重组腺病毒载体的构建
人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
人白介素２４基因重组腺病毒载体的构建与鉴定【摘要】目的构建含有人白介素24（hIL-24）基因的重组腺病毒载体，为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究奠定实验基础。
方法采用基因工程技术将hIL-24基因的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,鉴定正确后在PAdEasy系统中进行细菌内同源重组，通过脂质体将正确重组体包裹并转染293A 细胞以包装并扩增病毒。
采用酶切及PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。
结果酶切和PCR结果证实hIL-24基因重组腺病毒载体构建成功并可在293A细胞中表达，病毒滴度达107pfu/ml。
结论成功构建了有较强感染能力的含hIL-24基因的重组腺病毒载体。
【Abstract】ObjectiveTo construct and identify the recombinant adenovirus vector of human IL-24 gene for future gene therapy of pathological scar tissue. MethodsThe human IL-24 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pAdTrack-CMV to form the transfer vector by the method of homogenous recombination in bacteria of PAdEasy system. Then the right recombinant adenovirus was transfected into 293A cells using Lipofectine 2000. The recombinant adenovirus vector was identified by restriction enzyme digestion and polymerase chain reaction (PCR). ResultsRestriction endonuclease and PCR analysis confirmed that the human IL-24 gene was successfully inserted into the adenovirus vector. The titer of the recombinant adenovirus was 107pfu/ml. ConclusionThe recombinant adenovirus vector of hIL-24 was successfully constructed with highly infection.【Key words】Human IL-24 gene; Adenovirus; Pathological scar人白介素24基因（hIL-24）是一种肿瘤抑制基因，通过多种途径抑制、诱导、细胞的生长，对肿瘤细胞有选择性杀伤作用而对正常组织几乎无毒副作用，并且具有调节免疫系统的功能，是当今人们研究的热点[1]。
重组腺病毒包装技术构建原理
重组腺病毒包装技术构建原理腺病毒包装系统采用第1代重组腺病毒包装系统制备腺病毒颗粒，该包装系统包含1个腺病毒载体和l株包装细胞株。
1)1个腺病毒载体：含有缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列的质粒。
2)l株包装细胞株：表达El基因的293细胞。
野生型腺病毒基因组是一条约36 kb的线性双链DNA (dsDNA)分子。
基因组的两个末端被称为Inverted Terminal Repeat (ITR)，末端之间含有腺病毒DNA复制所需基因。
在病毒DNA复制周期早期表达的基因，称为早期基因，主要有4个，按表达先后顺序依次是E1、E2、E3、E4。
在病毒DNA复制周期晚期表达的基因，称为晚期基因，主要有5个，按表达先后顺序依次为Ll、L2、L3、L4、L5。
为了制备出自我失活的重组腺病毒，E1基因会被删除，使重组腺病毒成为一种安全的基因运输工具。
为了增加包装能力，E3基因也同时被删除，因为E3基因产物会提高宿主的免疫反应，而且对病毒生产不重要。
缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上构建成腺病毒载体。
El基因片段被整合到293细胞基因组中，包装病毒颗粒时，Pacl消化的腺病毒载体转梁到表达E1基因的293细胞。
El基因激活了其他早期基因和晚期基因的表达，这些基因表达产物和Pacl消化的质粒DNA 组装成病毒颗粒。
腺病毒生产生产携带目的基因的重组腺病毒颗粒，过程如下图：将环形腺病毒载体通过Pacl位点酶切后获得两末端是ITR序列的线性双链DNA，再转染线性化DNA到包装细胞。
线性化双链DNA分饰两个角色，既是病毒基因组，又是病毒蛋白表达所参照的基因模板序列。
基因组与病毒蛋白组装成病毒颗粒，病毒颗粒在细胞内成熟后，使得细胞破裂，从而使病毒颗粒释放到培养液中。
然后收集细胞和培养液，反复冻融细胞和培养液的混合物，离心收集上清，获得粗病毒。
此时的粗病毒量通常不会很高，一般会将粗病毒感染更多的包装细胞，以扩增病毒量。
重组腺病毒载体的构建【精品推荐】
腺病毒载体的特点
n 主要以Ad5型病毒为框架构建 n 具有携带外源基因和转移外源基因的双
重功能 n 可插入长达5kb的外源基因 n 通过受体介导的细胞内吞作用进行基因
转移 n 安全性，复制缺陷（E1区缺陷）
腺病毒载体的特点
n 保留了E3区的腺病毒－－可逃逸宿主免 疫应答，可用于体内基因治疗
重组腺病毒的鉴定
n 病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
n 取上清提取重组病毒DNA n 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
n 24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 n 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 n 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
病毒滴度测定
n 观察细胞病变情况，取100%出现CPE的 稀释度计算病毒滴度： 105细胞×稀释度×10个病毒/细胞 pfu/ml=
重组病毒的扩增
n 293细胞大规模培养：悬浮培养，单层培 养
n 用收集的病变细胞培养上清或冻融上清 感染293细胞
n 反复培养、感染 收集大量的病变细胞 及病毒上清
n 不整合到宿主基因组 n 增殖和非增殖细胞均可感染
构建腺病毒载体的要素
n 腺病毒基因组质粒 n 穿梭质粒 n 目的基因片段 n 包装细胞
AdMax™ system
穿梭质粒
pDC315
腺病毒载体的包装胞细
n HEK293细胞－－E1区缺陷互补的细胞系 悬浮HEK293细胞，易大规模培养，可用 于腺病毒大规模制备。但不易长期保持 稳定。 单层培养HEK293细胞，稳定，用于 重组腺病毒载体构建、蚀斑挑选。也可 用于腺病毒扩增。
MGMT基因重组腺病毒载体的构建
［ ］ ＷａｇＢ Ｊｃｎ Ｍ， ｉ ， ｔ １ Ｍ ａｉｇ ｆ ｍ ｒ ｎｃ ｔ ２ ｎ ， ａｏ ｉ Ｌ Ｊ ｅ ａ． Ｒ ｉ ｇ ｂ ｏｉ ｓ ｍ ｍ ｎ ｏｅ ｙ ｅ ｃｌ ｂ ｌ ｙｓｐ ｒ ｒ ａｎｔ ｏ ｘ ｅ［ ］ Ｚ ｏ ｇｕ ｉ ｅｓｌ ｅ ｄｂ ｕ ｅ ａ ｍ ｇ ｅ ｃｉ ｎｏ ｉ Ｊ ． ｈ ｎｈ ａ ｌ ａ ｅ ｐａ ｉ ｒ ｄ Ｙ
［ ］ ＪＤ ｇＴ ｒｅ，２ ０ ，１ （ ） ９ — ０ ． Ｊ ． ｒ ａｇｔ ０ ７ ５ ４ ：２ ５ ３ １ ａ
Ｍ ｃ ｉ Ｂａｎ Ｓ Ｃ， Ｙｉ ｕ Ｈ Ｈ ， Ｄｏ ｓ ｎ Ｊ ｂ ｏ ．Ｍａ ｎ ｔ ｎ ｎ ｐ ｒｉｌｓ ｆｒ ｇ ｅｉ ａ ｏ ａｔｃｅ ｏ ｃ
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ａｅ ｔ ｒｃｌ ｌ ｍ ｇｎ Ｊ ．Ｒ ｄｏｏｙ，２ ０ ｇｎ ｅ ｕａ ＭＲ ｉ ａｉｇ［ ］ ａ ｉ ｇ ｏ ｆ ｌ ｒ ｌ ０ ３，２ ９ ３ ： ２ （ ）
８ —４ ３８ ８ ６．
４ 参 考 文 献
FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64的构建
FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64构建的实验研究徐瑞剑王志强包头市九原区医院胸外科内蒙古包头 014060内蒙古自治区自然科学基金项目项目编号2009MS1148通讯作者：王志强Xu ruijian Wang zhiqiangDepartment of Thoracic Surgery, Jiuyuan District Hospital of Baotou, Baotou Inner Mongolia 014060实验目的：构建纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组人腺病毒载体（Ad.FnCBD64）。
实验方法：1.FnCBD64重组腺病毒粘粒载体的构建。
2.293细胞和Hela细胞的培养。
3.磷酸钙转染。
4. 筛选和扩增FnCBD64基因重组腺病毒。
5．设计公共PCR引物。
6. 鉴定Ad. FnCBD64重组腺病毒。
7. 浓缩纯化重组腺病毒。
8. 测定病毒滴度（50％组织培养感染量TCID50）。
9.体外安全性研究。
结果：成功构建了纤维连接蛋白羧基端细胞结合域（FnCBD64）基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64。
结论：本实验成功地构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒，为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞的黏附力提供了转染载体，使应用骨髓间质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能。
运用基因转染的技术加强及改造种子细胞的功能是组织工程研究中的热点问题之一。
通过这一手段的应用，不仅能获得具备旺盛生理功能的种子细胞，而且还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白，有利于组织构建。
腺病毒载体是组织工程基因改造的常用的病毒性载体，同其他的载体体系对比，腺病毒载体是最具有潜力的载体之一，具有高效感染分裂细胞及非分裂细胞能力，制备容易、纯化和储存方便，并且滴度高、容量大[1]。
能插入大片段的目的基因，携带的外源基因不会整合在宿主染色体中，在靶细胞内以附加体形式存在，插入突变的危险极低，具有较低的遗传毒性。
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建-最新文档
TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建能够特异识别抗原肽-MHC复合物的T 细胞受体(T cell antigen receptor ,TCR)，在肿瘤抗原的识别及杀伤过程中具有重要作用[1,2]，将肿瘤抗原特异性识别的TCR基因转染T细胞用于杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的方法之一[3]。
在以往实验中发现转染TCRVβ7.1基因的T细胞对肝癌细胞株BEL-7402[4]杀伤活性明显提高，由于脂质体的转染率较低和毒性较大，现构建重组腺病毒载体Ad.TCRVβ7.1，以提高转染率和降低毒性。
1材料与方法1.1质粒、菌株和细胞AdMaxTM 腺病毒包装系统(腺病毒骨架质粒、腺病毒穿梭质粒pDC315、HEK293细胞)购自加拿大Microbix公司；PBMC从人血分离；质粒pcDNA3.1- TCRVβ7.1、Hela（宫颈癌细胞）及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。
1.2试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒及DNA Mark购自Takara公司。
Lipofectamine2000和Trizol购自Invetrogen公司。
质粒提取及胶回收试剂盒均购自Omega公司。
淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技XX公司。
1.3穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1的构建穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1构建过程如（图1）。
设计一对带有EcoRⅠ和XhoⅠ的TCRVβ7.1引物，PCR产物双酶切后连接到穿梭质粒pDC315中，得到腺病毒穿梭质粒pDC315 - Vβ7.1。
图1 穿梭质粒pDC315Vβ7.1的构建1.4重组腺病毒Ad.TCRVβ7.1的包装接种4×105个低代的HEK293细胞于六孔板中，约24h后细胞密度达到60%～80%时，用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒和骨架质粒共转染293细胞。
待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养。
EEF1A2嵌合型重组腺病毒载体的构建及鉴定
因在 相 关 疾病 中的 作 用奠 定 了基 础 。
关键 词
腺病毒科 ； Ｅ Ｆ Ａ ； 腺病毒 载体 ； 基 因克隆 Ｅ １２
Ｃ Ｈａ — ｉ Ａ０ ｌｘａ，
Ｃｏ ｓ ｒ ｃｉ ｎ ａ ｄ ｉ ｅ ｔｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｕ ｎ ｔ ｕ ｔ ｎ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｆ ｈ ｍａ ｈ ｍｅ ｉ ｅ ｏ ｏ ｉ ｏ ｎ ｃ ｉ ｒ ｃ ｒ ｃ ｍｂ ｎ ｎ ｄ ｎ ｖ ｒ ｓ ｗｉｈ ＥＥＦ１ ｅ ｅ ｉ ａ ｔ ａ ｅ ｏ ｉｕ ｔ Ａ２ ｇ ｎ
ｐ ｃ ｉｇａ ｄａ ｐｉ ｃ ｔ ｎｉ ｅ２ ３ｃ ｌ Ｔ ｅｔｒｅ ｇ ｎ ａ ｅ ｃｅ ｙ ｐ ｌｍ ｒｓ ｈ ｉ ｒ ａ ｔ ｎ （ Ｃ ａ ｋｎ ｎ ｍ ｌ ａ ｏ ｔ ９ ｅ１ ｈ ｇｔ ｅ ｅｗ ｓ ｔ ｔｄｂ ｏ ｅａｅｃ ａ ｅｃｉ Ｐ Ｒ）ａ ｄ Ｗｅｔ ｎ ｉ ｆ ｉ ｎｈ ． ａ ｄ ｅ ｙ ｎ ｏ ｎ ｓ ｒ ｅ
ｌ４ ７
用 医学 杂志 ２ ０ 年第 ２ 卷 ０９ ５
Chemerin重组腺病毒表达载体的构建
( 1. Sha ng ha i Inst it ut e o f E nd o c ri n ea n d M e t ab o li cD i sea se s, Sha n g ha i2 0 0 0 2 5 ;2 . D ep ar tm e n t o f En d o c r ino lo g y, t heA ff i li a te d H o spi t a l o f Ji an-
� � � � ��� pAd Ea sy-1 � � � � BJ5183 �� � � , ��� ��� � � �� � A d -c hem er in , � P ��� Ad ( c yto p at hi c ��
ef fec t ,� CPE ) , hem erin , :� � � � � � � �� � � �� �� � c � �� � � �� � �� � �
� � � � � � � � C c c bFra biblioteka a c a
� � � � � � � W AN� G � � H 1 , H A N G D 1 , H U A N G J 1 , Y A N G J 1 , Y U A N G - 2 , Y A NG Y
g su U n i ver si ty, Z he nj i a n g Ji a n g su 2 120 0 1 , Chi na )
21 3 ( ) � � � � � � 20 11 5 Jo urna l o f Ji a n g su U n i versit y( M ed i c i n e Ed it io n )
V ol. 21 No . 3 M a y 2 0 11
C
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心内科 李德
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外源性基因的转移方法
n
n
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磷D聚显转转E酸阳微A染染钙离注E效效－生－子射率率葡物－技Dw＜2聚N秀术D5wA1%糖Mw5-共%S法.专沉Ob法b心淀io做法o.生co物m
n 电穿孔法
n 脂质体载体法
n 病毒载体
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共转染后293细胞的病变效应
n n
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壁注发表漂意生现浮与在：生－细细转物C胞染 胞wP秀wE老肿后w-化胀1.0专b和、－b心营变1io做2o养圆天.生c， 不o物m部足分鉴的别细胞脱
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腺病毒载体的特点
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转移
n 安全性，复制缺陷（E1区缺陷）
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穿梭质粒
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重组腺病毒的鉴定
n
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引离取用病物心上目变作清的29生P提 片3细C物取 段Rw胞秀w重 引于w-组 物.液专b和病b氮心病毒io做、o毒D.生3cN基7oA物°m因C组反特复征冻片融段，
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重组腺病毒的制备
nn1质共实脂、粒转质验A转液2染体步染0：2介骤液μ生9重导3配l物细，组w重制胞1秀w穿组0w´-梭穿H.专质Bb梭Sb心粒质io5做o粒2μ.0生和cμlo，物腺ml，去病腺离毒病子基毒水因基5组μ因质l组粒
及病毒上清
n 病变细胞及病毒上清分别保存于-70°C
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重组病毒的纯化
n 胞 4初°4步次C231纯、、、1化4取液5生0°上氮0物rCwp清、m秀w3加3离0w7-0入°心.专0br等Cp5b心反m量imo离复做o的in.心冻生三co融3物m氯0收三m集i氟n的乙病烷变，293细
可使基因定向克隆的程序简化
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重组穿梭质粒的鉴定
B液：DOTAP 30 μl， 10´HBS 10 μl，去 离子水 60 μl
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pDC315
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腺病毒载体的包装胞细
n 稳H于悬E定腺浮K单。病2H9层E毒3生K细培大物2w胞养9规秀3w－H细w模-E－.胞专K制bE，2b心备19io区易3做o。细.缺大生c但胞o陷规物m不，互模易稳补培长定的养期，细，保用胞可持于系用
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构建腺病毒载体的要素
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目包穿腺的装梭病基细质毒生因 胞粒基物片因w秀w段组w-质.专b粒b心io做o.生co物m
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AdMax™ system
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重组病毒的扩增
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用感2反养9收染复3细集培29胞生的 养3大 细物病 、w规 胞秀w变感模w-细染.培专b胞b养心培io做：o收养.生悬c集上o物浮m大清培量或养的冻，病融单变上层细清培胞
构建：＜20代－－构建成功的关键
扩增：无特殊要求
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重组原理
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注意事项
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设用不选转阴高要用染性浓更传时生对度换代 29物照N培3次w细a秀w养数H胞w-C液少.不专Ob的3b要心调2io做9太节o3.生密细培co物胞m养液50P－H值60%
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外源性基因的制备
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中VR体TS提会M－取：CPC中生。从R提物目得w取秀w的到w总-基B.专RTb因Eb心N丰iBAo做o2度.生cc高oD物mN的A组织或细胞
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以介反重绍生义重组物Bw组T秀w腺E腺wB-病.病2专b腺毒b心毒病io载做o毒载.体生c表o的物体m达构构载建体建过为程例
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BTEB2简介
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功基能本：转生促录物进元w秀w件 VwS-结M.专b合Cb心增蛋io做o殖白.生c和2o物－m表转型录转因化子
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腺病毒载体的特点
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保不增疫留整殖应了合和答生E到 非，3物宿 增可区w秀w主 殖用的w-基 细于腺.专b因 胞体病b心均内 组i毒o做o可基－.生c感因o－物m治染可疗逃逸宿主免
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病毒滴度测定
n n
P第培02.4B2养8孔Sm管至2培l。4，总生小养每量物时板w孔2秀w后每m加w-，孔l，.入专b取接混b不心病种io匀做同o毒1.后生稀×c转o作物释1m0染15度个0液倍的20比9病.23m细稀毒l加胞释液至
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目重酶的组切片穿鉴生段梭定物测质：w秀w序粒用w-pB.D专abmCb心H3io1做oI5.A和生coS物mBEcToERT2I ，双电酶泳切
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4、取上清重复抽提 2 次，得到初步纯化 的重组腺病毒
5、用0.22μm滤纸过滤除菌，分装，保存 于－70 °C。
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重组病毒的纯化
n 进一C操s步作C生l纯梯 复物化杂度w秀w，离w-设心.专b备b心i要o做o求.生co高物m，价格昂贵
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重组穿梭质粒的构建－－将 PCR产物克隆到穿梭质粒
n n n
体穿p用用D会梭BTC4a3：质连m1生H5粒 设接及I物计酶wB和秀w引T将定EwE-物BBc.向专oTb2时REb克心c引BiIoD做隆2o入双N.生ccA需酶oD物mN要切A的穿反酶梭向切质连位粒接点到
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腺病毒载体的包装细胞
n n
H建HEE和高 1KK0扩22糖%99生F增33型B细细物DSw胞胞（秀Mw的的wE构-M.专传培建bb心养 代）io做次o，.生数c1o0物m与%腺NB病S毒（扩载增体）构
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病毒载体
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S增反V可整殖转4整合0细 录病合到生胞 病毒到宿物毒w载宿主秀w载体主染w-体.专染色bb心色体io做体，o.生，只co物m可感感染染增增殖殖细和胞非
n 腺病毒载体
不整合到宿主染色体，增殖和非增殖
细胞均可感染
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n 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
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