肿瘤细胞培养基本方法
细胞培养基本技术及免疫细胞的培养方法
细胞培养第一节细胞培养基本技术一、免疫细胞分离技术1、淋巴细胞的分离取肝素抗凝血1m1加Hanks液1m1稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min水平离心20min，管内分为4层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。
用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。
然后用Hanks液洗两次，每次2000r／min离心10min，最后用RPMI l640培养液将细胞配成2×106／m1的细胞悬液备用。
2、T细胞及B细胞的分离将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMI l640培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T细胞。
然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B细胞，并用少量的RPMI l640培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B细胞。
尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。
3、CD4细胞及CD8细胞的分离（1）CD4细胞的分离：将一定量的T细胞悬液通过一根SephDdexC—10柱，然后用少量的RPMll640培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4细胞。
（2）CD8细胞分离：用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。
然后将已标记有抗CD8单克隆抗体的T细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1加入上述的平皿内，4℃放置2小时，用PBS轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS吹打。
收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640培基中备用。
CD4细胞亦可用此法分离。
4、单核巨噬细胞的分离单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。
将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃ C02温箱内温育1小时，然后用RPMI 1640培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。
肿瘤细胞分离培养(1)
肿瘤细胞分离培养操作流程1.准备好动物试验台。
提供无菌环境当然是最好的。
2.将一个10cm培养皿（无菌）置入操作台中，用来盛放肿瘤，放在冰上。
3.麻醉小鼠。
推荐异氟烷，因为它对代谢的影响最小。
4.腹部向上将小鼠固定于工作平台上；胶带或大头针固定四肢。
为尽量减少因痛苦导致的麻醉动物过早苏醒，胶带是首选。
5.彻底清洁腹部和胸部区域，用乙醇或碘剂消毒。
此步骤既要求迅速又要求消毒彻底，因为动物的毛皮是第一个潜在的污染源。
如果动物有排便，一定要清理和消毒沾染粪便的区域。
（有文献建议断食12h）6.准备好所有必要的试剂。
7.主要实验材料：Defined K-SFM 无血清培养基、Ⅱ型胶原酶或胰蛋白酶、RPMI 1640、PBS，EGF（表皮生长因子）和bFGF（碱性成纤维生长因子），青霉素和链霉素以及两性霉素B（0.25 mg / ml）。
8.最好在无菌环境中分装胶原酶，轻柔涡旋，并在37℃环境下使胶原酶溶解30-60分钟。
注意，虽然胶原酶溶解迅速，充分溶解30分钟以上的胶原酶具有更加稳定的消化效率（基于细胞总产量）。
9.用含青霉素及链霉素的RPMI 1640反复冲洗并剔除坏死组织后，在培养皿内用无菌剪刀反复剪切成约1 mm 3 大小的组织块。
10.收集剪切后的肿瘤组织置于底面积为25 cm 2的培养瓶中，用含有Ⅱ型胶原酶200-400 U/mL的Defined K-SFM 无血清培养基在5%的CO 2培养箱中37 ℃消化2h-3 h后，当大多数组织变成细胞悬浮液时，酶消化停止。
倒置显微镜下观察大部分细胞为单个细胞。
11.用RPMI 1640洗涤，300g离心5min，1-3次彻底去除胶原酶。
收集消化后的肺癌细胞。
12.用含EGF 20 ng/mL、bFGF10 ng/mL 的Defined K-SFM培养基悬浮细胞并转移到25 cm 2的培养瓶中，在5%的CO 2培养箱中37 ℃培养，（有文献报道建议先用有血清培养4h后换成无血清培养基，以便保持细胞形态）。
肿瘤细胞与cd8免疫细胞共培养步骤
肿瘤细胞与cd8免疫细胞共培养步骤下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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肿瘤细胞免疫细胞共培养步骤
肿瘤细胞免疫细胞共培养步骤（实用版）编制人：__________________审核人：__________________审批人：__________________编制单位：__________________编制时间：____年____月____日序言下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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常用肿瘤细胞株的培养
常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。
本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。
一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。
（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。
普通培养基采纳DMEM，含10％的。
贴壁生长后，2～3天即可传代。
【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。
2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。
3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。
【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。
(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。
(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。
(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。
2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。
(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。
(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。
(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。
肿瘤细胞培养
第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段。
癌细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但就是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2%~ 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子, 在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若「代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。
另外，体外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat -1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。
肿瘤细胞系的建立原理
肿瘤细胞系的建立原理肿瘤细胞系的建立是为了研究肿瘤生物学和治疗方法的开发，通过从患者的原发肿瘤或转移瘤中分离和培养细胞，形成可持续增殖的细胞系。
肿瘤细胞系的建立在肿瘤研究中扮演着重要的角色，它们可以用来研究肿瘤的生长机制、细胞信号转导通路、基因表达调控以及药物敏感性等。
肿瘤细胞系的建立主要分为以下几个步骤：1. 原发肿瘤样本的获取：原发肿瘤是指肿瘤起源的部位，通过手术、活检等方式获得肿瘤组织样本。
获取的样本要在临床医生的指导下进行，并尽量保持组织的完整性和洁净度。
2. 细胞分离和培养：将原发肿瘤组织进行体外分离，将组织切碎或通过酶消化等方法将肿瘤细胞从正常细胞中分离出来。
然后将分离的细胞转移到培养皿中，加入适当的培养基和生长因子，提供细胞生长所需的养分和环境条件。
3. 细胞增殖和扩增：在培养皿中，肿瘤细胞开始进行增殖。
通过适当的细胞密度、培养基成分的调整，可以促进肿瘤细胞的增殖和扩增。
为了获得可持续生长的肿瘤细胞系，需要反复传代和定期培养。
4. 细胞株的鉴定：通过形态学观察和免疫组化染色等方式，对细胞株进行鉴定，确认细胞的来源和纯度。
同时，用多种方法对细胞进行病毒感染和生物学特性的测试，以确保肿瘤细胞的稳定性和代表性。
5. 细胞的冻存和保存：为了长期保存肿瘤细胞系，通常将肿瘤细胞进行冻存。
冻存可以减缓细胞的生长活动，使其长期保存，并在需要时重新启动。
肿瘤细胞系的建立原理主要是通过分离和培养患者原发肿瘤组织中的肿瘤细胞，使其在体外条件下继续增殖，从而形成可持续生长的细胞株。
在细胞培养的过程中，肿瘤细胞可能会发生一定的改变，例如基因变异、表达水平的改变等，因此需要经常进行鉴定和验证。
肿瘤细胞系的建立对于肿瘤研究和治疗具有重要的意义。
一方面，肿瘤细胞系可以用来研究肿瘤生长的分子机制，通过研究其增殖、迁移、侵袭和转移等特性，可以揭示肿瘤的形成和发展机制。
另一方面，肿瘤细胞系也可以用来评估药物的敏感性和抗药性，帮助选择和优化治疗方案。
肿瘤细胞培养技术-林星石
2
肿瘤细胞in vitro的特点
细胞保持永生性：自我复制 形态学：大小不一 逐渐一致 增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50% 突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化
变低分化 表面性状：负电荷数量>正常，贴壁性，抗原性可
变异 接触抑制减弱或消失： 悬浮生长特征： 成瘤性：移植到动物体内可成瘤
与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养
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细胞分裂增殖的调控 （细胞周期）
多种基因的协同作用 调控因子：
基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性
肿瘤细胞
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7
细胞间的相互影响
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培养液特殊添加剂
常用的促细胞生长因子及使用的终浓度
添加剂
终浓度
添加剂
终浓度
BSA transferrin insulin 氢化可的松
10-5mol/ml 5-10 g/ml
5 pg/ml 10-5mol/ml
EGF FGF NGF
5ng/ml 5ng/ml 5ng/ml
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肿瘤细胞的培养
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技术-培养
原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞， 防止细菌、真菌污染。
传代培养：增殖力低的细胞需要饲养 细胞适当密度, 基本长满后 传代, 前10代不稳定，注意 培养条件，适当调整培基。
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13
技术- 鉴定与建株
鉴定：组织来源 、形态特征、核型染色体分 析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、 集落形成、致瘤实验（裸小鼠）
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肿瘤细胞培养基本方法
(一)准备和安装过滤器
清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。
在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。
用泵过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。
2、按要求添加碳酸氢钠、谷氨酸钠、HEPES等，充分搅拌使之溶解。
3、调pH至7.2左右。
4、加水至最终体积。
5、在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。
6、瓶口封好，4℃冰箱贮存。
(三)小牛血清的处理
市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近
来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。
胎牛血清不必灭活。
1、将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
2、处理后的血清贮存于4℃。
3、小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。
(四)生长培养基的配制
除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。
1.培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。
2.按如下比例配制：基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。
按1％体积
分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 μ／mL，。
(五)冻存细胞的复苏
1.应遵守慢冻快融的原则。
先将水浴锅调至37-37。
5度，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸
至水面以下不断摇动至融化。
2.在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取
出细胞，置培养并内轻轻摇晃，使细胞均匀后置培养箱内培养。
(六)传代:
1.贴壁细胞:
对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基，吸的越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1－3次）。
50ml培养瓶加入消化液约1-3ml，按此比例进行消化，(根据经验)，晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使
细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培养瓶内，加入完全培养基后继续培养或实验。
2.悬浮细胞:
一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000rpm，5min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。
(七)冻存
将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以完全培养基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约
106/ml。
加入10%的DMSO。
以每管1～2ml分装至冻存管中。
用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。
次日保存到液氮中。
(八)注意事项
1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;
2.无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上;
3.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管
或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。
分装后置4度保存;
4.消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度
保存;
5.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌
的应按程序来菌)。
至少每月一次。
6.进入操作时应注意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次。
手
及物品不要在暴露的瓶口上方来往，如果数量较多，培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作，瓶与瓶之间应相隔一定的距离，开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后应用灯先烧口，然后烧盖。
用完后同样操作。
整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。