最新HPLC色谱条件的优化与色谱
各国药典关于HPLC色谱条件允许调整范围
欧洲药典EP
流动相PH值 缓冲盐浓度 ±0.2，pH7.6可以在 7.4-7.8之间调整 ±10%，20mM磷酸钾可以 在18-22mM范围内，只要 pH值符合要求就行 ±30%，最小组成的比例 可以调整30%，但是，任 何组成的比例的改变不 能超过±10%.60:40乙腈 /水，水的比例可以调整 ±12%（=40*30%），但 是这超过了±10%的限制 。因此，这个条件下， 水的比例只能在30%至 50%之间进行调整。 不允许调整 ±70%，150*4.6mm规格 的色谱柱，柱长可以改 变±105mm ±25%，150*4.6mm规格 的色谱柱，内径可以改 变±1HP2010
流动相组成比例
紫外可见检测器检测波长 色谱柱长度
色谱柱内径
粒径
流速 进样体积 柱温 梯度洗脱
±0.2，pH7.6可以在7.4未明确 7.8之间调整 ±10%，20mM磷酸钾可以在 18-22mM范围内，只要pH值 未明确 符合要求就行 ±30%，最小组成的比例 ±30%，最小组成的比例可 可以调整30%，但是，任 以调整30%，但是，任何组 何组成的比例的改变不能 成的比例的改变不能超过± 超过±10%.60:40乙腈/ 10%.60:40乙腈/水，水的比 水，水的比例可以调整± 例可以调整±12% 12%（=40*30%），但是这 （=40*30%），但是这超过 超过了±10%的限制。因 了±10%的限制。因此，这 此，这个条件下，水的比 个条件下，水的比例只能在 例只能在30%至50%之间进 30%至50%之间进行调整。 行调整。 不允许调整 不可改变 ±70%，150*4.6mm规格的色 可适当调整 谱柱，柱长可以改变± 105mm ±25%，150*4.6mm规格的色 可适当调整 谱柱，内径可以改变± 1.15mm 可以适当调整；一般 3~10um，粒径更小（约 可以降至50%，10um的粒 可以降至50%，10um的粒径 2um）可用。孔径：分子 径可以调整为5um 可以调整为5um 量小于2000，孔径在150A 以下；分子量大于2000， 孔径300A。 ±50%，1mL/min流速可 ±50%，1mL/min流速可以在 可以适当调整 以在0.5至1.5mL/min范 0.5至1.5mL/min范围内变化 围内变化 只要精密度和检测限可 只要精密度和检测限可以达 可以适当调整 以达到要求就可以减少 到要求就可以减少 10%，最大不超过60℃ 10% 一起系统过大的滞留体 积会明显改变分离度， 保留时间和相对保留时 间
HPLC色谱条件的优化与色谱
HPLC色谱条件的优化与色谱HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析方法，广泛应用于药物、环境、食品等领域。
HPLC色谱条件的优化对于提高分离和检测的灵敏度、分离效果和分析速度非常重要。
下面将介绍HPLC色谱条件的优化以及HPLC色谱的发展。
首先是样品前处理，样品前处理的目的是去除干扰物、浓缩样品和改善样品溶解性。
常用的样品前处理方法包括固相萃取、液液萃取、蒸发浓缩等。
选择合适的样品前处理方法可以提高样品的灵敏度和准确性。
其次是色谱柱选择，色谱柱的选择对于色谱分离效果和分析速度有很大影响。
常见的色谱柱有反相柱、离子交换柱、凝胶柱等。
根据具体分析物的性质和需求选择合适的色谱柱可以提高分离效果。
流动相选择是HPLC色谱条件优化中很关键的一步。
常用的流动相有水、乙腈、甲醇等有机溶剂和一些缓冲溶液。
通过调整流动相的比例、溶剂类型和缓冲溶液的pH值可以提高分离效果、降低柱背压和改善峰形。
检测波长选择也是HPLC色谱条件中的一个重要环节。
根据分析物的特征选择合适的检测波长可以提高检测的灵敏度和选择性。
常见的检测器有紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
最后是色谱条件参数优化，色谱条件参数包括流速、柱温、进样量、柱背压等。
通过对这些参数的优化可以实现快速分离和高效分离。
优化色谱条件参数还可以提高信噪比、减少噪声、降低回收率和节约试剂等。
优化色谱条件参数需要根据具体的样品和需求进行调整，需要进行多组实验来找出最佳的条件参数。
此外，随着科学技术的发展和人们对分析能力的要求提高，HPLC色谱也在不断发展。
现代HPLC色谱已经发展出许多新的技术和方法，如超高效液相色谱（UHPLC）、毛细管电泳段（CEC）、离子色谱（IC）等。
这些新的方法和技术具有高分辨率、高灵敏度和高效率的特点，能够更好地满足各类分析需求。
综上所述，HPLC色谱条件的优化对于提高分离效果、分析速度和灵敏度至关重要。
通过合理的样品前处理、色谱柱选择、流动相选择、检测波长选择和色谱条件参数优化等方面的优化，可以获得更好的分析结果和数据。
2020版《中国药典》通则0512 HPLC 如何优化色谱方法
2020版《中国药典》通则0512 HPLC 如何优化色谱方法随着超高效液相技术（小粒径色谱柱的应用）的发展，药典在适应新技术的使用，指导企业如何去优化方法，达到缩短分析时间、节省流动相的目的。
今天，我们一起来分析在保持与现有方法相似的分离效果的前提下，如何选择合适的色谱柱和相应的色谱参数。
一、2020版药典与2015版药典0512参数调整对比表1：2020版药典与2015版药典0512参数调整对比（其余参数，如流动相比例、缓冲盐浓度、柱温、pH等改变，本文不涉及，此处不细说）上表1中A/B/C三项，扩充了色谱柱的选择范围，而D/E/F则针对具体的每一个参数调整提供计算方式。
下面，我们用具体的案例进行推导。
二、案例推导1、改变柱长L和粒径dp假设当前一个色谱方法为：目标：保持分离度R基本不变，缩短分析时间和流动相。
过程：根据公式1：其中，k为保留因子，α为选择因子。
当色谱柱固定相、流动相的组成及比例、柱温不变，则α和k不变。
因此，分离度R仅与理论塔板数N相关。
而N∝L/dp（正比），只要保持L/dp基本不变，则R基本不变。
当前色谱柱Column1的L1/dp1=250/5=50，所以需要从当前市场上常用的色谱柱中选择L/dp≈50的色谱柱，例如柱长为100mm，粒径dp为1.8μm的色谱柱，则L2/dp2=100/1.8=56，与当前色谱柱Column1的L1/dp1基本一致（比Column1的L1/dp1值50变化+12%，在药典规定的-25%~+50%范围内。
有一定程度的增加，但有利于分离度R）。
注：此处粒径1.8μm是全多孔填料，产生的柱压比较高，因此，可选择表面多孔填料，例如2.7μm粒径的表面多孔填料色谱柱，因为其特殊的填料技术，实际的硅胶粒径仍只有约1.8μm（如下图1）。
图1：全多孔填料和表面多孔填料示意图。
常职院仪器分析测试技术教案5-6高效液相色谱法：分离条件的选择与优化
液相色谱分析法模块之任务6分离条件的选择与优化教学任务口进行多环类芳烧类混合物测定的分离条件选择试验口根据实验数据，归纳总结条件选择的方法，选择的最佳分离条件□评价色谱柱的性能，了解色谱柱性能的评价方法教学方法□引探和讲练结合教学学时□每20人为一个学习组，4人一台液相色谱仪，分组循环操作，整个任务需6学时。
教学设计问题：如何选择分离苯、禁、联苯的最佳分离条件？I汇总所查资料，师生共同讨论，教师总结实验步骤学生完成分离为件选择试验*分组讨论，选择苯、禁、联苯最佳的分离条件学生讨论并得出结论，教师总结讲解影响色谱分离度的因素I色谱柱性能评价方案的建立学生完成色谱柱性能的评价■学生根据实验讨论，教师总结色谱柱的评价方法I下次课程问题：果汁中防腐剂含量的测定？如何验证该方法的可行性？课程引入□问题：苯、蔡、联苯为芳烧类混合物，如何选择一个最佳的色谱分离条件，既能达到良好的分离度，又能在短时间内完成分析任务？（上次课结束后即布置并安排学生在课后查阅资料）□学生根据所查资料提出解决方案并进行现场讨论以确定每组的实验方案。
融师引导学生，指出分离条件包括的内容，如流动相比例、流速的调节、色谱柱的选择等。
）□根据学生已能熟练操作液相色谱仪，并有了系统的液相色谱知识，因此，本项目经分组讨论后，直接进行操作。
学生操作：苯、蔡、联苯最佳分离条件的选择（本过程教师学生自行操作，但在操作过程中，教师是辅导者，及时指正解惑）□改变流动相的比例，进行条件实验□改变流速，进行条件实验□记录下样品名对应的文件名，同时打印出经优化的色谱图和分析结果□通过处理数据，运用逻辑思维能力和判断能力对各组实验数据进行取舍学生对测定过程提问、相互讨论与教师的阶段总结（本过程教师对学生的疑惑进行解释）□在操作中，每改变一次流动相比例，仪器均需平衡后方可进样。
□分离度、理论塔板数和分析时间，作为判断分离条件合适的参考参数。
□学生根据实验数据，每组得出苯、蔡、联苯最佳的分离条件。
中国药典版--高效液相色谱法
现象3：基线漂移
判断————————————------------------排除方法 （1）溶剂贮槽污染---------------（1） 清洗贮槽装入新的流动相冲洗柱子 （2）前次分离样品中的强吸附组分 从柱上洗脱-------（2）在分离之前用强 流动相从柱中洗脱所有的组分：使用溶 剂梯度清洗柱子 （3）由微粒造成柱入口、进样阀、 柱入口的部分堵塞--（3）清洗进样系统 和柱入口过滤片
色谱条件与系统适用性试验
按各品种项下的要求对仪器进行适用 性试验，即用规定的对照品对仪器进 行试验和调整，应达到规定的要求； 或规定分析状态下色谱柱的最小理论 板数、分离度、重复性和拖尾因子。
（1） 色谱柱的理论板数
色谱柱的理论板数(n) 在选定的条件下，注入 供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液， 记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰 的保留时间tR（以分钟或长度计，下同,但应 取相同单位）和半高峰宽(Wh/2)，按 n=5.54(tR／Wh/2)<2>计算色谱柱的理论板数， 如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小 理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长， 载体性能，色谱柱充填的优劣等），使理论板 数达到要求。
6最低检测限的意义 最低检测限虽然是个绝对值，但其真正 意义确是相对值，即相对于供試品溶液 的中样品浓度的多少而言，，设定杂质 总量不得过1.0％。最低检出限通常许达 到对照溶液浓度的十分之一到五十分之 一。 7使用对照品外标一点法测定时的关键是 什么 使用对照品外标一点法测定时的关键是 尽量保持样品溶液和对照品溶液的浓度 一致。
（4）泵中有气泡，泵压不稳-----------（4） 赶除聚集于泵头内的气泡 （5）溶剂纯度不高，背景吸收强，透 光差------ -------- -------- （5）提纯溶剂或 选纯度比较高、透光性好的溶剂作为流动 相 （6）检测池污染-------------（6）清洗检 测池 （7）示差折光检测器液槽漏 --------（7）检修或更换液槽
HPLC培训(峰与色谱条件)课件
高效液相 色谱
基本原理
加样
流动相
流动相
A
C
B
B
C
A
固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。
HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分 配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达 到分离的过程。
基本操作
1.打开泵电源，待自检完成后打开“Purge”阀进行排液以除去泵头之 前的气泡，排气完成后关闭“Purge”阀。按“Pump”键开启泵，然 后按“func”及数字键以0.2ml/min的速度慢慢将流速调1.0ml/min
色谱柱的良好使用规范
溶剂使用前必须过滤 运输中变干了的色谱柱要完全浸湿（预处理） 如果样品中含有无需考虑而保留强的组分时,必须进行前处理 清楚了解色谱柱填料适用的pH范围(3-7)，温度(<60),化学适应性 使用新鲜的水溶液,流动相现用现配制 定期用强极性溶剂冲洗色谱柱 储存色谱柱时,要将缓冲液冲洗干净,并保存在适合的溶剂中,如甲醇、
计算公式
或
重复性
用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。
采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连 续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标 准偏差应不大于2.0%。
相对标准偏差 RSD
采用内标法时，其相对标准偏差应不大于2.0%。
拖尾因子（T）
用于评价色谱柱的对称性。
反应峰
色谱柱故障诊断-- 峰形问题
拖尾峰－－对称因子>1.2
Normal
Tailing
Normal
Tailing
可能的原因
有些峰拖尾
1、二次保留效应，残留的硅羟基影 响
2、在大峰的尾部有小峰流出（DAD）
高效液相色谱法（hplc）
高效液相色谱法(HPLC)一．概述色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。
二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。
目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。
现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。
HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。
1．HPLC的特点（1）适用范围广已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。
HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。
（2）流动相及固定均与样品分子作用，而GC仅固定相与样品分子作用。
（3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于各种化合物分析。
（4）分离温度较低，提高了分离效率。
（5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测器等。
（6）样品易回收。
2．HPLC分类按分离机理分为四类：吸附色谱（液固）：通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。
对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合相色谱替代，常用硅胶柱。
分配色谱：不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。
现代分配色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。
大部分分离问题都可用键合相色谱解决。
离子交换色谱：以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。
用于分离无机或有机离子。
固定相为阴（阳）离子交换树脂，流动相为电解质溶液。
分子排阻色谱：按物质分子量大小进行分离。
不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。
液相色谱分析方法的建立【最新】
一. 方法建立的步骤二．开始前应知道1. 样品的性质在开始方法建立之前，我们应该检查自己对样品的了解程度，并明确分离目标。
表 1 有关样品组分和性质的重要信息所含化合物的数目化合物的化学结构（官能团）化合物的分子量化合物的pKa值化合物的UV光谱图化合物在样品中的浓度范围样品的溶解度样品的化学成分能够为选择HPLC分离的最佳初始条件提供有价值的线索根据已知的样品信息，HPLC方法建立有两种不甚相同的模式。
一种模式依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件，色谱工作者需很大程度依赖于过去的经验（如类似结构化合物的分离）和/或用文献资料补充现有信息而另一种模式则直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意这两种HPLC的方法建立模式可分别称为理沦型与经验型初始分离一旦开始，可以根据类似的思路（理论的与经验的）选择进一步的实验。
2.分离的目的HPLC分离的目的必须十分明确，下面的问题在建立方法之初就应确定：（1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？；（2）是否有必要解析出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。
（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度通常能达到±1—2%，特别是不需样品预处理的情况。
（4）特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。
是否需要一种以上的HPLC方法？单一方法分离不同形态样品是否理想？（5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变得非常重要。
有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代价，如缩短柱长或加快流速。
当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。
（6）将要使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行？方法建立实验开始之前，应明确对方法的这些要求。
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● 温度匹配 流动相须预热至柱温，温度匹 配可以使柱效提高50%以上。
柱后应配冷却单元，使洗脱液温度快速 降到一固定值（如35℃），以避免检测信号 的波动。
● 色谱柱 以硅胶为基质的填料，其使用温 度一般不超过60℃；HTLC使用以氧化锆、 多孔石墨碳、高分子微球为基质的填料或采 用多配位基有机硅胶为填料。
1、温度 柱温提高到40℃以上，谓之 HTLC（40℃—200℃）
● 温度上升→流动相粘度下降→流速增加 （≤8ml/min）→容量因子K下降→保留时
间缩短
●粘度降低→柱压下降→可采用细粒径填料 （＜3um）或长色谱柱→提高柱效
●提高灵敏度 色谱峰高与柱温呈指数函数 关系，即峰高的对数与柱温呈线性关系
1、柱效与流速的关系 存在最佳流速
2、柱效与填料粒径的关系
a）A=2λ·dp 式中 2λ为与填充均匀性有关的因数 dp为填料的粒径
b）小的dp有利于传质
c）减小填料粒径可显著提高柱效
由上表可见，减小dp可显著提高柱效→缩短
恒压
色谱柱 → 增加流速
↓
↓
缩短洗脱时间
三、影响分离效果的其他因素
适当改变流动相的组成、组分的比例或添加 调节剂。
5、N与α对Rs贡献的比较
二、Van Deemtor方程
h=A·F1/3+B/F+Cm·F+Cs·F=A·F1/3+C·F 式中 h=1/N 理论塔板高度
F=流动相流速 Cm，Cs=溶质在流动相和固定相中的浓度 B=纵向扩散的贡献因子（纵向浓度梯度） A=涡流扩散的贡献因子（色谱柱的不均匀性） 溶质在液体中的扩散系数比气体中小4—5个数 量级，所以在HPLC中在通常的流速条件下B项的贡 献可忽略 不计。
HPLC色谱条件的优化与色谱
混合物中不同组分在两相间平衡分配性质的 差异是色谱分离的基础，研究物质平衡分配的内 容属于色谱热力学的范畴。
容量因子K决定了组分的保留时间，而分离因 子α决定了组分的分离选择性。这二个重要的色 谱参数都取决于溶质、固定相和流动相的热力学 性质。在溶质、固定相和流动相的某种组合下， 只要不同组分的平衡分配性质存在差异，而且这 种差异又足够大时，就有可能实现分离。
溶剂 正己烷 乙醚 三乙胺 环己烷 醋酸乙酯 三氯甲烷 四氢呋喃
苯 二氯甲烷
δ
溶剂
δ
7.3
二氧六环 9.8
7.4
丙醇
10.2
7.5
乙醇
11.2
8.2 二甲基甲酰胺 11.5
8.6
乙腈
11.8
9.1
醋酸
12.4
9.1
甲醇
12.9
9.2
甲酰胺
17.9
9.6
水
21
对于大多数溶剂，极性参数（p）与溶解 度参数（δ）基本呈平行关系。
混合溶剂的溶剂强度按体积比取加权平 均值。
溶剂强度2个单位的变化一般可引起容量 因子10倍的变化。
3、N 理论塔板数 a）N=16（tR/W）2或5.54（tR/Wh/2）2 b）N对分离度的影响 Rsα N c）提高柱效的方法 ● 增加柱长 ● 改进柱填料（纯度、物理性状） ● 提高填装质量
4、α 分离因子 a）α= K2/K1 = t＇R2 / t＇R1 b）α对分离度的影响 Rs α（α-1）/α 影响敏感，α的微小变化可显著改变Rs c）改变α的方法 在保持流动相极性基本不变的前提下，
2、pH 引入次级化学平衡（电离、络合、 离子对等）改变溶质的浓度或存在形式，用 以提高选择性。
3、柱外效应 UPLC的技术要求 V池＜0.1 V柱（2—5ul） V管路＜0.1 V柱（0.1mm,id） V进样＜0.15V峰（2—5ul） tC＜0.1tR（10—15S，自动进样器） V死＜0.3ml
峰高随柱温呈指数增加时，灵敏度也呈 指数增加，数据表明，柱温从30℃上升至 90℃，定量限约可降低10倍。
●改善选择性 不同溶质的保留时间随柱温 变化的程度不尽相同，有可能使原来未分 离的成分的得到基线分离，甚至发生洗脱 顺序逆转。
这种温度使选择性改变的特性在混合物 的分离中非常有用，因为它只需简单地改变 柱温，而无需改变其他色谱条件。
b）Rs＜0.8 不符合分析化学要求
Rs=1
二峰重叠2%
Rs＞1.2 二峰完全分离
2、K 容量因子 a）K=（tR-tO）/to b）K对分离度的影响 Rs α k/（K+1）
一般K取2-10，以2-4最好。 c）改变K的方法
改变流动相的溶剂强度（常以溶剂的溶解 度参数或极性参数表示）。
常用溶剂的溶解度参数δ（25℃）
3、综合评估 a）结合效率和成本考虑，在不少情况下2u
的填料未必比3u的填料有太多的优势
b）采用亚-2um填料时应考虑： ● 使用现有设备的能力 ● 利用选择性的可能性
c）展望 不是现在，也许是不远的将来
谢 谢！
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死体积的影响 ● 延迟出峰时间 ● 减低柱效 ● 使梯度曲线变形
四、UPLC（UFLC）的评估
1、优势： ● 柱效高 ● 运行时间短 ● 适用于高通量筛选 ● 便于与MS联用
2、短处： ●高柱压降（泵，摩擦生热导致柱效下降和选
择性变化） ●色谱成分残留 ●进样器交叉污染 ●供试液需径0.2u滤膜过滤 ●可选色谱柱有限 ●不太适合生物学基质样品 ●不适用于常规质量控制 ●尚未通过GLP认证
要使分离的可能性变为可行，则必须 设法控制色谱过程中使色谱峰发生展宽的 各种外在因素。色谱峰的展宽主要决定于 柱填料的性质以及填装质量，例如填料颗 粒大小、粒径分布、形状、表面积、孔径、 孔体积，等等。研究柱效与各种影响因素 的关系是色谱动力学的内容。
1、Rs分离度
a）Rs=2（tR2-tR1）/（W2+W1）或 1.18（tR2-tR1）/（W2,h/2+W1,h/2）