氧化还原吸收差光谱

中国科学C辑:生命科学2007年第37卷第2期: 204~208收稿日期: 2006-06-18; 接受日期: 2006-08-15国家自然科学基金资助项目(批准号: 39890390和20673144) 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS 去垢剂DDM和β-OG对细胞色素b6f蛋白复合体中叶绿素a单线激发态寿命的不同影响陈晓波①②赵晓辉②张建平②*李良璧①*匡廷云①(①中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京 100093; ②中国科学院化学研究所分子动态与稳态结构国家重点实验室, 北京 100080; ③中国科学院研究生院, 北京 100039)摘要 据报道,细胞色素b6f蛋白复合体(cytochrome b6f, Cyt b6f)中叶绿素a (chlorophyll a, Chl a)分子的单线激发态寿命(或荧光寿命)短于甲醇中游离Chl a的单线激发态寿命(~4 ns), 但是文献报道不同来源的Cyt b6f中Chl a单线激发态寿命并不一致(一种为200 ps左右, 一种结果为600 ps 左右). 本研究证明, 不同来源Cyt b6f中Chl a的单线激发态寿命测定结果的不同, 与Cyt b6f来源无关, 而与溶解膜蛋白的去垢剂—八烷基葡萄糖苷(n-Octyl β-D-glucopyranoside, β-OG)和十二烷基麦芽糖苷(n-Dodecylβ-D-maltoside, DDM)有关. 溶解在DDM中的样品和溶解在β-OG中的样品相比, 其Chl a的荧光产率低, 强光照射下抗光破坏的能力强, 单线激发态的寿命更短(~200 ps).显然, 溶解在DDM中样品的Chl a单线激发态的寿命更接近体内真实的情况.关键词细胞色素b6f去垢剂叶绿素a单线激发态寿命单线态氧细胞色素b6f(cytochrome b6f, Cyt b6f)蛋白复合体是光合膜上参与放氧光合作用电子传递链的主要超分子膜蛋白复合体之一[1,2], 它作为质体醌(plasto- quinone, PQ)-质体蓝素(plastocyanin, PC)氧化还原酶, 一方面介导光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ, PSⅡ)和光系统Ⅰ(PSⅠ)之间的线性电子传递和围绕PSⅠ的循环电子传递; 另一方面作为能量转换器将质子从类囊体膜外侧跨膜转运到类囊体膜内侧, 形成跨膜质子电化学梯度, 为ATP合酶催化合成ATP提供能量[3,4]. 根据晶体结构分析, Cyt b6f是二聚体, 分子量约217 kD, 每个单体分子由4个大亚基和4个小亚基(Pet G, Pet L, Pet M和Pet N)组成. 4个大亚基分别为: Cyt f, 含1个c型血红素; Cyt b6, 含2个b型血红素和1个c 型血红素; Rieske[Fe-S]蛋白, 含1个[2Fe-2S] 原子簇; 亚基Ⅳ, 被认为是PQ的结合蛋白. 除蛋白部分外, 每分子Cyt b6f单体还结合一分子叶绿素a (chlorophyll a, Chl a)和一分子胡萝卜素[5,6].其实Cyt b6f中Chl a分子的存在对蛋白的稳定性是个威胁, 因为Chl a分子被激发后, 单线激发态通过系间窜跃形成三线态Chl a分子[7], 三线态Chl a分子可以和氧分子发生高效率的能量传递, 形成单线态氧; 而单线态氧是一种毒性很强的活性氧, 可以破坏色素蛋白复合体[8]. 在PSⅡ中, 为了避免单线态氧的形成, 距离叶绿素分子大约0.4 nm处分布着类胡萝卜素分子, 这些类胡萝卜素分子可以和三线态叶绿素分子发生能量传递, 及时猝灭三线态叶绿素, 从而避免了单线态氧的形成[9,10]. 而在Cyt b6f中, 胡萝卜素分子距离Chl a至少 1.4 nm, 这个距离对于胡萝卜素分子直接猝灭三线态Chl a阻止单线态氧的形成来说, 显然是太远了[5,6].第2期陈晓波等:去垢剂DDM和β-OG对细胞色素b6f蛋白复合体中叶绿素a单线激发态寿命的不同影响205但是, Peterman等人[11]和Dashdorj 等人[8]对Cyt b6f中Chl a单线激发态(或荧光)寿命进行了研究, 结果表明Chl a单线激发态的寿命很短(200 ps左右), 而甲醇中游离Chl a分子的单线激发态寿命约为4 ns. 由于Chl a分子单线激发态寿命很短, 所以通过系间窜跃形成三线激发态的几率会大大减少, 最终形成单线态氧的产率也会很低, Dashdorj 等人认为这是Cyt b6f抗光氧化的一种机制. 结合Cyt b6f的晶体结构, Dashdorj等人推测Cyt b6f中Chl a单线激发态和邻近的酪氨酸残基发生了电子传递, 从而快速猝灭了Chl a单线激发态[8,11].然而, 不同来源的Cyt b6f中Chl a单线激发态(或荧光)寿命测定的结果并不一样[8,11,12]. 来源于假根羽藻(Bryopsis corticulans)的Cyt b6f中Chl a的荧光寿命为600 ps左右, 并且由单线激发态Chl a所引起的单线态氧产率也很高, 推测应该存在其他的机制来猝灭Cyt b6f中的单线态氧[12]. 是什么原因产生了这样不同的实验结果, 是Cyt b6f本身的差别还是实验条件不同造成的？澄清这一问题, 对于阐明Cyt b6f的抗光氧化机制是必要的. 本文研究发现, 除了样品来源的差异, 实验中使用不同的去垢剂可能是一个不可忽视的因素. 在测定Cyt b6f中叶绿素的单线激发态(或荧光)寿命的实验时, 研究者分别采用了两种非离子型去垢剂, 一种去垢剂为十二烷基麦芽糖苷(n-Dodecylβ-D-maltoside, DDM), 分子量为510 Da, CMC (critical micellar concentration)为0.17 mmol/L; 另一种为八烷基葡萄糖苷(n-Octyl β-D-glu- copyranoside, β-OG), 分子量为292 Da, CMC为20~25 mmol/L (数据来自Glycon Biochemicals, http:// www.glycon.de/), 并且在实验中这两种去垢剂的浓度均接近于各自的CMC. 但是和β-OG相比, DDM更温和一些, 这可能主要是因为DDM分子结构中, 其疏水集团是12个碳骨架的烷基链, 而β-OG是8个碳骨架的烷基链. 因此, 我们借助稳态吸收、稳态荧光光谱、CD光谱、亚皮秒时间分辨吸收光谱等技术, 研究了这两种去垢剂对Cyt b6f中Chl a光学特性的不同影响.1材料和方法1.1菠菜Cyt b6f制剂的分离与纯化按照以前的文献[13]从菠菜叶绿体中分离纯化Cyt b6f样品, 保存于−80℃冰箱中备用.为便于比较, 在以下实验中, 溶解在DDM中的Cyt b6f样品和溶解在β-OG中的样品在相同条件下进行. 缓冲液均为50 mmol/L Tricine-NaOH (pH 8.0), DDM 的浓度为0.2 mmol/L, β-OG的浓度为30 mmol/L.1.2吸收光谱的测定Cyt b6f样品的吸收光谱和氧化还原光谱用岛津UV2550型双光束分光光度计测定. 测定时样品浓度均为1 μmol/L, 用铁氰化钾使Cyt b6f样品氧化, 用抗坏血酸使Cyt f还原, 用连二亚硫酸钠使Cyt b6还原. 样品中Cyt f 和Cyt b6的浓度通过测定其氧化还原差谱确定, 计算时Cyt f的消光系数采用18 L/mmol·cm, Cyt b6的消光系数采用20 L/mmol·cm[14].1.3稳态荧光发射光谱的测定用Hitachi F-4500荧光光度计进行室温荧光发射光谱的测定, 激发波长为436 nm, 发射光的狭缝宽度为5 nm. Cyt b6f的浓度为1 μmol/L.SDS处理: 将Cyt b6f溶解在含0.5% SDS的Tricine-NaOH(pH 8.0)的缓冲液中, 黑暗中室温静置20 min, 然后进行光谱测定.1.4 Chl a的光破坏实验在搅动的条件下, 将1 μmol/L的Cyt b6f样品用1.0×103μE/(m2·s)的光(经过12 cm的1%硫酸铜溶液过滤以消除热效应)进行连续照射处理. 在不同光照时间后, 进行吸收光谱的测定, 以ΔA668~700 nm的变化来计算光破坏后残余Chl a的百分含量.1.5 CD光谱的测定CD光谱的测定用 JASCO J-715 分光偏振仪在室温下进行. 光谱参数: 分辨率为 0.5 nm, 狭缝宽度为2.0 nm, 响应时间为1 s, 样品池厚度 0.2 cm, 在减去缓冲液对照的情况下, 信号采集时进行4次累加平均获得最终波谱. 测定时Cyt b6f的浓度为10 μmol/L. SDS处理Cyt b6f 样品同第1.3小节.1.6亚皮秒时间分辨吸收光谱的测定亚皮秒时间分辨吸收光谱测定按照文献[15]进行, 简述如下: 由锁模的钛宝石激光器(Tsunami, Spectra Physics)泵浦再生放大器(Spitfire, Spectra Physics) 输出800 nm (~100 fs, 0.8 mJ, 1 kHz)激光.206中国科学C辑生命科学第37卷输出的光束经分束镜后分成两束, 其中一束经光学参量放大器(OPA- 800 CF, Spectra Physics)后产生660 nm的泵浦光(~130 fs, 2 μJ/pulse); 另一束则经过一个10 mm厚的重水池产生白光探测光. 可见区的探测(420~740 nm)是在探测光路上加一带通率光片(SPF-750, CVI)来实现的. 泵浦光与探测光的偏振成54.7°, 通过非共振光学克尔效应得到泵浦和探测的时间分辨率约为160 fs. 得到的时间分辨光谱均经过色散校正. 探测系统由液氮制冷的CCD探测器(Spectrum-1, JY)和成像光谱仪(270M, SPEX)组成. 泵浦光和探测光的延时是由放置在泵浦光路上的可控光学平移台(LTS-200, Σ-Koki)控制的. 数据分析采用Matlab 5.2(Mathworks)和Mathcad Pro 7 (Mathsoft)计算机软件. 测量时Cyt b6f样品660 nm处的吸收值在0.3~0.5之间(1 mm光径).2结果和分析2.1 Cyt b6f样品的吸收光谱图1为从菠菜叶绿体中纯化的Cyt b6f 的室温吸收光谱. 669 nm处的吸收峰表示有Chl a的存在, 480 nm处的较弱的吸收峰表示样品中有类胡萝卜素存在. 蓝区421和431 nm的吸收峰分别表示Cyt f和Cyt b6在Soret带的吸收. 从Cyt b6f 的氧化还原差光谱(图1, 插图), 可以看出源于Cyt f 的523和554 nm处的最大吸收峰及源于Cyt b6的533和563 nm处的最大吸收峰. 从Cyt b6f 的氧化还原差光谱及消光系数可以计算出Cyt b6 (b-hemes): Cyt f≈2, 这表明在分离纯化的过程中Cyt b6没有丢失. 以上的结果与文献报道的结果十分吻合[14,16,17].另外, 我们比较了溶解在DDM和β-OG这两种去垢剂中的样品的吸收光谱和氧化还原光谱, 在实验条件下二者在波谱形状、峰位和峰位大小方面基本没有区别(数据没给出).2.2稳态荧光发射光谱文献报道, Cyt b6f中的Chl a处在一个十分特殊的环境中并且与蛋白质结合很紧密[18], 该Chl a有特殊的光学性质, 主要表现为荧光产率低, 激发单线态寿命很短[11]. 室温荧光发射光谱可以检测色素与其周边蛋白质环境的结合状况. 图2 为Cyt b6f在436 nm 激发下的常温荧光发射光谱. 从光谱中, 可以观察到溶解在DDM中的样品, 其荧光发射峰位为680 nm; 而溶解在β-OG的样品, 荧光发射峰位为676 nm, 峰位蓝移了4 nm, 并且荧光发射强度增加. 用SDS处理的样品中, 荧光发射峰位进一步蓝移, 为675 nm, 荧光发射强度进一步增加. 从荧光的产率来看, DDM溶解的样品荧光产率最低, 其次是β-OG溶解的样品, 最高的是经SDS处理的样品. SDS是一种常用的阴离子去垢剂, 尽管在膜蛋白的分离纯化中有时也用SDS 作为去垢剂[19], 但是它往往使色素和蛋白质发生一定程度的解离[20]. SDS和β-OG处理的Cyt b6f样品中, 荧光发射峰位蓝移和荧光产率增加, 这都说明这两种去垢剂处理样品后, Chl a和蛋白质的结合状态已经发生了改变, Chl a与蛋白质结合变得松散了, 特别是C h l a与附近酪氨酸的距离可能发生了改变,图1 菠菜Cyt b6f 制剂的吸收光谱—示连二亚硫酸钠还原的吸收光谱; ……示铁氰化钾氧化的吸收光谱; 插图中—示连二亚硫酸钠还原-抗坏血酸还原的差异吸收光谱;插图中……示抗坏血酸还原-铁氰化钾氧化的差异吸收光谱图2 不同去垢剂条件下菠菜Cyt b6f 制剂的荧光发射谱荧光产率由低到高依次为: Cyt b6f 溶解在DDM中(—), 溶解在β-OG中(----), 溶解在SDS中(……)第2期陈晓波等:去垢剂DDM和β-OG对细胞色素b6f蛋白复合体中叶绿素a单线激发态寿命的不同影响207致使酪氨酸猝灭Chl a单线激发态的效率下降, 从而增加了Chl a荧光的产量.2.3 Chl a光破坏实验的结果和分析如图3所示, 在1.0×103μE/(m−2·s−1)强光照射5 min后, 溶解在DDM中的样品中Chl a的含量为最初含量的80%, Chl a被强光破坏了20%(曲线1); 而溶解在β-OG中的样品中Chl a的含量仅为最初含量的25%左右, Chl a被强光破坏了75%左右(曲线2).强光照射20 min后, 溶解在DDM中样品的Chl a的含量为最初的60%左右, 而溶解在β-OG中样品的Chl a的含量仅为最初的5%. 可见, 溶解在β-OG中样品的Chl a在强光照射下更容易被破坏, 这一结果与荧光发射谱的结果吻合, 溶解在β-OG中的样品,Chl a的荧光产率升高, 那么单线激发态Chl a通过系间窜跃形成三线态Chl a的几率也增加, 这样就导致了单线态氧的大量生成, 单线态氧反过来攻击Chl a,从而使Chl a氧化破坏.图3 不同去垢剂条件下菠菜Cyt b6f 制剂中Chl a 的光破坏比较溶解在DDM中的样品(曲线1); 溶解在β-OG 中的样品(曲线2)2.4 CD光谱的结果和分析为了检查不同去垢剂条件下Chl a 分子与蛋白质的结合状况, 我们进行了CD实验, 图4为含DDM和β-OG去垢剂的Cyt b6f制剂和SDS处理后的Cyt b6f制剂在红区的CD光谱. 从中可以看出, 溶解在DDM中的Cyt b6f制剂在此区域有一个位于675 nm处的负峰和一个位于664 nm处的正峰, 这说明在DDM中,Cyt b6f的Chl a分子与蛋白质结合得紧密, 有其特定的位置和取向[18]. 经0.5%的SDS处理后, 正峰和负峰均消失. 说明经SDS处理后, Cyt b6f蛋白复合体发生了解离, 以至于CD信号消失, 而溶解在β-OG中的制剂, 虽然仍具有明显的CD信号, 但是信号减弱,并且和DDM中的样品相比, 其负峰红移 2 nm, 为677 nm; 其正峰则蓝移2 nm, 为662 nm. 这些结果表明溶解在β-OG中Cyt b6f的Chl a分子与蛋白质结合的紧密程度确实有所下降.图4 不同去垢剂中Cyt b6f样品在红区的CD谱——示DDM; ----示β-OG; ……示SDS2.5亚皮秒时间分辨吸收光谱由以上的实验结果, 我们可以推测溶解在DDM,β-OG和SDS中的样品, 其Chl a的单线激发态寿命应该是逐渐延长的, 为了确定这一推测, 进行了时间分辨吸收光谱的测定. 图5为 Cyt b6f在660 nm激发下,测定的680 nm处(基态漂白)的动力学衰减曲线. 对溶解在DDM中样品的Chl a基态漂白的动力学衰减曲线进行拟合, 得到两个时间衰减常数, 分别为 2.3 ps(32%)和240 ps (68%)(图5, 空心圆). Peterman 等人[11]从Synechococcus PCC 6803中得到Cyt b6f的单体,对其荧光动力学曲线进行单指数拟合得到一个250ps的组分; Dashdorj等人[8]对多种来源的Cyt b6f中Chla 在680 nm处的基态漂白动力学进行研究, 均得到一个200 ps左右的组分, 其所占比例在不同材料中为62%~91%; 他们在嗜热蓝细菌(Mastigocladus lami-nosus)中的Cyt b6f中得到一个6.5 ps (24.6%)的组分,与我们测得的2.3 ps (32%)这一组分比较接近, 这一组分被认为是样品中污染的Chl a 造成的. 我们测得的溶解在DDM中样品的Chl a基态漂白的动力学衰减常数, 和这些数据相比基本一致.溶解在DDM中样品的Chl a基态漂白的动力学衰减速度明显快于溶解在β-OG中样品的Chl a基态漂白的动力学衰减速率: 583(73%)和45(27%)(图5,208中国科学 C 辑 生命科学第37卷方框). SDS 处理过的样品, 其Chl a 基态漂白衰减速率更慢, 衰减常数接近1.5 s, 这一数值并不十分准确, 因为仪器在延时1 s 之内测量的结果有效. 但是从拟合的动力学衰减图上可以明显地看到, 在延时1 ns 以内, 经SDS 处理的样品, 其Chl a 基态漂白衰减速率明显变缓(图5, 三角).图5 溶解在不同去垢剂中的菠菜Cyt b 6f 在680 nm 探测得到的归一化动力学曲线溶解在DDM(空心圆), β-OG 中(方框)和SDS 中(三角)中的样品3 结论本研究表明, 对于Cyt b 6f, DDM 显然是更合适的去垢剂, 而β-OG 使Chl a 和蛋白质结合的紧密程度下降, 导致Chl a 的光学性质改变, 具体表现为: Cyt b 6f 中Chl a 的荧光产率增强, 强光照射下抗光破坏的能力下降, 单线激发态的寿命延长(~600 ps). 因此, 我们认为有些研究测定的Cyt b 6f 中Chl a 单线激发态较长的寿命(~600 ps), 是因为选用了β-OG 作为去垢剂; Cyt b 6f 中Chl a 的单线激发态寿命应该很短, 约为200 ps. 所以, Cyt b 6f 的抗光氧化机制很可能是Chl a 周边的蛋白质微环境快速猝灭了Chl a 的单线激发态, 从而避免或减少了由Chl a 单线激发态引起的单线态氧的产生.致谢 清华大学生物科学与技术学院公衍道教授在本项研究工作中给予了热情帮助, 谨致谢忱.参 考 文 献1 Wang G C, Zhou B C, Tseng C K. Construction of energy transfermodel of C-phycocyanin and allophycocyanin from Spirulina platensis . Chinese Science Bulletin, 1997, 42: 69—722 王广策, 周百成, 曾呈奎. B-藻红蛋白和R-藻红蛋白γ亚基的分离、特征及其在分子中的空间位置分析. 中国科学C 辑：生命科学, 1998, 28: 36—413 Cramer W A, Black M T, Widger W R, et al. 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