统靶向要求
• 最主要的要求： • PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。
• Cas9蛋白来源于细菌，因此要让Cas9蛋白高 • 效地转运到哺乳动物细胞核内，需要在Cas9 蛋白的N端或是C端加上真核细胞的核定位 信号。从目前发表的论文来看，在Cas9蛋白 的C端添加核定位信号，似乎是提高Cas9蛋 白的核转运最有效的方法。
外源遗传物质的干扰
• 干扰是CRISPR/Cas9发挥抵御外源遗传物质 入侵最关键的步骤，成熟的crRNA与特异的 Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源 DNA结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶 序列，crRNA的间隔序列与靶序列互补配对， 外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复 合物切割。
作用机理
CRISPR/Cas9作用机制
• • • • 对于CRISPR/Cas9的作用机理可以分为三个阶 段来理解： 第一是CRISPR的高度可变的间隔区的获得。 第二是CRISPR基因座的表达(包括转录和转录后的 成熟加工)。 • 第三是CRISPR/Cas9系统活性的发挥或者是对外源 遗传物质的干扰。
局限性
• 脱靶效应 • Cas9蛋白对于目标序列的切割不仅仅依靠 crRNA序列的匹配，在目标序列(protospacer) 附近必须存在PAM。 • CRISPR/Cas9系统所靶向的序列仅需十余个 碱基对精确配对，这可能会降低 CRISPR/Cas9系统切割的特异性。 • CRISPR/Cas9系统也面临着如何控制双链断 裂之后的非同源末端连接修复可能随机产 生细胞毒性的问题。
TypeⅢ
• TypeⅢ系统包含特征性的Cas10蛋白，主要 参与crRNA的成熟和剪切入侵外源DNA 。
CRISPR-Cas9基因编辑技术简介
CRISPR-Cas9基因编辑技术简介中学生物科学登录CRISPR-Cas9基因编辑技术简介一林黄叶731 人赞同了该文章来源｜公众号：中学生物科学CRISPR-Cas9基因编辑技术简介/s?__biz=MzUzMjE2ODkxOA==&mid=224749 0541&idx=1&sn=1db981f771aab1bf6ff57f070d35f468&chksm =fab63254cdc1bb4243bd7e781027a571dd3a76f2355e38eff36b 5bd2635ad5636e8ea9fe914c&token=1724268749&lang=zh_CN #rdCRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。
一、什么是CRISPR-Cas系统CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统。
某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为CRISPR 的存储空间。
当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。
C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。
1、CRISPR（/'krɪspər/）是原核生物基因组内的一段重复序列。
CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。
分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。
（注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌）CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成。
CRISPR-Cas9文库技术原理及应用
CRISPR-Cas9文库技术原理及应用CRISPR-Cas9技术原理CRISPR-Cas9技术凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR-Cas9技术迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手，是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。
CRISPR-Cas9系统最初在大肠杆菌基因组中被发现，是细菌中抵抗外源病毒的免疫系统。
CRISPR-Cas9系统由两部分组成，一部分是用来识别靶基因组的，长度为20bp左右的sgRNA 序列，另外一部分是存在于CRISPR位点附近的双链DNA核酸酶——Cas9，能在sgRNA的引导下对靶位点进行切割，最终通过细胞内的非同源性末端连接机制（NHEJ）和同源重组修复机制（HDR）对形成断裂的DNA进行修复，从而形成基因的敲除和插入，最终实现基因的（定向）编辑。
与前两代技术相比，CRISPR-Cas9技术最大的突破是不仅可以对单个基因进行编辑，更重要的是可以同时对多个基因进行编辑，这也为全基因组筛选提供了有效的方法。
目前比较常见的文库类型包括：●CRISPR-Cas9 knock out文库●CRISPR panal文库●CRISPRa/i文库●psgRNA文库CRISPR-Cas9文库建库流程●靶位点确认及sgRNA文库设计●sgRNA文库芯片合成●sgRNA文库构建●QC验证文库质量●sgRNA文库慢病毒包装●感染稳定细胞株●药物筛选实验●细胞表型筛选●NGS测序验证功能基因CRISPR-Cas9文库应用方向1、药物靶点确定与验证CRISPR-Cas9筛选技术可以应用于药物靶点筛选中，通过大规模筛选技术，可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因，从而为疾病治疗提供相关数据。
SCIENCE发表文章[1]，研究人员利用CRISPR-Cas9文库筛选人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选，最终发现NF2、CUL3等4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。
CRISPRCas9基因敲除技术是什么？
CRISPRCas9基因敲除技术是什么？
CRISPR/Cas9系统由核酸酶Cas9和单链向导RNA (single guide RNA, sgRNA)组成。
Cas9蛋白具有两个核酸酶结构域——RuvC样结构域和HNH结构域（RuvC结构域负责切割靶向链，而HNH负责切割与sgRNA互补配对的非靶向链），它可以在DNA的特定位置引入DSBs。
sgRNA来源于反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）和CRISPR RNA（crRNA）。
每个crRNA包含一个保守的与tracrRNA互补的重复序列和一个与外源DNA互补的20 nt的转录间隔区。
tracrRNA与crRNA互补后结合Cas9蛋白，形成CRISPR/Cas9-sgRNA复合物，在基因组的目标位点产生双链断裂。
图1. CRISPR/Cas9系统的结构成分
（Sun J et al. Brief Funct Genomics. 2020;
Liu C et al. J Control Release. 2017）
TracrRNA/crRNA通常被设计成单链小片段的向导RNA—sgRNA。
sgRNA主要包含两个关键片段：3'端的双股RNA结构与Cas9蛋白结合，5'端的引导序列与目标DNA序列结合。
与TALENs相比，CRISPR/Cas9具有成本低、效率高和简单易用等优势，因而被人们广泛应用。
下表所列为TALENs和CRISPR/Cas9两种技术的比较：。