玉米叶片蛋白质双向电泳方法的优化

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ISO_DALT双向电泳方法的优化与改进

福建农林大学学报(自然科学版)第35卷第2期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Editi on)2006年3月I S O2DAL T双向电泳方法的优化与改进王经源1,陈舒奕2,梁义元1,林文雄1(1.福建农林大学农业生态研究所,福建福州350002;2.宁德出入境检验检疫局,福建宁德352100)摘要:通过对I S O2DALT双向电泳技术进行优化与改进,建立了一套适合于UV2B胁迫下水稻蛋白质组分析的双向电泳技术.用此方法对经低剂量UV2B辐射处理的水稻品种I R64的叶片蛋白进行双向电泳,可以分辨出1200-1300个蛋白(肽)点,等电点(p I)在3.5-9.3之间,相对分子质量在10-120ku之间,分辨率较高,且重复性较好.关键词:I S O2DALT;双向电泳;蛋白质组;水稻中图分类号:Q946文献标识码:A文章编号:167125470(2006)022*******I m provem en t of I SO2DAL T electrophoresis systemWANG J ing2yuan1,CHE N Shu2yi2,L I A NG Yi2yuan1,L I N W en2xi ong1(1.I nstitute of Agr o2ecol ogy,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian350002,China;2.N ingde Entry2Exit I n2 s pect and Quarantine Bureau,N ingde,Fujian352100,China)Abstract:This paper intr oduced an i m p r oved I S O2DALT electr ophoresis system for O ryza sativa p r oteom ic res ponding t o UV2B radi2 ati on.The leaf p r oteins of I R64radiated with UV2B were extracted and separated with22di m enti on electr ophoresis.About1200-1300p r otein s pots were identified on the2D2gel.The p I of these p r oteins ranged fr om3.5t o9.3with molecular weight distributing fr om10t o120ku.Key words:I S O2DALT;22di m enti on electr ophoresis;p r oteome;O ryza sativa随着包括水稻、人类在内多种生物基因组测序的完成,生命科学研究进入了后基因组时代,而从蛋白质组(p r oteome)水平上研究基因功能的蛋白质组学(p r oteom ics)分析是进行功能基因组学研究的重要内容与方法[1],也是作物分子生态学的核心技术之一[2].自1975年O′Farrell提出高分辨率双向电泳技术[3]以来,该技术有了长足的发展,并与质谱技术、生物信息学成为蛋白质组学研究的三大核心技术[4].根据第1向等电聚焦方式的差异,双向电泳依其第1向电泳介质的不同主要有I S O2DALT与I PG2DALT两大系统.其中,使用载体两性电解质的I S O2DALT可自由决定等电聚焦电泳规模和pH梯度曲线,而且对仪器设备要求不高、费用较低,被广泛地应用于蛋白质组学研究[5-7],但在实际应用中,与I PG2DALT系统相比, I S O2DALT存在着阴极漂移(cathode drift)、重复性较低等缺点[4].为此,在水稻对UV2B辐射胁迫反应的差异蛋白质组学研究中对I S O2DALT技术进行了优化,以期为深入研究其逆境分子生态学机制提供技术支撑.1　材料与方法1.1　试剂与仪器两性电解质Ampholine(pH3.5-10,pH5-8)购自Amersha m Phar macia,Nonidet P240、CHAPS、TE MED、丙烯酰胺、N,N′2甲叉双丙烯酰胺等购自上海生工生物工程有限公司,尿素、过硫酸铵等常规化学药品均为国产分析纯试剂.电泳仪及蛋白质双向电泳槽均为北京六一仪器厂产品.1.2　植物材料水稻品种I R64,由国际水稻研究所提供,培养至6叶期,按林文雄等[8]的方法进行UV2B胁迫处理.收稿日期:2005-06-22 修回日期:2005-11-14基金项目:国家自然科学基金(30471028);福建省教育厅(K03015)和福建省自然科学基金(B0510014)资助项目.作者简介:王经源(1972-),男,讲师,硕士.研究方向:植物分子生物学.福建农林大学学报(自然科学版)第35卷1.3　叶片蛋白质样品的制备1.3.1　叶片蛋白质干粉制备　取经UV2B处理的I R64旗叶500mg,液氮速冻后加50mg P VP2K30,于液氮浴中磨成细粉;迅速将粉末移至10mL离心管,加入5mL预冷体积分数为10%的三氯乙酸丙酮溶液(含10mmol・L-1巯基乙醇),混匀;于-20℃沉淀1h以上;于4℃18000g离心15m in;沉淀用5mL预冷的丙酮(含10mmol・L-1巯基乙醇)按上述方法重悬、沉淀并离心,最后真空抽干所得的沉淀.1.3.2　蛋白质溶液制备　取50mg叶片蛋白质干粉,加入750μL裂解液[9mol・L-1尿素,40g・L-1 CHAPS,5g・L-1DTT,体积分数为2%Ampholine(pH3.5-10),40mmol・L-1Tris],于超声波清洗器中25℃水浴超声处理10×1.5m in,每次超声处理间隔期间振荡混匀30s;25℃16000g离心15m in,上清按Garrels[9]的方法测定蛋白质含量后,直接用于上样或-70℃贮存待用.1.4　等电聚焦1.4.1　管状I EF胶的制备　取2.06g尿素,加入0.75mL水,0.75mL体积分数为10%的Nonidet P240, 0.25mL Ampholine混合液[pH(3.5-10)∶pH(5-8)=1∶3],0.5mL丙烯酰胺凝胶单体储液(283.8g・L-1丙烯酰胺,16.2g・L-1N,N′2甲叉双丙烯酰胺);25℃水浴超声处理使之溶解后,10000g离心5s去除气泡,加入8μL体积分数为10%过硫酸铵和1.5μL TE ME D;混合后立即灌入长21c m、内径1.5mm的玻璃管中,胶长18c m;顶部用10μL水覆盖,室温下聚合1h以上.待胶充分聚合后,除去覆盖的水,用微量进样器将蛋白质溶液加到胶的顶部,上样量为120μg.先用10μL5mol・L-1尿素溶液覆盖,再加阴极电泳缓冲液至管口,随即进行电泳.1.4.2　等电聚焦电泳参数　阴极、阳极缓冲液分别为50mmol・L-1Na OH、25mmol・L-1H3P O4.28℃下,依次按300、400、500、600V各30m in,800V16h,1500V1h的电压梯度进行电泳.1.5　I EF胶的平衡电泳结束后,取出玻璃管用双蒸水漂洗后,用接上200μL微量移液器Ti p的注射器靠水压轻轻将胶条挤出,置于小平皿内,直接使用或-70℃暂存.进行第2向电泳前将胶条用平衡液[60mmol・L-1Tris2 HCl(pH6.8),20g・L-1S DS,体积分数为5%的巯基乙醇,体积分数为20%的甘油,0.5g・L-1溴酚蓝]平衡15m in,更换新鲜的平衡液再次平衡20m in,立即进行第2向聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS2P AGE).1.6　S D S2PAGE电泳凝胶规格为190mm×190mm×1.0mm,分离胶为120g・L-1聚丙烯酰胺凝胶,无浓缩胶.将平衡后的胶条平放于凝胶顶部,避免在二者间留下气泡,用40-50℃8g・L-1琼脂糖封好,于15℃,以每片胶15mA恒流电泳15m in,再以每片胶35mA恒流电泳直至溴酚蓝移至距胶底边约0.5c m处为止(约5-6h).1.7　蛋白质成像根据Shevchenko et al[10]的方法修改后进行银染.体积分数为50%的甲醇,5%乙酸溶液固定30m in; 50%甲醇溶液洗15m in;水洗3次,各10m in;0.2g・L-1硫代硫酸钠溶液浸泡2m in;水洗2次,各1m in;冰冷的1g・L-1硝酸银溶液于4℃浸泡20m in;水洗2次,各1m in;0.04%甲醛(37%溶液),20g・L-1无水NaCO3溶液显影,5%乙酸溶液停显,湿胶用透射法扫描成像.22　结果与讨论经过改变蛋白质裂解液及提取方法和第1向胶条的平衡液成分,适当提高等聚焦的最高电压并控制总伏时数等后,用I S O2DALT双向电泳方法经过质谱相容性银染后,分辨率得到明显提高,可以在单片S DS2P AGE胶上分辨出1200-1300个水稻叶片蛋白质(肽)斑点,等电点(p I)在3.5-9.3之间,相对分子质量在10-120ku之间.斑点形状规则,稳定性好且有较高的重复性,特别是阴极漂移现象得到有效控制(图1、2),基本可以满足水稻叶片蛋白组学分析及其相关分子生态学研究工作的需要.2.1　蛋白质样品制备蛋白质样品制备是双向电泳工作的基础,其质量直接影响电泳的分辨率、可靠性和重复性.对于水稻叶片组织,采用三氯乙酸与冷丙酮联用来沉淀蛋白质是个有效的方法,可以抑制蛋白酶的活性,避免蛋白881质的降解,还可除去脂类以及在植物组织中大量存在的色素、多酚等次生物质的干扰[11].但这种方法可能导致所制备的蛋白质干粉难以完全溶解.由于溶解液中高浓度的尿素在高于30℃时不稳定,分解产生的氰酸盐(cyanate )会引起氨基甲酰化,导致蛋白质荷电不均一,若提高溶解温度则影响等电聚焦的结果[12].为此,在25℃或更低温度下用水浴超声波处理来溶解样品,有效地解决了这个问题.但太低的温度(<20℃)可能引起尿素结晶析出,而影响蛋白质的溶解,因此,把第1向等电聚焦电泳的环境温度控制在28℃左右,以免蛋白质在电泳过程中沉淀.在整个操作过程中,都应尽量避免样品的过热与反复冻融.图1　改进后的水稻叶片蛋白双向电泳图谱Fig .1　Map of p r oteins fr om rice leaves by i m p r oved 22DE method 图2　改进前的水稻叶片蛋白双向电泳图谱Fig .2　Map of p r oteins fr om rice leaves by original 22DE method2.2　等电聚焦pH 梯度的稳定性在I S O 2DALT 系统中,第1向电泳是根据蛋白组分的p I 不同,在电场中会向其等电点移动的原理将蛋白质分离.因此,载体两性电解质所形成的pH 梯度的稳定性对电泳结果的稳定性和可重复性有非常重要的影响.本试验使用兼性离子去污剂CHAPS 代替裂解液中的Trit on X 2100并去除离子型去污剂S DS,在提高疏水性蛋白质溶解度的同时有效地减轻了阴极漂移现象.此外,凝胶单体储液的纯度对pH 梯度的稳定性也有很大的影响,陈旧的单体储液将导致严重的阴极漂移,因此等电聚集应使用新鲜配制的单体储液,储存时间最好不超过2周.2.3　蛋白质成像由于植物细胞内大部分蛋白质的表达丰度很低,高灵敏度的蛋白质成像技术对2D 电泳在蛋白质组学中的应用是一个重要环节.蛋白质2D 电泳的成像技术主要有考马斯亮蓝染色法、金属离子染色法和荧光染料染色法等.考马斯亮蓝与质谱分析的兼容性好,但灵敏度低,经典的考马斯亮蓝R 2250染色法的灵敏度仅为100ng 左右,即使是改进的胶体考马斯亮蓝G 2250染色法的灵敏度也只能达到10-50ng,大大制约了它在蛋白质组研究中的应用.银染法是金属离子染色法的代表,其灵敏度可以达到1ng,但银染法中常用的敏化剂中含有戊二醛,会导致蛋白质的肽链交联,将严重影响后续的质谱分析.本试验中所采用的银染方法不使用戊二醛作敏化剂,因此有较好的质谱兼容性,且灵敏度较高,是昂贵的荧光染料理想的替代方法.2.4　其它I S O 2DALT 系统涉及许多复杂的实验过程,很多因素都可能影响到最后的实验结果.为此还在实验细节上做了许多改进.第1向电泳上样时,在蛋白质样品上覆盖一层5mol ・L -1尿素溶液,以保护样品免受强碱性的阴极缓冲液影响.第2电泳之前,需对第1向胶条进行平衡,传统方法中这一时间长达30-120981第2期王经源等:I S O 2DALT 双向电泳方法的优化与改进福建农林大学学报(自然科学版)第35卷m in,在平衡过程中将导致蛋白质丢失、蛋白带变宽等[3],而不经平衡,又会导致高表达丰度蛋白纹理现象加剧,影响分辨率.因此,将平衡改为2次,在保证平衡效果的前提下缩短平衡时间.此外,必须指出的是,植物叶片组织蛋白质组分析中存在的最大问题仍然是蛋白样品的制备.大量RuBP羧化酶(Rubisco)蛋白的存在,严重制约了表达丰度低的蛋白的上样量,在双向电泳图谱上形成大的斑块,并可能导致垂直条纹,遮蔽了其它的蛋白点,从而大大地影响了低丰度蛋白的检出,还可能造成第1向胶局部pH梯度的改变,对此我们正在探索解决方法.参考文献:[1]杨何义,应万涛,钱小红.蛋白质组技术的研究进展[J].自然科学进展,2002,12(1):13-17.[2]曾建敏,林文雄,梁康迳,等.水稻对低剂量UV2B辐射胁迫的分子应答研究[J].应用生态学报,2003,14(6):941-944.[3]O′F ARRE LL P H.H igh res oluti on t w o2di m ensi onal electr ophoresis of p r oteins[J].J B i ol Che m,1975,250(10):4007-4021.[4]廖翔,应天翼,黄留玉,等.蛋白质组学研究中的双向电泳技术[J].生物技术通讯,2003,14(6):522524.[5]何瑞锋,丁毅,张剑锋,等.植物叶片双向电泳技术的改进与优化[J].遗传,2000,22(5):319-320.[6]孙国荣,彭永臻,阎秀峰,等.干旱胁迫对白桦实生幼苗叶片蛋白质的影响[J].林业科学,2003,39(4):151-154.[7]范宝莉,王振英,陈宏,等.小麦T型细胞质雄性不育系、保持系蛋白质双向电泳比较研究[J].实验生物学报,2004,37(1):45-49.[8]林文雄,金吉雄.水稻对UV2B辐射增强的抗性遗传及其生理生化特性研究[J].应用生态学报,1999,10(1):31-34.[9]G ARRE LS J I.Quantitative t w o2di m ensi onal gel electr ophoresis of p r oteins[J].M ethods Enzy mol,1983,100:411-423.[10]SHE VCHE NK O A,W I L M M,VOR M O,et al.Mass s pectr ometric sequencing of p r oteins silver2stained polyacryla m ide gels[J].Anal Che m,1996,68(5):850-858.[11]JOCE LY N K C R,S AJ I D B,JAM ES J G,et al.Tackling the p lant p r oteome:p racticeal app r oaches,hurdles and experi m en2tal t ools[J].Plant J,2004,39:715-733.[12]L I PP I N C OTT J,AP OST OL I.Carbamylati on of cysteine:a potential artifact in pep tide mapp ing of he mogl obins in the p res2ence of urea[J].Anal B i oche m,1999,267:57-64.(责任编辑:陈幼玉) 091。

双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用

双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用摘要从双向电泳的历史、原理、操作步骤及其在植物蛋白质组学研究中的应用等几方面进行综合阐述，最后提出双向电泳技术中存在的一些问题，并展望了其在植物蛋白质组学研究中的未来应用前景。

关键词蛋白质组学；双向电泳技术；植物研究表明遗传信息通过基因携带，但基因结构的相对稳定性、数量的有限性，与生命现象的多变性、复杂性存在明显的差异[1]。

为此，研究认为在所有生物体的细胞、组织、细胞器中，各种代谢反应、生理功能的维持均由各组成部分的表面、内部的蛋白质来完成。

蛋白质组是Wilkin S等在1994年第1次提出的。

1997年蛋白质组的定义被其创造者重申为：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质。

”2000年人类基因组序列草图的完成标志着“后基因组时代”的到来。

蛋白质组学（proteomics）的概念最终被定义为“一个基因组、或一个细胞、组织在特定的生理和病理条件下表达的所有蛋白质”。

蛋白质组具有特殊性和多样性，其研究的三大核心技术分别是双向电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）、生物质谱技术和生物信息学[2-3]。

其中，2-DE作为蛋白质分离的重要手段，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离上万个蛋白质的方法，且分离纯度可达90%以上。

1 双向电泳技术的历史双向电泳技术自诞生以来，一直在不断的发展、改进。

1975年O`Farrell对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究中首次采用了双向电泳技术，称为ISO-DALT（等电点-道尔顿）。

其第一向是将载体两性电解质（CA）添加到丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的pH梯度进行等电聚焦；第二向是聚焦后的凝胶在含有SDS的缓冲液中平衡后，用琼脂糖包埋到垂直板SDS 凝胶的浓缩胶上，形成不连续的SDS梯度凝胶电泳[4]。

这种双向电泳蛋白质由于上样量低，溶解性较差，可能会造成负性部分碱性蛋白丢失。

蛋白质双向电泳双胺染色方法的改进

第23卷　第1期植物研究2003年　1月Vol.23　No.1 BULL ETIN OF BO TAN ICAL RESEARCH Jan.,　2003蛋白质双向电泳双胺染色方法的改进Ξ朱宏王柏臣张帅王同昌(哈尔滨师范大学,哈尔滨150080)摘　要　讨论了蛋白质双向电泳检测的各种方法。

并对本实验室使用过的两种银染方法(非双胺银染及双胺银染)进行对比研究。

发现本实验室改进的双胺银染色方法具有以下特点:(1)背景异常清晰,蛋白质与底色反差大;(2)敏感度大大提高,检测最低蛋白质量可达fg级,对微量表达的蛋白质具有极好分离效果,能清晰地检测出低丰度表达的蛋白质。

关键词　蛋白质;双向电泳;双胺银染THE IMPROVEMENT ON DIAMINE SIL VER STAIN METH ODSOF PROTEINS TWO-DIMENSIONAL E L ECTROPH ORESISZHU Hong WAN G Bai-Chen ZHAN G Shuai WAN G Tong-Chang(Harbin Normal University,Harbin　150080)Abstract　Some detective methods of proteins through two-dimensional electrophoresis are discussed in this paper.We compare two silver stain methods(diamine and non-dianime silver stain)used in our lab before.And the diamine silver stain method improved by us has the following strengthens:(1)the background is clearer;(2)sensitivity is stronger largely,and the minimal quantity detected isup to10fg,which can separate the proteins expressed very little and detect clearly the proteins that other methods cannot detect.K ey w ords　protein;two-dimensional electrophoresis;diamine silver stain.前言蛋白质双向电泳技术是指将样品进行电泳后,针对不同的研究目的,在它的直角方向再进行一次电泳。

玉米叶片2种总蛋白质提取方法的比较

玉米叶片2种总蛋白质提取方法的比较齐建双;王彦玲;铁双贵;卢彩霞;岳润清;韩小花;燕树锋;孙若楠【摘要】为比较不同方法提取的玉米叶片蛋白质对双向电泳效果的影响。

采用TCA-丙酮沉淀和TRIzol试剂盒2种方法，提取国审玉米品种郑单958叶片全基因组蛋白质，并对提取的蛋白质样品进行双向电泳。

结果表明：TCA-丙酮方法提取的蛋白质一向水平聚焦电压上升缓慢且达不到程序设置的电压，而TRIzol试剂盒方法实时监测图与程序设置图相吻合；对电泳胶图分析后可知，TRIzol试剂盒法分离出的蛋白点多于900个，低丰度蛋白质得到充分显现，大多数蛋白点分子量为20～80 kDa，pH值为4～7，蛋白点的形状较规则；TCA-丙酮沉淀法分离出的蛋白点仅有350个，表明样品中蛋白质分离种类较少，高丰度蛋白质过度显现，低丰度蛋白质检出率大大降低。

%To compare the effect of corn leaf protein extraction by different methods with Two-dimensional elec-trophoresis.Two methods of TCA-acetone precipitation and TRIzol Kit were used to extract the leaf genome-wide protein from maize variety Zhengdan 958 ,and the effect of protein extractions were evaluated by two-dimensional e-lectrophoresis .The results showed that the focus voltage of proteins extracted by TCA-acetone method rose slowly and could not be up to the program settings , while the Real-time monitoring map of TRIzol Kit method coincided well with the program settings .After analysis of gel by ImageMaster 2D-Platinum,more than 900 protein spots were separated by Trizol Kit method ,and the low abundance proteins displayed fully .For majority of the protein spots ,the molecular weight (MW) was 20-80 kDa,the pH value was 4-7,and the shape was regular .Theprotein spots sepa-rated by TCA-acetone precipitation method were 350 only,showing the less protein types separated from a sample , while the high abundance protein over expressed and the detection rate of low abundance proteins reduced greatly .【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P162-164)【关键词】玉米叶片;蛋白质提取方法;双向电泳【作者】齐建双;王彦玲;铁双贵;卢彩霞;岳润清;韩小花;燕树锋;孙若楠【作者单位】河南省农业科学院粮食作物研究所，河南郑州 450002;河南省农业科学院粮食作物研究所，河南郑州 450002;河南省农业科学院粮食作物研究所，河南郑州 450002;河南省农业科学院粮食作物研究所，河南郑州 450002;河南省农业科学院粮食作物研究所，河南郑州 450002;河南省农业科学院粮食作物研究所，河南郑州 450002;河南省农业科学院粮食作物研究所，河南郑州 450002;河南省农业科学院粮食作物研究所，河南郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】S513.03Key words:Maize leaf;Extraction methods of protein;Two-dimensional electrophoresis玉米是我国种植面积最大的粮食作物。

长期继代下玉米愈伤组织差异蛋白的双向电泳分析

长期继代下玉米愈伤组织差异蛋白的双向电泳分析付小康;常纪苹;宋蕊芳;邢小龙;胡德升;胡彦民;钟立华【摘要】实验以玉米自交系齐319幼胚进行愈伤组织的诱导及继代培养,提取继代5次和10次的胚性愈伤组织中可溶性蛋白质进行双向电泳.运用2-D凝胶图像分析软件PDQuest进行分析,探究玉米胚性愈伤组织长期继代培养的分子调控机理.结果表明,长期继代10次相比5次共有20个有明显差异的蛋白点,其中14个表达下调,6个表达上调.通过质谱分析及搜索数据库鉴定出14-3-3-like protein GF14-12和ferritin-1,chloroplastic 2个蛋白,可能是愈伤组织长期继代后细胞生长代谢途径受到影响的结果.【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2017(030)001【总页数】4页(P11-14)【关键词】玉米;愈伤组织;继代培养;双向电泳;质谱分析【作者】付小康;常纪苹;宋蕊芳;邢小龙;胡德升;胡彦民;钟立华【作者单位】河南农业大学农学院,河南郑州450002;河南农业大学农学院,河南郑州450002;云南农业大学资源与环境学院,云南昆明650201;河南农业大学农学院,河南郑州450002;河南农业大学农学院,河南郑州450002;河南农业大学农学院,河南郑州450002;河南农业大学农学院,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S513建立良好的玉米组织培养体系对玉米转基因及细胞遗传学的研究十分重要［1－4］。

自1975年GREEN等［5］用玉米幼胚作为外植体获得再生植株以来，玉米组织培养体系得到不断完善，使得以此为基础的突变体筛选、转基因等技术得到广泛应用，同时也节省了大量供体材料和人力。

但大量研究［6－10］表明，在长期继代培养的过程中，随着胚性愈伤组织继代次数的增加生长会受到抑制，例如生长量降低、再生率差等，成为制约玉米组织培养研究的关键因素。

关于玉米愈伤组织继代培养的影响因素已有很多研究，但在蛋白质水平上还鲜有报道。

玉米蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化

玉米蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化董婧;逯晓萍;吕二锁;薛春雷;李俊伟【摘要】为了优化玉米叶片双向凝胶电泳技术条件，通过比较3种总蛋白提取方法对玉米双向电泳结果的影响，并对蛋白质上样量、IEF 等电聚焦条件及 SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等参数进行探索、优化；结果发现，与酚提取法和磷酸缓冲液法相比，采用改进的 TCA ／丙酮法提取总蛋白操作简单、方便，所得的2-DE 图谱中蛋白质点数量多、背景清晰，是一种适用于提取玉米苗期叶片总蛋白的有效方法；同时筛选出：第一向 IEF 等电聚焦样品上样量为800μg，聚焦条件为20000 V ／h，在浓度为12．5％的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，能够在17 cm 的 IPG 胶条上获得背景低、分辨率较高、重复性好的双向电泳图谱，该优化体系适用于玉米叶片蛋白质组双向电泳分离，对玉米蛋白质组学研究具有重要参考价值。

%In order to establish a set of two dimensional gel electrophoresis techniquefor maize,the effects of three kinds of total protein extraction methods on the results of two dimensional electrophoresis of maize were stud-ied.Meanwhile,the protein sample volume,condition of isoelectric focusing and the density of polyacrylamide gel were explored and optimized.The results showed that TCA-acetone for total protein extraction was simple and con-venient compared with the method of phenol extraction and phosphate Buffer (PB)solution method.The 2-D maps had abundant protein spots and more clear background,this study established a suitable proteomics methods for for-age maize.Meantime,it screened out the first dimension electrophoresis was performed on the sample 800 μg and focus conditions 20 000 V /h;The second electrophoresis was performed on 12.5%polyacrylamide gels,it could be obtained two-dimensional electrophoresis map at 17 cm of background low and higher resolution.Optimization sys-tem would be suitable for two dimensional electrophoresis of total protein of forage maize leaves,the method can be applied to corn leaf proteome analysis of sample extraction.The useful information can be provided for the pro-teomics research of maize.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2016(031)004【总页数】6页(P13-18)【关键词】玉米;叶片;蛋白质提取;双向电泳【作者】董婧;逯晓萍;吕二锁;薛春雷;李俊伟【作者单位】内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019;内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019;内蒙古农牧业科学院，内蒙古呼和浩特010031;内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019;内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019【正文语种】中文【中图分类】S513.03在生命科学中,对蛋白质组学的研究已成为功能基因组研究的重要手段与内容。

玉米籽粒蛋白质双向电泳技术体系的优化

玉米籽粒蛋白质双向电泳技术体系的优化石海波;黄灵忠;姜丽丽;王云生;冯勇;高聚林;白海;苏二虎;张来厚;赵瑞霞;刘志雄【摘要】为了获得玉米籽粒双向电泳中蛋白质提取的最佳方法，建立最佳的玉米籽粒蛋白双向电泳技术体系，对酚抽提法、三氯乙酸／丙酮沉淀法（ TCA／丙酮沉淀法）和可溶性蛋白提取法3种不同提取方法得到的蛋白质进行了分析，并在相同条件下进行双向电泳比对分析，结果表明：可溶性蛋白提取法获得的蛋白纯度高、浓度适中、双向电泳蛋白质点最丰富，最适合双向电泳研究；利用可溶性蛋白提取法获得的蛋白，对第一向等电聚焦参数等条件，以及不同pH值范围的IPG预制凝胶条进行了比较分析，结果表明：采用pH值3～10的IPG预制凝胶条时，采取电压梯度上升的方式，总聚焦70000 Vhs、上样量800μg效果最佳，采用pH值4～7的IPG预制凝胶条时，总聚焦80000 Vhs、上样量900μg效果最佳，并且采用pH值4～7的IPG预制凝胶条相比pH值3～10的凝胶条能分离到更多的点，最后结合蛋白质点MALDI-TOF-TOF质谱鉴定分析，建立了一套适用于玉米籽粒的蛋白质双向电泳技术方法，即采用可溶性蛋白提取法提取蛋白，采用24 cm、pH值4～7的IPG干胶条，上样900μg电泳效果最佳，等点聚焦程序：500 V、1 h，1000V、1 h，2000 V、1 h，4000 V、2 h，8000 V、4 h，8000 V、80000 Vhs，500 V保持。

试验研究为后续玉米籽粒发育差异蛋白研究奠定了技术基础。

%In order to obtain the best protein extraction methods of maize grain for 2-DE,and establish the best grain protein 2-DE technology system ,quality of the proteins extracted by 3 different extraction methods were ana-lyzed,and analysis of 2-DE for comparison in the same condition was done ,results showed that the protein extracted by soluble protein extraction method had high purity ,moderate concentration and the mostabundant protein spots of 2-DE,was most suitable for the study of 2-DE;in order to determine the most appropriate isoelectric focusing condi-tions,isolated distribution clearer protein spots,use the protein extracted by soluble protein extraction method,pro-tein electrophoresis sample quantity and IEF parameters were optimized ,the most suitable pH range of IPG precast gel for maize grain protein was determined ,binding protein MALDI-TOF-TOF mass spectrometry analysis,a set of protein 2-DE technique method suitable for maize grain was established,that is,protein extraction use the soluble protein extraction method,isolated distribution use the 24 cm,pH 4-7 IPG dry strip,the proper amount of sample for electrophoresis was 900 μg,IEF procedures:500 V,1 h,1 000 V,1 h,2 000 V,1 h,4 000 V,2 h,8 000 V, 4 h,8 000 V,80 000 Vhs,500 V keep.It was laid the foundation for the further study of grain development related proteins.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】6页(P171-176)【关键词】玉米;籽粒;蛋白组学;双向电泳【作者】石海波;黄灵忠;姜丽丽;王云生;冯勇;高聚林;白海;苏二虎;张来厚;赵瑞霞;刘志雄【作者单位】内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019; 内蒙古农牧业科学院玉米研究所，内蒙古呼和浩特 010031;内蒙古农牧业科学院玉米研究所，内蒙古呼和浩特 010031;内蒙古医科大学分子病理学实验室，内蒙古呼和浩特010059;内蒙古农牧业科学院玉米研究所，内蒙古呼和浩特 010031;内蒙古农牧业科学院玉米研究所，内蒙古呼和浩特 010031;内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019;内蒙古农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031;内蒙古农牧业科学院玉米研究所，内蒙古呼和浩特 010031;内蒙古农牧业科学院玉米研究所，内蒙古呼和浩特 010031;内蒙古农牧业科学院玉米研究所，内蒙古呼和浩特010031;内蒙古农牧业科学院玉米研究所，内蒙古呼和浩特 010031【正文语种】中文【中图分类】S513.03Key words:Maize;Grain;Proteomics;Two-dimensional electrophoresis蛋白质组学产生于20世纪90年代,主要对生物体全部或部分蛋白在生命活动过程中的表达、功能和作用进行研究[1]。

玉米叶片2种总蛋白质提取方法的比较

关键词：玉米叶片；蛋白质提取方法；双向电泳中图分类号：ｓ５１３．０３文献标识码：Ａ文章编号：１０００— ７０９１（２０１５）０１ —０１６２— ０３
ｄｏｌ：１０．７６６８／ｈｂｎｘｂ．２０１５．０１．０２７
ＹＵＥＲｕｎ— ｑｉｎｇ，ＨＡＮＸｉａｏ — ｈｕａ，ＹＡＮＳｈｕ— ｆｅｎｇ，ＳＵＮＲｕｏ — ｎａｎ
（ＴｈｅＣｅｒｅａｌＣｒｏｐｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅｎａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｈｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）
ａｎｄｃｏｕｌｄｎｏｔｂｅｕｐｔｏｔｈｅｐｒｏｇｒａｍｓｅｔｔｉｎｇｓ，ｗｈｉｌｅｔｈｅＲｅａｌ — ｔｉｍｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｍａｐｏｆＴＲＩｚｏｌＫｉｔｍｅｔｈｏｄｃｏｉｎｃｉｄｅｄｗｅｌｌｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｇｒａｍｓｅｔｔｉｎｇｓ．ＡｆｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｌｂｙＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２Ｄ－Ｐｌａｔｉｎｕｍ，ｍｏｒｅｔｈａｎ９００ｐｒｏｔｅｉｎｓｐｏｔｓｗｅｒｅ

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Ａｂｓｔｒａｅｔ：Ｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｄｅｖｅｌｏｐ２一ＤＥｍｅｔｈｏｄｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｍａｉｚｅｌｅａｆｐｒｏｔｅｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎ
供了技术支持。
关键词：玉米；叶片；双向电泳；优化
中图分类号：Ｓ５ｌ３
文献标志码：Ａ
论文编号：２０１２．０２９６
ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｎＴｗｏ－ＤｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＥｌｅｃｔｒ０ｐｈＯｒｅｓｉｓＭｅｔｈｏｄｏｆＭａｉｚｅＬｅａｆＰｒｏｔｅｉｎｓ
ｆｕｔｕｒｅ．ＴｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅａｄｏｐｔｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｌｅａｆｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｍａｉｚｅｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅＯｉ３１９．Ａｎｄｔｈｅ
（青岛农业大学农学与植物保护学院／青岛市主要农作物种质创新与应用重点实验室，山东青岛２６６１０９）
摘要：为了建立适合玉米叶片蛋白质组研究的双向电泳方法，以玉米自交系齐３１９为实验材料，采用３种不同的蛋白提取方法提取玉米叶片蛋白质，进行单向ＳＤＳ．ＰＡＧＥ和双向电泳，并进行硝酸银染色。结果表明，ＴＣＡ／丙酮沉淀法适合玉米叶片蛋白质的提取。建立了适合玉米叶片蛋白的双向电泳体系，即采用２４ｃｍ、ｐＨ４．７的ＩＰＧ胶条，蛋白上样量０．２５ｍｇ。ＩＥＦ程序为：１００Ｖ１ｈ，３００Ｖ１ｈ，５００Ｖ
ＰｅｉＹｕｈｅ，ＢａｉＪｉａｎｆｅｎ，ＧｕｏＸｉｎｍｅｉ，ＳｏｎｇＸｉｙｕｎ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙａｎｄＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＱｉｎｇｄａｏＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／
ＱｉｎｇｄａｏＫｅｙＬａｂｏｆＧｅｒｍｐｌａｓｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭａｊｏｒＣｒｏｐｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ２６６１０９，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
ｐｒｅｐａｒｅｄｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎｄｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｓｉｌｖｅｒ
１ｈ，１０００Ｖ２ｈ，８０００Ｖ３ｈ，８０００Ｖ１０ｈ。ＳＤＳ．ＰＡＧＥ的电泳条件为１ｗ／胶条１ｈ，３ｗ／胶条，直到溴酚
蓝到达玻璃底部为止。本研究为下一步在蛋白质组水平上分析干旱胁迫下玉米叶片蛋白质的变化提
患孝学报２０１３，３（０１）：１ — ５
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
、『Ｉ，、＾，、 Ⅳ・ｃａａｌ・ｏｒｇ
警学报
玉米叶片蛋白质双向电泳方法的优化
裴玉贺，白建芬，郭新梅，宋希云
ｎｉｔｒａｔｅｓｔａｉｎｉｎｇ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴＣＡ／ａｃｅｔｏｎｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｍａｉｚｅｌｅａｆｐｒｏｔｅｉｎ．ＩＥＦｍｅｔｈｏｄｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｏｎ２４ｃｍＩＰＧｓｔｒｉｐｓａｔｐＨ４－７ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓａｍｐｌｅｗｅｉｇｈｔ０．２５ｍｍｗｅｒｅ１００Ｖｌｈ，３００Ｖｌｈ，５００Ｖ１ｈ，１０００Ｖ２ｈ，８０００Ｖ３ｈ，８０００Ｖ１０ｈ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆ