多系统萎缩患者TCRα链CDR3谱系的荧光定量PCR溶解解读

多系统萎缩患者TCR a链CDR3谱系的荧光定量PCR溶解作者：田丹，孙永萍,汤贤英,马锐作者单位：1.遵义医学院免疫学教研室，贵州遵义563003【摘要】目的：利用荧光定量PCR溶解曲线分析技术检测1例多系统萎缩患者TCR a链CDR3谱系。

方法：提取1例多系统萎缩患者和1例正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell , PBMC中的总RNA 逆转录成cDNA以32个人TCR a链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物，共同的TCR a链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物，荧光定量PCR(FQ PCR扩增32个TRAVS因各家族CDR3谱系，溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单、寡、多克隆增生，挑选单克隆进行PCRT增，扩增产物行普通琼脂糖凝胶回收后测序分析。

结果：多系统萎缩患者和正常人PBMC勺32个TCR a链TRAV家族CDR3谱型的FQ PCR产物的各家族相对定量表达不一；正常人的32个TCR a链TRAV家族CDR3谱型的溶解曲线图表现为多个峰型的高斯分布，多系统萎缩患者的TRAV10 TRAV15 TRAV29家族CDR3谱型的溶解曲线表现为单峰的克隆性增生，其他家族为多峰、寡峰的多克隆及寡克隆增生，未出现缺失的家族，对单峰的TRAV15家族的测序得到的CDR3区的氨基酸组成为：SAIYFCAEDRDSTLTF结论：该多系统萎缩患者的PMBC中，存在TCR a链CDR3谱系漂移。

【关键词】多系统萎缩，互补决定区，荧光定量PCR溶解曲线[Abstract] Objective: To an alyze CDR3 spectratype of TCR alpha gene in peripheral blood mono uclear cells (PBMC) of one patie nt with multiple system atrophy (MSA) byusing DNA melt ing curve tech nique with real time fluoresce nee qua ntitative polymerase cha inreactio n.Methods: Total RNA from PBMC of a healthy donor and a MSA patie nt were tran scripted reversely into cDNA respectively.The forward primers were desig ned accord ingto the 32 huma n TRAV gene families, and the reverse primers desig ned accord ing to TRAC. FQ PCR was carried out to amplify CDR3 spectratyp ing of the 32 huma n TRAV gene families (HTGF), and the monoclon al/oligocl on al/polycl onal CDR3 were an alyzed with DNA melt ing curves. Monoclonal T cells of TRAV families were amplified and seque need. Results: The FQ PCRproducts of HTGF of the MSA patie nt were differe nt from those of no rmal people. The 32 HTGF melt ing curves of no rmal people showed Gaussia n distributi on with several peaks, while those of the MSA patie nt showed mono peak cloning in crease in TRAV10, TRAV15, and TRAV29 gene families, and multipeak/oligpeak multclo ne/oligelo nein crease in other gene families. No deleti on family was found. The CDR3 ami no acid seque nee of TRAV15 which showed mon opeak was in ferred as SAIYFCAEDRDSTLTFG accordi ng to the DNA seque nee obtai ned.Con clusi on: There might be spectratyp ing drift in CDR3 on TCR alpha chai n in PBMC of MSA patie nt.［Key words］ multiple system atrophy;compleme ntarity determ ining regi ons; realtime fluoresce nee qua ntitative reverse tran scripti onpolymerase cha in react ion; melt ing curve多系统萎缩(multiple system atrophy , MSA是一组原因未明成年起病的神经系统多个部位相继进行性萎缩的疾病或综合征。

由于该病患病率较低，症状与帕金森综合征、震颤麻痹症等神经病症相似，早期明确诊断比较困难，目前也尚无特异性的治疗方法，临床以对症治疗为主，患者预后较差［1，2］。

目前，多系统萎缩的相关研究主要集中在分子生物学及蛋白质病理学领域，而在免疫学方面少见研究报道［3］。

近年来，TCR CDR谱型的免疫指纹技术在病毒感染、肿瘤、自身免疫病的研究中得到了较为广泛的应用，但受到较多关注的是T细胞TCR B链CDR3谱系的研究，而TCR a链谱系研究报道较少［4］。

前期研究中已建立起检测TCR a、B链CDR3谱系漂移的“免疫扫描谱型分析技术”和“荧光定量溶解曲线分析技术”，并对1例MSA患者外周血TCR B链CDR3I系进行了初步的探讨［5〜8］。

现拟通过对该例患者TCR a链32个家族的CDR3谱系进行分析，初步探讨TCR a链CDR3I系的变化及这种变化在MSA疾病过程中的可能意义，为进一步增加病例样本的研究提供基础。

1材料和方法1.1研究样本及细胞株1例多系统萎缩患者，按多系统萎缩临床诊断标准确诊［8］。

患者外周血，来源于遵义医学院第一附属医院；对照样本为正常志愿者外周血。

对照子宫颈癌细胞株(JEC)，由遵义医学院微生物学教研室提供。

1.2试剂总RNA提取试剂盒(TIANGEN、cDNA合成kit(MBI,Fermentas) ，Realtime PCR MasterMix(TOYOBO 等。

1.3引物设计与合成参照文献［5〜7］，合成人TCR AV32基因家族上游引物34条(TRAV1和TRAV4分别有2个亚家族)，共同的TCR AC下游引物1条，对照的GAPD上、下游引物，由invitrogen 上海英骏生物技术有限公司合成。

1.4 总RNA提取和cDNA合成分别采集多系统萎缩患者和正常人外周血 5 ml,按密度梯度离心法分离PBMC,按总RNA 提取试剂盒操作，提取JEC细胞、1例多系统萎缩患者和1例正常人外周血单个核纟田胞(peripheral blood mononuclear cell ，PBMC)(2< 106细胞)中的总RNA按cDNA kit条件，用Oligo dT引物逆转录制备cDNA1.5TRAV家族CDR：区段cDNA的FQ PCF扩增反应体系：每例样本做36个PCF反应管，第1〜34管分别加入TRAV1至TRAV321游弓I物1卩1(各引物浓度均为10 mmol/L,TRAV1和TRAV4分别为2 个亚家族)，1〜34管每管加入TRACT游引物1卩l，第35管加GAPD上、下游引物，第36管为无引物的阴性对照管；每个PCR反应管分别加样品1卩l、荧光定量Mix 10卩l、纯水7卩l，总体积20卩l;标准曲线选取JEC细胞株的GAPD表达量为相对量标准进行PCR反应条件：(1)94 C 3 min，1 cycles; 94 C 30 sec，55 C 30 sec，72 C 50 sec，45 cycles;72 C 10 min， 1 cycles;(2) 溶解曲线分析：75〜95 C以0.2 C /s读取荧光值，100 cycles;(3)溶解曲线分析后的PCRT物按上述反应条件(1)的步骤将45 cycles 改成5 cycles进行PCR取8卩l PCR 产物在1.5%琼脂糖凝胶内进行电泳，余-20 C保存备用。

1.6PCR产物序列分析反应体系：TRAV15勺FQ PCR^物2卩l，加入TRAV15±游引物2卩l(引物浓度均为10 mmol/L)，加入TRACT游引物2卩l，Taq DNA Polymerase 0.25 卩l，2 mmol/L dNTP 5 卩l，10 倍Buffer with KCL ，MgCl2 5 卩l，25 mmol/L MgCl2 3 卩l，DDW 30.75 卩l，总体积50 卩l。

反应条件：95 C 2 min，1 cycles;95 C 30 sec，60 C 1 min，72 C1 min，35 c ycles;72 C 10 min ， 1 cycles。

2结果2.1正常人PBMC勺32个TCR a链TRAV家族CDR3谱型的FQ PCR产物溶解曲线峰图均为多克隆的高斯分布(图1)。

患者PBM啲32个TCR a链TRAV 家族CDR3谱型的FQ PCR产物的各家族溶解曲线峰图中的TRAV10 TRAV15 TRAV29家族表现为单克隆增生峰图，其他家族为多克隆和寡克隆增生峰图，未出现缺失的家族(图2)。

2.2对患者所出现的TRAV 15寡克隆性的PCR产物进行测序，CDR3区的基因序列：TCA GCT ATC TAC TTC TGT GCA GAG GAT AGA GAC AGC ACC CTC ACC TTT GGG ACA GGG GAC TAT(3);翻译后相应的CDR区氨基酸序列：SAIYFCAEDRDSTLT表8(1)。

3讨论MSA1 1969年首次命名以来，至今病因不明，目前涉及的有脂质过氧化损伤、酶代谢异常、慢性病毒感染、神经元凋亡、少突胶质细胞胞质内包注：呈现单峰的家族为：TRAV10 TRAV15 TRAV29;对照涵体等导致的进行性神经系统多系统变性［1〜3］。