降落PCR
RACE的简介.
通过PCR的方法获得全长cDNA：
利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂 盒适合回收2.5kb以下的RACE产物； 对于长的片段，可以通过电洗脱获得好 的结果。如果你选择使用其他的纯化方 法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。 将全长的cDNA克隆到T/A型的 PCR克 隆载体中。
对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至 少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大 可能性的序列。（反转录并不总是进行到 mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。 另外，T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0 －20个碱基。） 一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获 得多的序列信息。理想的是，可以对整个 开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻 译区。
通过PCR的方法获得全长cDNA：
在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。 通常情况下，可以见到一条单一带，如果 这样，利用胶来纯化全长的cDNA。 制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。 不使用TBE buffer，TBE的胶很难制备全 长的cDNA。 将剩下的45μl反应物点样，选用适当的 marker。 利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切 下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫 外对cDNA的照射。
谢谢大家！
如果要用重叠片段来检测设计的引物， GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。 只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计 的引物是否正确。 降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物 的特异性。在最开始的循环中，退火温度 高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性 条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降 回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循 环。
简述PCR原理及过程的步骤
简述PCR原理及过程的步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA（脱氧核糖核酸）序列的重要技术。
它在生物医学研究、基因工程以及医学诊断中得到广泛应用。
本文将简要介绍PCR的原理和步骤。
1. PCR原理PCR原理基于DNA的复制机制，在体外繁殖大量DNA分子。
PCR通过将DNA反复加热（解链）、退火（引物结合）和延伸（DNA合成）的循环反应，使得DNA序列倍增。
这一过程包括以下几个主要步骤。
2. PCR步骤2.1 解链（Denaturation）PCR反应开始时，将待扩增的DNA样本加热至高温（通常为94-98摄氏度）。
高温能够打破DNA双螺旋结构，使双链DNA分离成两个单链。
2.2 引物结合（Annealing）在下一个步骤中，PCR反应体系被冷却至较低的温度（通常为50-65摄氏度）。
在这个温度下，由于引物（寡核苷酸片段）的存在，引物会与待扩增DNA的互补序列结合。
2.3 DNA合成（Extension）引物结合后，温度会被升高至大约72摄氏度。
这个温度下，Taq DNA聚合酶（一种特殊的DNA合成酶）会开始合成新的DNA链。
Taq DNA聚合酶能够使用已结合的引物作为起始点，向前方向合成新的DNA分子。
2.4 重复循环一次PCR循环包括了上述三个步骤，通常需要进行20-35次循环，以保证足够的DNA序列倍增。
在每次循环后，DNA的数量会成指数级增加。
3. PCR的应用领域PCR技术在许多领域得到广泛应用，包括：•分子生物学研究：PCR可以扩增特定的DNA序列，用于基因测序、基因突变检测等研究。
•法医学：PCR可用于DNA鉴定，如刑事案件的嫌疑人辨识等。
•医学诊断：PCR可用于检测病原体的DNA，如病毒、细菌等，用于感染病原体的快速诊断。
•遗传学：PCR可用于基因检测、遗传疾病筛查、基因多态性分析等。
总结PCR技术的发展和应用使得科学家们可以在短时间内扩增大量目标DNA序列。
PCR 在许多生物医学研究领域具有重要作用，其简单、高效、可靠的特点使其成为现代生命科学研究中不可或缺的工具。
pcr中GC含量过高的问题
PCR中GC含量过高的问题DNA molecule: 4849Length = 1212 base pairsMolecular Weight = 370809.00 Daltons, single strandedMolecular Weight = 741128.00 Daltons, double strandedG+C content = 70.96%A+T content = 29.04%Nucleotide Number Mol%A 173 14.27C 438 36.14G 422 34.82T 179 14.77解决：1.由于基因中GC含量过高，就不应该用普通的buffer了，而应该用特殊的---GC buffer ，对于TM值可以做一下梯度PCR，GC buffer 可以在一些公司都能买到。
买TAKALA的GC buffer for PCR. 还有，设计一段合适的引物确定你模板中确实有你的目的片段也是很有必要的。
2.只是为了PCR获得基因的话，你可以尝试用68度/94度这种两步PCR法，3. gc含量是有些高，建议你换一种保真性比较高的酶（建议还是不要用japan 公司的），现在有好多高保真的酶（sigma 的jumpstart taq et al）都可以扩增高gc的模板；另外，DMSO也是一种办法，但是，这种办法需要你凭经验确定加入的量，一般来说5%已经足够了，最好不要超过10%，因为过高的DMSO反而会一直taq酶对pcr的特异性扩增。
4. 用Takara的long-Taq with GC buffer 效果很好。
我做的是链霉菌，所以GC含量也在70多。
我P的效果很好当然现在也有专门这种PCR Buffer卖.6.如果实在不行，就用advantage 2 high GC taq polymeras.（clontech), 效果好，就是贵了点。
可以用双温法试试，比如35个循环，总变性之后，前五个循环双温即没有延伸，后三十个循环三温，具体温度根据引物Tm值定。
pcr原理,反应体系和基本过程
PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学和遗传学研究的技术，用于扩增DNA 序列。
PCR基于DNA的复制原理，在体外模拟DNA的自然复制过程，通过酶和适当的反应体系，使特定DNA序列在反应中进行指数级扩增。
以下是PCR的基本原理、反应体系和过程：原理：PCR反应基于DNA的双链结构。
通过加热将DNA双链分离为两条单链，然后通过引物（primer）与目标DNA序列的特定区域结合，然后在适当的温度下，DNA聚合酶（DNA polymerase）催化合成新的DNA链，形成两条新的双链DNA。
这个过程包括三个基本步骤：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）。
反应体系：PCR反应通常包含以下组分：模板DNA：要扩增的DNA样本。
引物（primer）：短的DNA序列，与目标DNA序列的两端相互补，作为起始合成新DNA链的起点。
DNA聚合酶：如Taq聚合酶，用于合成新的DNA链。
dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）：包括A、T、C和G四种碱基的单元，供DNA聚合酶使用。
缓冲液：维持反应体系的pH和离子浓度，提供适宜的环境供DNA聚合酶催化反应。
基本过程：PCR反应通常涉及以下的循环步骤，每个循环依次进行变性、退火和延伸：变性（Denaturation）：将PCR反应管中的混合物加热至94-98摄氏度，使DNA双链解离为两条单链。
退火（Annealing）：将反应温度降低至45-68摄氏度，使引物与目标DNA序列的特定区域结合。
延伸（Extension）：将温度提高至72摄氏度，DNA聚合酶催化新的DNA链的合成。
DNA 聚合酶使用dNTPs作为碱基单元，延伸引物，合成新的DNA链。
这个循环步骤会重复多次（通常为20-40次），每次循环都会使目标DNA序列扩增约一倍，最终产生大量目标序列的DNA。
通过PCR，可以在短时间内从少量的起始DNA模板扩增出大量的目标DNA序列，为分子生物学、基因组学研究以及遗传疾病诊断等提供了强大的工具。
降落PCR
鉴于大家一般用的都是Biometra PCR，我就把Biometra PCR仪的touchdown程序设置写到这里，供大家参考使用。
(我以退火温度从65度降到55度为例，每个循环降0.5度，共需20个循环，然后再继续55度退火的5个循环，战友们根据自己情况再调整）
（1）首先是开机打开主页面-----按C键（programme）进入到---列表页面-----通过方向键选择一个subdirect-----按enter进入-----输入你的programme no 和name----再enter----设置lid temp:99度和preheating: on----继续按enter进入---输入
1：94度5min
2：94度1min
3：65度1min（然后连按向右的方向键3下，进入到另一个界面，在
标闪烁处（也就是3的后面）输入-0.5（其上方为dt），
其他的不管，然后，再连续按enter键回到编程的主页
面，此时（65 度1min 后面会显示一个加号）
4：72度1min 2 19（Biometra PCR 本身加一个反应即20个循环）
5：94度1min
6：55度1min
7：72度1min 5 4（Biometra PCR 本身加一个反应即5个循环）
8：72度10min
9 ：4度10h。
干货分享PCR知识分享
干货分享PCR知识分享01PCR 的基本原理PCR是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。
在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。
PCR包含下列三步反应：1、变性(denaturation)将反应体系混合物经加热至94℃左右，维持较短的时间，使双链DNA变成单链DNA，便于下一步引物的结合。
2、退火(annealing)将反应体系温度下降到特定温度（一般是引物的Tm值以下)，引物与DNA模板以碱基互补的方式结合，形成模板-引物杂交双链。
退火温度是保证引物与DNA模板互补结合的关键。
由于引物结构简单，加之引物量远远大于模板DNA的数量，所以DNA模板单链之间的互补结合很少。
3、延伸(elongation)将反应体系的温度上升到72℃左右并维持一段时间，在Taq DNA 聚合酶的作用下，以引物为起始点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，从5'→3'方向延伸反应，合成新的DNA双链。
以上三步反应为一个循环，重复进行变性、退火、延伸这三步反应，如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。
上述过程1.5小时左右完成，从而使所需的目的DNA片段扩增放大百万倍。
02PCR反应液成分PCR反应体系主要包含以下五种成分1、模板（template)模板即扩增用的DNA，可以是任何来源DNA(如基因组DNA、质粒DNA等)或RNA（如总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA 等），但必须符合两个条件：一是纯度必须较高，二是浓度不能太高以免抑制。
50μl PCR反应体系中模板DNA推荐使用量如下表所示2、引物（primers)人工合成的一对引物可以分别与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序列，其中一条称为上游引物，另一条称为下游引物。
PCR介绍
dNTPs:
0.6μl×6 = 3.6μl
引物 P：
2.4μl ×6 = 14.4μl
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl
水：
21μl × 6 = 126μl
共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时
混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。 3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混
加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子 也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调 整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可 使各种复杂的DNA分子完全变性。
温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活 性和dNTP分子造成损害。
⑵ 复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。
总原则是提高扩增的效率和特异性
引物设计原则
⑴ 长度15～30 b，过短特异性降低，过长则成本增加， 产量也下降。
⑵ 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆 积现象，引物 G+C 含量宜在45 ～ 55%左右。
⑶ 引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹 样二级结构，两个引物之间尤其在 3’ 末端不应有互 补链存在，不然会形成引物二聚体。
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
质粒DNA的提取和PCR技术
试剂准备 ：
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性 高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS
溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2 与 NaOH作用,减弱了条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的 带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
反应参数要素： 反应参数要素
1。PCR反应五要素
（1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特 异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。保真性： rTaq-1~2kbp,LaTaq-~20kbp,Pfu（Pyrobest）-. 吸取时注意，保存在甘油中故比较粘稠。 （2）dNTP的质量与浓度 ：在PCR反应中，一般反应 中每种dNTP的终浓度为20-200µmol/L 。4种dNTP的 浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同 于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 （3）模板；模板可以是DNA片断，基因组，质粒， 噬菌体，菌液等任何含DNA生物样品。可以是单链分 子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状 分子 一般反应中的模板数量为102 -105 拷贝。模板纯 化程度影响扩增效率。
注意问题：
1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高
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降落PCR
降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。
在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。
退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。
这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。
降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。
其原理大致是这样的。
首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。
随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。
但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。
这一PCR技术已经大量地进入医疗临床应用。
现在，以高通量PCR为基础的检测方法、如人的HLA分型大多采用这一技术。
设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。
由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。
尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。
注意事项
由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。
设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，
从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。
例：一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。
则：从65℃—>50℃（每2cycles降退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。
实验中如持续出现假象带（杂带），则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。