江大色谱思考题

原理:离子型化合物在反相色谱柱上不保留,改变流动相的 pH 值，抑制样品离子的电离,使其成为 电中性分子. 2.请设计出测定某一多糖样品的分子量分布或单糖组成的色谱分析方法（包括样品处理方法和色 谱条件） 。 高效液相色谱法测定果汁的糖类组分含量 1） 、标准溶液系列配制 分别准确称取各种糖标准品 100mg 左右于 10ml 容量瓶中，用超纯水溶解定容摇匀后，即得 10mg/ｍＬ左右的标准溶液， 再以此逐级稀释成 8mg/mＬ, 6mg/mＬ, 4mg/mＬ, 2mg/mＬ, 的标准溶液系列，均经 0.45μm 微孔膜过滤，滤液供进样用。 2） 、样品处理 准确量取 3ml 果汁至 10ml 容量瓶中用无水乙醇定容至刻度， 离心后取上清液在热水浴条件下 用氮气将乙醇吹去，再用水定容，并用 0.45um 有机相微孔膜过滤，滤液颜色若较深，再用 Sep-Pak C18 固相萃取小柱处理去除色素等杂质，处理后的样液上机测定。 3） 、上机测定 色谱柱： 流动相： 检测器灵酸敏度： 柱温： 流速： Sugarpak1,6.5mmid×300mm 纯水 4 85℃ 0.4ml/min 10μL 1mg/mＬ
十八烷基键合硅胶，又称 C18. 典型的反相色谱柱，表面键和的基团为非极性羟基，适于分离弱极 性，中等极性，较强极性及可电离的酸碱性有机物。 1. 一个组分的色谱峰，其峰位置（即保留值）可用于 定性分析，峰高或峰面积可用于 定量分析， 峰宽可用于衡量 柱效能。 2. 根据 Van Deemter 方程，推导出以 A、B 和 C 常数表示的最佳流速是 B/C 的平方根。 3. 各个色谱峰的保留值，反映了各组分在两相间的 分配情况，它由色谱过程中的热力学因素所控 制，各个色谱峰的半峰宽反映了各组分在色谱柱中的 学 因素所控制。 4. 有效理论塔板数与理论塔板数之间的区别在于前者扣除了色谱柱中死时间的影响。 5. 涡流扩散项与填料粒度 及 填充均匀性 有关。 6. 气相色谱中的柱温是一个重要的操作变数，它直接影响分离效能 和分析速度。 7. 只有当柱前压与出口压力的比值（ Pi Po ）接近 1.5 时，流速分布才比较均匀，柱效也最高。 8. 在有关反相柱性能的资料中，常常看到“封端”或“封尾”一词，其含义是将残余硅羟基进行 硅烷化反应,以消除其对碱性物质的吸附作用 ,防止峰拖尾。 9. HPLC 的键合相有许多种，试写出其中四种： （1） 胺基 （2） 氰基 （3） 二醇基 (4) ODS(C18 柱) . :常 扩散 情况，它由色谱过程中的 动力
正相色谱、体积排阻色谱色谱柱主要有氨基柱和阳离子交换柱，流动相分别为乙腈/水和 3、高效液相色谱检测糖常使用 示差折光 检测器和
蒸发光散射
4、HPLC 分析肽分子量分布可使用的色谱柱为： 硅胶基质凝胶柱,如 TSKgel G2000SWXL ， 流动相为：乙腈（或异丙醇及甲醇）/水/三氟乙酸（乙腈为 10～45％，三氟乙酸一般为 0.1％） ， 检测波长为 220nm 。 1.在进行 HPLC 分析时，为防止分析柱污染，一般应采取哪些措施？ 1） ．加一个保护柱（预柱） ，其固定相性质应与分离柱一样或相近。 2） ．样品要尽量净化，如沉淀蛋白，去除色素和无机盐等。 3). 样品分析结束后,应及时用适当溶剂清洗色谱柱 . 2.乙醇的沸点为 78.3℃，丁酮的沸点为 79.6℃，在气相色谱柱上是否一定是乙醇先出峰，丁酮后 出峰，为什么？ 不一定.因为保留值除与样品组分的沸点有关外，还与样品及固定相的极性有关。乙醇（ bp 78 ℃）和丁酮（bp 80℃）二个组分在非极性柱上，因为组分出峰的顺序由蒸汽压决定，沸点高的保 留时间长，所以乙醇先出峰，丁酮后出峰；在极性柱上，沸点和分之间作用力同时作用，在强极 性柱上分子间的作用力其主要作用，按极性大小出峰，乙醇的极性比丁酮大，所以丁酮先出峰， 乙醇后出峰。 3.何谓反相离子对色谱？影响其保留值的因素主要有哪些？离子对试剂的链长和有机溶剂的比例 如何影响保留值？ 反相离子对色谱:在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂,与样品中可电离的组份形成“对 离子”(或叫“离子对”),在反相色谱柱上分离离子型化合物. 影响因素：1).介质：反相过程常用的的介质上以水为主体的缓冲溶液，其中 pH 值影响最大，PH 则更加阴离子的保留增加，阳离子则相反。另外，缓冲液中离子类型和浓度也是重要选择性参数。 2).对离子浓度：增加反离子的浓度可增加保留，但这种关系并非是线性的 3).有机改性剂：以水为主体的流动相中通常增加极性有机溶剂，如甲醇，乙 月青等做改进 剂，有机溶剂的加入改善了缔和分子在两相中的分配
注：N=5.54(
tR w h/2
)2=16(
tR w
)2
式中 Wh/2 和 W 分别为半高峰宽和峰底宽。 根据色谱柱长 L 和理论塔板数 N，可求出每个塔板高度 H： H=L/N 为了清除色谱柱中死体积对柱效的影响，人们常用有效理论塔板数 (Neff)表征色谱柱的实际柱 效： Neff=16(
t ′R2 V′ K k′ α= = R2 = 2 = 2 ′ ′ t ′R1 VR1 K1 k1
3. extra-column effect 柱外效应：即除柱内多种因素产生的色谱峰扩张外，其它产生峰扩张的因素之和：进样系统， 系统连接管，检测器及其它柱外因素引起的峰扩张。 4. gradient elution 在 HPLC 分析中，控制流动相组成或洗脱强度随时间的改变而改变，以使极性差异较大的多 个组分均能分离,同时谱峰间隔较均匀，分析时间尽量短 .此洗脱方式即梯度洗脱. 5. HPSEC 高效体积排阻色谱法,即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离 的液相色谱方法。 6. ODS
10.液相色谱 -质谱联用的离子源 (或离子化方式 )主要有大气压电喷雾电离和大气压化学电离 用的质量分析器有（1）四级杆 （2）离子阱 （3） 飞行时间质谱分析仪.
进样体积：
1、色谱法分离原理是基于不同组分在固定相和流动相之间 分配系数 不同。气相色谱主要用于分析沸点较 的物质。 2、高效液相色谱的分离模式主要有： 色谱 ；分析单糖或低聚糖主要采用 正相 ， 反相 ， 离子交换色谱 ， 凝胶过滤 低 的物质，而高效液相色谱主要用于分析沸点较 高
容量因子（capacity factor）,也称分配容量（partition capcity）或容量比（capcity ratio） ，用 k′ 表示。 其定义为：在平衡状态下，溶质在固定相和流动相中分配量（质量或摩尔数）之比 . 2. relative retention
相对保留值（relative retention）也称分离因子（separation factor） （α）它是一定色谱条件下一种物 质与另一种物质的调整保留时间或调整保留体积之比。即
5、请简述检测果酒或黄酒中的中性酚和酸性酚的样品处理方法和色谱条件 (选用什么色谱柱和流 动相及检测器?检测波长大致多少 nm)。 称取一定量的酚类物质，溶于少量水，在棕色容量瓶中定容至 10 mL，浓度分别为：儿茶素 52.0 mg/L，绿原酸 40.0 mg/L，咖啡酸 44.0 mg/L，表儿茶素 44.0 mg/L，香豆酸 60.0 mg/L，阿 魏酸 44.0 mg/L，摇匀，放入冰箱 4°C 避光储存备用。配制标准溶液时，采用逐级稀释法配成一 系列浓度的混合标准溶液。 检测器。 取 25 mL 原料用 1 mol/L NaOH 溶液调 pH 值至 7.0，加入 25 mL 乙酸乙酯，用混合摇床震荡 10 min，然后转移到分液漏斗中分离，水相再用 25 mL 乙酸乙酯萃取 1 次，合并酯相为中性酚。 水相再用 6 mol/L 的 HCl 溶液调 pH 值至 2.0，再分别用 25 mL 乙酸乙酯萃取 2 次，合并酯相为酸 性酚。 将中性酚和酸性酚合并后浓缩至干， 残渣溶于水中， 并在棕色容量瓶中定容至 25 mL， 用 0.22 μm 滤膜过滤，滤液于冰箱 4℃储存待测。 色谱柱：Eclipse XDB C１8 (150 mm×4.6 mm i．d． ， 5 μm)，流动相：A 为甲醇；B 为 1 ％乙酸水溶液 (V/V)；梯度洗脱程序：溶剂 A 在 40 min 内由 5％上升到 30％，然后变为 100％， 并维持 5 min，最后再返回到初始状态。柱温：30℃；流速：1.0 mL/min 光电二极管阵列检测器； 检测波长：280 nm；进样量：20 μL。 6、在 HPLC 分析中常用的定量方法有外标法、内标法，归一化法，标准加入法。归一化方法使用 的前提条件是什么? 归一化方法使用的前提条件：样品中所有成分都要能从色谱柱上洗脱下来，并能被检测器检 测，检测响应因子要相等或相近。 7.分析多糖或多肽的分子量分布应采用何种色谱分离模式 ?请简述该色谱模式的基本原理. 高效凝胶过滤色谱（HPGFC）分析，高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）的特点是：多糖按分子量 大小洗脱，凝胶色谱柱的选择主要取决于被分离样品的性质和糖组分分子量大小，以凝胶过滤色 谱分析多糖的流动相一般为盐溶液。 高效体积排阻色谱法（HPSEC）: 基本原理：按分子体积大小洗脱，用多个不同分子量的标准品作分子校正曲线(分子量对数对 保留时间或保留体积作图，一般为线性)，其分子量测定结果是一相对值，不是绝对分子量。 8.对于 HPLC,影响分离度的 k′、α、N 三要素分别与哪些色谱条件有关?
N⎞ ⎛ k ' ⎞⎛ α − 1 ⎞⎛ ⎟ R=⎜ ⎟⎜ ⎟⎜ ⎜ ⎟ k ' + 1 α 4 ⎝ ⎠⎝ ⎠⎝ ⎠
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k´ 与流动相组成(主要是溶剂比例、pH 等)、固定相的性质和用量及柱温有关。
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α由流动相组成(特别是有机溶剂种类和 pH 值等)、固定相的性质及柱温等因素决定。
N（或 H）由板高方程各项参数决定，一般随色谱柱长、填料粒径、填充均匀度、流速 和温度等操作条件的变化而变。
9．请简述气相色谱气路系统中的“隔膜吹扫气”和“尾吹气”的作用。 答：隔膜吹扫气是通过进样器隔垫下面将隔垫(即密封垫)因高温产生的挥发物带去机外所用 的气体,可以防止对分析结果的影响，可以减少峰的拖尾，但流量太大时，峰面积会变小。 尾吹气是从色谱柱出口直接进入检测器的一路气体，又叫补充气或辅助气。其作用是减少 FID 入口至检测器的死体积，缩短气体的停留时间，从而消除检测器的死体积的柱外效应。 计算题 : 若在一气相色谱图上,测得保留时间 tR=5.37cm,死时间 tm=0.52cm,峰底宽 w=1.32cm,假 定柱长为 1m,计算: (1) (2) (3) 理论塔板数和有效理论塔板数. 塔板高度及有效塔板高度 分配比 （ （1）265，216（2）3.77mm,4.63mm（3）9.3 ）