uPA基因重组GFP-腺相关病毒载体质粒的构建及其表达
重组腺病毒载体的构建【精品推荐】
腺病毒载体的特点
n 主要以Ad5型病毒为框架构建 n 具有携带外源基因和转移外源基因的双
重功能 n 可插入长达5kb的外源基因 n 通过受体介导的细胞内吞作用进行基因
转移 n 安全性，复制缺陷（E1区缺陷）
腺病毒载体的特点
n 保留了E3区的腺病毒－－可逃逸宿主免 疫应答，可用于体内基因治疗
重组腺病毒的鉴定
n 病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
n 取上清提取重组病毒DNA n 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
n 24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 n 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 n 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
病毒滴度测定
n 观察细胞病变情况，取100%出现CPE的 稀释度计算病毒滴度： 105细胞×稀释度×10个病毒/细胞 pfu/ml=
重组病毒的扩增
n 293细胞大规模培养：悬浮培养，单层培 养
n 用收集的病变细胞培养上清或冻融上清 感染293细胞
n 反复培养、感染 收集大量的病变细胞 及病毒上清
n 不整合到宿主基因组 n 增殖和非增殖细胞均可感染
构建腺病毒载体的要素
n 腺病毒基因组质粒 n 穿梭质粒 n 目的基因片段 n 包装细胞
AdMax™ system
穿梭质粒
pDC315
腺病毒载体的包装胞细
n HEK293细胞－－E1区缺陷互补的细胞系 悬浮HEK293细胞，易大规模培养，可用 于腺病毒大规模制备。但不易长期保持 稳定。 单层培养HEK293细胞，稳定，用于 重组腺病毒载体构建、蚀斑挑选。也可 用于腺病毒扩增。
GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH 3T3细胞中的表达
第26卷第4期2005年8月西安交通大学学报(医学版)J o u r n a l o fX i'a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l.26N o.4A u g.2005G F P重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在N I H3T3细胞中的表达邢俊平1,2,杨宇3,王全颖4,杨广笑4,邱曙东2(1.西安交通大学第一医院泌尿外科;2.西安交通大学生殖医学研究中心,陕西西安710061;3.吉林大学第一医院神经内科,吉林长春130021;4.西安华广生物工程公司分子生物学实验室,陕西西安710025)摘要:目的构建以绿色荧光蛋白(G F P)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。
方法采用D N A重组技术将G F P基因片段亚克隆到p s s H G C MV载体的E c o RⅠ和B a m HⅠ位点,构建表达G F P重组腺相关病毒载体p s s H G C MV-G F P。
以此载体转染143细胞进行G F P重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。
用地高辛标记的C MV p o l y A片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。
采用氯化钙法体外转染培养的N I H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。
结果成功构建了G F P重组腺相关病毒载体和报告病毒-V s s C MV-G F P,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/m L。
重组腺相关病毒V s s C MV-G F P感染N I H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。
结论V s s C MV-G F P对真核细胞具有感染能力,并且G F P可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。
EGFP-Cre重组酶真核表达重组质粒的构建及表达
关 键 词 ： 基 因 ；细 菌 噬 菌 体 Ｐ ；发 光 蛋 白质 类 ； 组 酶类 ； 隆 ， 子 １ 重 克 分
中 图 分 类 号 ： Ｒ ９ ． ３４３ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： １ ７ — １ ４ ２ ０ ） ２０ ０ － ４ ６ ２４ ９ （ ０ ７ ０ — １ １０
基础 。 １ 材 料 与 方 法
段 、 小 肠 碱 性 磷 酸 酶 、 ｈ Ｍｌ Ｓ 牛 Ｘ ｏ Ｉ、 ｕ Ｉ、 ｍａＩ、
Ｂ ｍＨ Ｅ ｏ Ｖ 、 ａ Ｉ、 ｃ Ｒ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉａ ｅ（ 连 Ｔａ Ｒａ ｇｓ 大 Ｋａ
生 物 工 程 公 司 ） Ｔ ｑ ＤＮＡ ｏｙ ｒｓ 中 国 ， ａ Ｐ ｌｍｅａ ｅ（
程 学 院 张 彦 定 教 授 惠 赠 ） Ｇｅ ｅ ｕｅＴＭ Ｏ ｂ 。 ｎ Ｒ ｌｒ ｌＯ ｐ Ｄ ＮＡ Ｌ ｄ ｅ 美 国 Ｆ ｒ ｎ ａ ａ ｄ ｒ（ ｅｍｅ ｔｓ公 司 ） Ｋｌｎ ｗ 大 片 ， ｅｏ
有报 告 基 因增 强 型 绿 色 荧 光 蛋 白 （ ｎ ａ ｃ ｄｇ ｅｎ ｅ ｈ ｎ ｅ ｒｅ ｆ ｏｅｃ ｎ ｅｐ ｏｅ ， ＧＦ 的 Ｃ ｅ真 核 表 达 载 体 ｌ ｒｓｅ ｃ ｒｔｉ Ｅ Ｐ） ｕ ｎ ｒ ｐ ＭＶ— ｒ－ ＧＦ ， 与含 有 ２个 Ｌ ｘ Ｃ Ｃ ｅＥ Ｐ 并 ｏ Ｐ靶位 点 的 质 粒 ｐ Ｓｌｎ ｅ 共转 染 细 胞 ， 测 Ｃ ｅ重 组 酶 在 体 外 Ｃ ｉ ｃｒ ｅ 检 ｒ 的表 达情 况 和生 物学 活性 ， 为进 一 步制 备 Ｃ ｅ转 基 ｒ 因动 物及 Ｃｒ／ ｏ ｐ条 件性 基 因突 变 动物 研 究 奠 定 ｅＬ ｘ
李 丽 ，陈 凌 ， 丹 如 ，刘 志春 ，江 一 平 柯
gfp基因的克隆与表达
g f p基因的克隆与表达(共7页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--基因工程实验设计题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达专业：生工1001 姓名：刘会淼2013年3月13实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入 DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。
1.材料与方法：实验材料克隆菌 DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、 Not Ⅰ仪器设备Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管试剂及溶液分装后于121 ℃高压灭菌20 min。
（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）；溶液Ⅰ 50 mL葡萄糖50 mmol/LTris-Cl (pH 25 mmol/LEDTA (pH 10 mmol/L121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存；溶液Ⅱ 100 mLNaOH mol/LSDS 1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；溶液Ⅲ 100 mLKOAc (5 mol/L) 60 mL冰乙酸 mLH2O mL121 ℃高压灭菌 15 min后置于0~4 ℃贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程导言在分子生物学研究中，质粒是一种重要的工具，可用于携带外源DNA，转导到靶细胞内进行表达或操纵基因。
在许多应用中，需要从头开始构建特定的质粒来满足实验需求。
本文将介绍重组质粒的构建流程，包括质粒设计、DNA片段的合成、连接和转化等步骤。
质粒设计重组质粒的构建首先需要进行质粒设计。
在设计过程中，需要考虑以下几个方面：质粒拓扑结构、宿主细胞、选择标记、启动子、终止子等。
其中，质粒拓扑结构是质粒构建的基础，可以选择环状质粒或线性质粒；宿主细胞是质粒的宿主细胞，需要考虑宿主细胞的特性和适用范围；选择标记是用于筛选携带外源DNA的宿主细胞，可以选择抗生素抗性标记、荧光蛋白标记等；启动子和终止子则是用于调控外源DNA的表达水平。
DNA片段的合成在质粒构建中，需要合成一系列DNA片段，包括载体骨架、选择标记、启动子、基因、终止子等。
DNA片段的合成可以通过多种方法进行，包括化学合成、PCR扩增、酶切和连接等。
在合成过程中，需要确保DNA片段的正确性和纯度，以保证后续的连接和转化效率。
连接连接是质粒构建的关键步骤，通过连接不同的DNA片段来构建目标质粒。
连接的方法包括酶切和连接、PCR扩增和连接、重组DNA技术等。
在连接过程中，需要确保连接效率和准确性，避免产生错误连接或杂交产物。
此外，对于大片段DNA的连接，还需要考虑连接的稳定性和转化效率。
质粒的放大和提取连接完成后，需要将质粒放大到足够的数量，并提取纯净的质粒DNA。
放大的方法可以选择细菌发酵、真菌发酵等，根据质粒的特性选择合适的宿主细胞进行放大。
质粒提取的方法包括碱裂解法、隐式裂解法等，确保提取的质粒DNA的纯度和完整性。
质粒的转化最后一步是将构建好的质粒转化到目标宿主细胞中，进行表达或操纵基因。
转化的方法可以选择化学转化、电转化、热激转化等，根据宿主细胞的特性和实验需求选择合适的转化方法。
在转化过程中，需要考虑转化效率、亲和性和表达水平等因素，确保转化的质粒可以稳定存在和表达。
质粒重组实验报告
质粒重组实验报告质粒重组实验报告引言：质粒重组是一种重要的实验技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，用于研究基因功能、蛋白质表达等方面。
本实验旨在通过质粒重组技术，将外源基因成功导入到大肠杆菌中，并通过酶切、连接、转化等步骤验证重组质粒的构建。
材料与方法：1. 外源基因：选择了编码了绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pGFP。
2. 宿主细胞：采用大肠杆菌作为宿主细胞。
3. 酶切酶：使用限制酶EcoRI和BamHI进行酶切反应。
4. 连接酶：使用T4 DNA连接酶进行连接反应。
5. 培养基：含有抗生素的LB培养基。
实验步骤：1. 酶切反应：将pGFP质粒和EcoRI、BamHI酶切酶按照指定条件进行酶切反应，以得到线性化的质粒和目标基因片段。
2. 连接反应：将线性化的质粒和目标基因片段加入连接酶缓冲液中，按照指定条件进行连接反应，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒加入含有大肠杆菌的培养基中，通过热激转化法使质粒进入细胞。
4. 筛选：将转化后的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出含有重组质粒的菌落。
5. 验证：通过PCR、酶切等方法对筛选出的菌落进行验证，确认质粒重组成功。
结果与讨论：经过酶切、连接、转化等步骤，成功构建了质粒重组实验系统。
在LB平板上筛选出了多个抗生素耐受的菌落，表明转化成功。
通过PCR验证，检测到了目标基因片段的特异扩增带，证明重组质粒中成功导入了外源基因。
进一步进行酶切验证，发现重组质粒经过连接反应后，酶切位点发生改变，与未连接的质粒有明显差异。
这些结果表明，质粒重组实验成功构建了重组质粒，并将外源基因导入到大肠杆菌中。
质粒重组实验的成功对于基因功能研究和蛋白质表达具有重要意义。
通过重组质粒，可以将外源基因导入到宿主细胞中，进而研究其在生物体内的功能和表达情况。
例如，可以通过重组质粒实现基因敲除、基因表达调控等功能，从而深入了解基因在生物体内的作用机制。
同时，重组质粒还可以用于蛋白质表达，通过外源基因的转录和翻译，使宿主细胞产生目标蛋白质，用于研究其结构、功能等方面。
重组质粒的构建
重组质粒的构建[实验原理]外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。
因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
[仪器、材料与试剂]恒温摇床、紫外线透射仪、移液枪、pH计、电泳槽、T4DNA连接酶、T 4DNA连接酶缓冲液、载体、目的DNA片段[实验步骤]1、在微型离心管中混合以下试剂：试剂体积（uL）目的DNA 4载体分子1T4DNA连接酶及缓冲液52、混合液于16℃保温2-4h或过夜，取2uL做电泳检查，鉴定反应连接产物，做完DNA重组后，暂放冰箱保存，迅速做转化实验。
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ｕＰＡ基因重组ＧＦＰ－腺相关病毒载体质粒的构建及其表达摘要：利用基因重组技术，用RT-PCR法从幼鼠肾脏获得μPA cDNA，再克隆到质粒pAAv-IRES-hrGFP的多克隆位点，构建重组质粒pAA V-hrGFP-uPA，通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性，采用磷酸钙共沉淀法，以重组质粒pAAv-hrCFP-uPA和pAAv-RC、pHelper共转染AAv-293细胞，产生具有传染性的病毒颗粒；用斑点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度，再将此病毒颗粒体外转染到培养的肾小管细胞中，倒置荧光显微镜观察GFP的表达，用免疫组化法检测转染的uPA蛋白表达，结果表明：成功地构建uPA基因GFP-腺相关病毒重组质粒，病毒滴度达每mL4×1013病毒颗粒，60％～70％肾小管细胞感染了病毒颗粒，感染的肾小管细胞能稳定、高效表达外源uPA蛋白，为今后建立AA V－uPA 基因治疗肾纤维化的模型奠定了良好的基础。
关键词：uPA；GFP；腺相关病毒载体；基因转染尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase typeplasminogen activator，uPA)自身有直接降解基底膜及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的作用，uPA还可通过激活纤溶酶及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解ECM，uPA 激活肝细胞生长因子间接对损伤肾脏起保护作用，因此uPA在降解ECM、逆转纤维化方面起重要作用，肾脏纤维化的病理改变主要是肾小球硬化和，肾小管间质纤维化，是肾脏ECM合成与降解失衡，导致ECM过度积聚的结果，因此，我们设想采用高效表达载体-腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AA V)载体，将uPA基因全长序列转移到有纤维化病变的部位，以增强病变局部uPA的表达，发挥其降解ECM的作用，从而缓解肾纤维化的进程，为临床治疗肾脏纤维化提供理论基础。
1材料和方法1．1材料AA V Helper-Free System(#240071)、pAA V-IRES-hrGFP(#240075)、AA V-293细胞(#240073)和XL10-Gold感受态细菌(#200314)购自美国Stratagene公司，TRIzol regent(15596-018)购自美国invitrogen公司，Reverse Transcription System(A3500)、pGEM-T EasyⅡ(A1380)，L4 DNA ligase(#M1801)、Wizard PureFection Plasmid DNA Pu-rification System(A1330)购自美国Promega公司，DNA Ladder Mix(#SM033 1)、Taq DNA polymerase(EP0404)、dNTP Mix(R0191)购自美国Fermen-tas MBI公司，限制性核酸内切酶BamH](R0136V)、Xho I(R0146V)购自美国NEW ENG-LAND Biolabs公司，Gel Extraction Mini Kil(Z0021A)购自中国长沙安比奥公司，引物For-ward Primer：5′-TYCGGATCCCCATGAGAGTCTG-GCTTGC-3′，Reverse Primer：5′-TGGCTCGAGTCAGAAGGCTAGGCCATTC-3′，由上海生工生物技术有限公司合成，测序由上海生工生物技术有限公司完成，兔抗Flag M2抗体(F1804-200UG)购自美国Sigma公司，2周龄SD雄性大鼠购自中南大学湘雅二医院动物实验中心，肾小管上皮细胞由中南大学湘雅二医院小儿肾脏病研究室保存。
1．2方法1．2．1大鼠肾脏uPA基因的获得取Spragoc-Dawleg 2周龄雄性幼鼠，按TRI-ZOL一步法提取肾脏总mRNA，逆转录合成eD-NA第一链，PCR法特异扩增uPA cDNA，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，uPA cDNA为1299bp，用GelExtraction Mini Kit回收酶切产物，置pH8.0 TE 缓冲液中，uPA cDNA-20℃保存。
1．2．2pGEM-T-uPA重组质粒的构建将uPA cDNA用T4 DNA ligase连接到pGEM-T Easy载体上，并转染到JM 109感受态细菌，涂于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，置37℃恒温箱倒置培养14～16h，作氨苄青霉素抗性筛选，挑选固体平板上长势良好的白色菌落6个，分别接种于3mLLB培养液内(Amp)，于37℃摇床内培养14h增菌，将6管菌液各取1.5mL，按Puprep PIasmid Miniprep Kit说明书提取质粒，得到pGEM-T-uPA 重组质粒，将重组质粒用BamHI/Xho I双酶切后，证实含相应的uPA基因片断，用Gel Extraction Mini Kit回收uPA基因片断，-20℃保存。
1．2．3pAA V-hrGFP-uPA重组质粒的构建将上一步骤中获得的uPA基因片段用T4DNA ligase连接到pAA V-IRES-hrGFP质粒的多克隆位点，并转染到XL 10-Gold感受态细菌，涂于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，置37℃温箱倒置培养14～16h，作氨苄青霉素抗性筛选，挑选固体平板上长势良好的白色菌落6个，分别接种于3mL LB培养液内(Amp)，于37℃摇床内振摇培养14～16h增菌，将6管菌液各取1.5mL，按Puprep Plasmid Miniprep Kit说明书提取质粒，得到DAA V-hrGFP-uPA重组质粒，将重组质粒用BamH I/Xho I双酶切后，证实含uPA基因片断，DAA V-hrGFP-uPA 重组质粒送检测序，准备足够的pAA V-hrGFP-uPA重组质粒和其他两个辅助质粒oAA V-RC和pHelper，用Wizard Pure FectionPlasmid DNA Purification System提取超纯质粒，供下一步转染实验。
1．2．4AA V-293细胞培养AA V-293细胞来源于普通的HEK293细胞系，但是可以产生较高的病毒滴度，HEK293是转染了腺病毒5型DNA的人胚胎肾细胞，AA V-293细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中生长，AA V-293细胞贴壁不牢，轻吹大瓶壁即可传代，在细胞达到50％融合时传代，且传代不宜超过20代，同时注意传代和接种时不要让细胞成块。
1．2．5pAA V-hrGFP-uPA的产生及鉴定接种3×106个AA V-293细胞于100mm培养皿中，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养2d细胞达到70％～80％融合时，吸取每个质粒溶液pAA V-hrGFP-uPA质粒、pAA V-RC和pHelper(浓度均为1g/L)各10μg加入到15mL 柱状试管中，再加入1mL 0.3mol/L的CaCl2，轻轻混匀，加入1mL 2×HBS于另一柱状试管中，滴加上述1.03mL DNA/CaCl4混合物，反复吹打混匀，以点滴方式加入DNA/CaCl2/HBS悬液于AA V-293细胞的培养皿中，旋转均匀分散该DNA 悬液，将培养皿放人37℃的培养箱中培养6h，培养结束后，添加10mL新鲜的含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续在37℃培养箱中培养72h，培养结束后，收集培养基和细胞于15mL的柱状试管中，经过4次冰冻和解冻(37℃)循环，每次持续10min，然后于室温中离心(10000g)10min，转移上清(初病毒储存液)于另一新的试管中置-80℃保存，Buffer TE代替质粒作阴性对照，转染后48h倒置荧光显微镜观察GFP表达，以确定转染成功；转染后72h收集病毒颗粒，并将获得的病毒颗粒再次感染AA V-293细胞，以确定其感染能力。
1．2．6病毒载体的纯化与滴度测定对重组的pAA V-hrGFP-uPA用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析进行纯化：纯化后用斑点杂交方法检测重组病毒的滴度；利用高压液相层析(HPLC)法检测重组病毒的纯度，具体方法参照文献。
1．2．7uPA基因转染肾小管细胞及其表达的测定按每孔1.5×105个肾小管细胞接种于12孔培养平板中，培养细胞达到70％融合，每孔添加终浓度为4mol/L羟基脲和1mol/L丁酸纳，混匀后，放人培养箱中继续培养5～6h，吸出培养基，加入 1.5mL预温的含20％小牛血清的DMEM/F12培养基和相应的病毒存储液0.5mL，继续培养48h，培养结束后。
倒置荧光显微镜观察GFP表达，uPA基因的表达以Flag标记蛋白进行免疫组化染色来判断，一抗为兔抗Flag M2抗体(1:200)，二抗为生物素化的羊抗兔抗体，加SABC孵育后进行DAB显色。
2结果2．1uPA cDNA片段的获得用RT-PCR法扩增大鼠uPA eDNA 1299 bP片段，琼脂糖凝胶电泳证实所得到的基因片段是正确的(图1)。
2．2 pAA V-hrGFP-uPA重组质粒的酶切鉴定pAA V-hrGFP-uPA重组质粒经BamH I/Xho I双酶切后得到1299 bp的uPA基因片段，表明pAA V-hrGFP-uPA重组质粒的构建正确(图2)。
2．3pAA V，hrGFP-uPA重组质粒DNA序列分析证实pAA V-hrGFP-uPA序列完全正确，无碱基突变。
2．4pAA V-hrGFP-uPA的产生分别取pAA V-hrGFP-uPA和pAA V-RC、pHelper质粒各10μg，经磷酸钙沉淀法共转染AA V-293细胞2～3d，Buffer TE代替质粒转染细胞作阴性对照，阴性对照平皿中AA V-293细胞长满后有少量细胞漂浮，但平皿上一直布满细胞，培养基变成桔黄色，提示阴性对照没有病毒颗粒产生，转染质粒的AA V-293细胞逐渐聚集成团并漂离平皿，培养基中有大量漂浮细胞，培养基的颜色由桔黄色变为黄色，细胞肿胀、变圆，将质粒转染组在倒置荧光显微镜下观察，可见细胞呈绿色，表明转染成功(图3、4)。
2．5uPA基因转染肾小管上皮细胞及其表达AA V-293细胞产生的病毒颗粒转染肾小管上皮细胞，48h后在倒置荧光显微镜下观察约60％～70％的肾小管上皮细胞表达绿色荧光蛋白，免疫组化法观察到肾小管上皮细胞可有效表达flag蛋白，细胞质中具有较多的棕黄色颗粒，阴性对照组均没有绿色荧光蛋白和flag蛋白的表达(图5、6)。
3 讨论肾小球硬化和肾间质纤维化归根结底是肾脏ECM合成与降解失衡导致ECM过度积聚的结果，目前已知参与ECM降解的酶主要有3类：1)丝氨酸蛋白酶；2)基质金属蛋白酶；3)半胱氨酸蛋白酶，其中主要是前两类，uPA属于丝氨酸蛋白酶家族，uPA的主要作用是器官形态发生、组织修复和肿瘤浸润，uPA自身有直接降解基底膜及ECM的作用，uPA还能切断纤溶酶原中脯氨酸-甘氨酸-精氨酸-缬氨酸序列中的精氨酸-缬氨酸连接，催化无活性的纤溶酶原转变为纤溶酶，uPA对纤溶酶原的激活是一个正反馈逐级放大效应，纤溶酶是一广谱蛋白酶，能够降解存在于基底膜和，ECM的各种糖蛋白包括血纤维蛋白、粘连蛋白、层连蛋白和蛋白多糖中的核心蛋白，进而溶解血管内的纤维蛋白凝块和ECM成分，并形成细胞外局部溶解区。