CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞的制作技术
car-t技术原理
car-t技术原理CAR-T技术原理随着癌症的发病率不断增加，治疗癌症的方法也在不断进步。
CAR-T 技术作为一种新型的癌症免疫疗法，近年来备受关注。
它是通过改造患者自身的免疫细胞，使其具有更强的抗癌能力，从而达到治疗癌症的目的。
CAR-T技术的全称是嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cell）技术。
它的原理是将一种特殊的受体引入患者自身的T细胞中，使其能够识别并攻击癌细胞。
这种受体被称为嵌合抗原受体（CAR），它由两个部分组成：外部是能够识别癌细胞的抗原结合区域，内部是能够激活T细胞的信号传导区域。
CAR-T技术的关键步骤包括免疫细胞采集、基因修饰和细胞扩增。
首先，医生会从患者的血液中采集到T细胞，这些T细胞是人体免疫系统中重要的抗癌细胞。
然后，科学家会将CAR基因导入到采集到的T细胞中。
这一步骤通常通过病毒载体实现，将CAR基因导入细胞核，使其能够被T细胞内部所识别并表达。
最后，修饰过的T 细胞会在实验室中进行扩增，使其数量足够多，能够应对体内的癌细胞。
一旦经过扩增，CAR-T细胞就可以被注射到患者体内进行治疗。
CAR-T细胞会通过血液循环到达肿瘤部位，识别并攻击癌细胞。
它的工作原理是当CAR的抗原结合区域与癌细胞表面的特定抗原结合时，会激活T细胞内部的信号传导通路，使T细胞释放出细胞毒素，杀死癌细胞。
这种杀伤机制类似于自然的免疫应答，但CAR-T技术能够加强这一过程，使其更加有效。
CAR-T技术的优势在于其针对性和持久性。
由于CAR是专门设计用于识别癌细胞的抗原，因此CAR-T细胞能够更精确地攻击癌细胞，减少对健康细胞的伤害。
此外，CAR-T细胞具有持久性的效果，一旦注射到患者体内，它们可以在体内存活并持续攻击癌细胞，从而延长治疗效果。
然而，CAR-T技术也存在一些挑战和限制。
首先，CAR-T细胞治疗的成本较高，这主要是由于制备CAR-T细胞的复杂性和昂贵的生产过程。
car-t工作原理
car-t工作原理Car-T（嵌合抗原受体T细胞疗法）是一种新兴的癌症免疫治疗方法，通过改造患者的T细胞，使其能够识别和消灭肿瘤细胞。
它的工作原理可以总结为以下几个步骤：采集T细胞、设计和构建嵌合抗原受体、扩增和激活改造的T细胞、注入到患者体内。
首先，需要采集患者的T细胞。
这通常通过外周血或者肿瘤组织等途径完成。
采集到的T细胞会被送往实验室进行后续处理。
在实验室中，科研人员将设计和构建嵌合抗原受体（CAR）。
CAR 是一种蛋白质分子，由多个部分组装而成，包括外部的抗原结合区域和内部的信号传导区域。
抗原结合区域能够识别特定的肿瘤抗原，而信号传导区域能够激活和增强T细胞的抗肿瘤活性。
当CAR的设计和构建完成后，下一步是将其导入到T细胞内。
为了实现这一点，通常使用病毒载体。
这些病毒载体被改造成可携带CAR 的形式，并且具有足够的感染能力。
当T细胞与携带CAR的病毒载体接触时，病毒会将CAR的遗传信息导入到T细胞内。
这样，T细胞就被改造成拥有特定抗原识别能力的CAR-T细胞。
改造完成后，CAR-T细胞需要经过扩增和激活。
在实验室中，科研人员会提供适当的培养环境和刺激物，使CAR-T细胞能够大量增殖和活化。
这样可以获得大量数量和高度活性的CAR-T细胞。
最后一步是将改造后的CAR-T细胞注入到患者体内。
在注射之前，通常需要对患者进行一些预处理，如化疗或放疗，以减少肿瘤负荷和提高CAR-T细胞的生存率。
一旦注射完成，CAR-T细胞会在体内寻找和识别肿瘤细胞。
通过CAR与肿瘤抗原的结合，CAR-T细胞会释放细胞毒性物质并释放促凋亡信号，从而引发肿瘤细胞的死亡。
除了直接杀伤肿瘤细胞外，CAR-T细胞还具有其他作用。
它可以激活免疫系统中的其他免疫细胞，如自然杀伤细胞和巨噬细胞，以协同作用来清除肿瘤细胞。
此外，CAR-T细胞还具有一定的记忆效应，能够识别和杀伤肿瘤细胞的再现。
总的来说，CAR-T疗法通过改造患者的T细胞，使其能够识别和消灭肿瘤细胞。
CAR-NK细胞治疗的应用与挑战
CAR-NK细胞治疗的应用与挑战CAR-NK细胞疗法（Chimeric Antigen Receptor Natural Killer cells，CAR-NK）是一种新兴的免疫细胞治疗方法，结合了自然杀伤细胞（Natural Killer，NK）与嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor，CAR）技术。
它的出现为癌症及其他疾病的治疗提供了全新的希望。
本文将对CAR-NK的发展、原理、应用、挑战和未来展望进行综述。
1.CAR-NK的发展历程CAR-NK细胞疗法的发展历程可以追溯到对NK细胞在免疫治疗中潜力的早期认识。
自然杀伤细胞（NK细胞）是一类淋巴细胞，具有非特异性杀伤肿瘤细胞和感染细胞的能力，而且不依赖于前期免疫记忆的形成。
由于这些特性，NK细胞成为研究者关注的焦点，希望能够利用它们作为治疗癌症等疾病的手段。
早期的研究表明，NK细胞在控制和清除肿瘤细胞方面起着重要作用。
然而，单独利用自然的NK细胞治疗肿瘤面临着一些限制，包括其在体内生存时间短、活性不稳定以及抗肿瘤效果有限等问题。
为了克服这些限制，研究者们开始探索如何通过基因工程技术来增强NK 细胞的活性和特异性。
随着CAR-T细胞疗法的成功应用，人们开始考虑将CAR技术应用于NK细胞上，从而产生了CAR-NK细胞疗法的概念。
最初的尝试是将CAR基因导入到NK细胞中，使其获得对特定抗原的识别和杀伤能力。
这一理念的提出引发了一系列的研究和实验，旨在探索CAR-NK细胞在肿瘤治疗中的潜力。
随着技术的不断进步和对CAR-NK细胞生物学特性的深入了解，研究者们逐渐克服了许多技术障碍，如CAR设计的优化、细胞扩增和制备技术的改进以及提高CAR-NK细胞活性和持久性等方面。
这些努力逐渐使CAR-NK细胞疗法走向了临床应用阶段。
目前，CAR-NK细胞疗法已经进入了临床试验阶段，并取得了一些初步的成功。
尽管仍然面临着一些挑战，如CAR-NK细胞的制备和扩增技术的进一步改进、细胞存活和持久性的提高以及治疗效果的优化等，但人们对其未来的发展充满了信心。
免疫治疗的新突破CARNK细胞治疗的应用前景
免疫治疗的新突破CARNK细胞治疗的应用前景近年来，免疫治疗作为一种创新的治疗手段迅速发展并引起了广泛关注。
CARNK细胞治疗作为免疫治疗的一种新突破，具有巨大的应用前景。
本文将就CARNK细胞治疗的原理、目前的研究进展和未来的应用前景进行探讨。
1. CARNK细胞治疗的原理CARNK细胞治疗是一种基于CAR-T细胞治疗的改良技术，其原理是通过将CAR-T细胞与NK细胞相结合，形成具有双重攻击能力的细胞。
CAR（嵌合抗原受体）是一种人工合成的受体，能够识别特定的抗原并激活细胞免疫应答。
将CAR引入到NK细胞中，可以增强其攻击肿瘤细胞的能力，同时也提高了治疗的安全性。
2. CARNK细胞治疗的研究进展近年来，CARNK细胞治疗在临床研究中取得了一系列令人振奋的进展。
许多研究显示，CARNK细胞能够有效杀伤各种恶性肿瘤细胞，并且在长期观察中呈现出持续的疗效。
其中，针对血液系统肿瘤的治疗效果较为突出，比如B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病等。
此外，CARNK细胞治疗还显示出在肿瘤免疫逃逸和耐药性方面具有独特的优势。
3. CARNK细胞治疗的应用前景CARNK细胞治疗具有广阔的应用前景。
首先，在临床应用方面，CARNK细胞治疗有望成为一种新的个体化治疗策略，通过调整CAR 的结构和功能，使其更好地适应不同患者的需求，并提高治疗效果。
其次，在抗肿瘤免疫研究中，CARNK细胞治疗还可以为其他免疫疗法提供有力的支持，如联合免疫疗法和肿瘤疫苗。
此外，CARNK细胞治疗还具有扩展应用领域的潜力，可以应用于治疗各种其他免疫相关性疾病，如自身免疫性疾病和传染病等。
总结起来，CARNK细胞治疗作为免疫治疗的一种新突破，在治疗癌症方面具有巨大的应用前景。
通过融合CAR-T细胞和NK细胞的优势，CARNK细胞可以增强肿瘤细胞的攻击能力，并且在临床研究中已经取得了一系列令人振奋的进展。
未来，CARNK细胞治疗有望成为个体化治疗的重要手段，并且为其他免疫疗法的发展提供有力的支持。
car-t技术原理
car-t技术原理CAR-T技术原理随着细胞治疗技术的快速发展，CAR-T技术作为一种新兴的癌症治疗方法备受关注。
CAR-T细胞疗法是一种通过基因改造的T细胞来识别和攻击癌细胞的方法。
本文将从CAR-T技术的原理角度来介绍这一疗法。
我们需要了解CAR-T技术中的几个关键概念。
CAR是Chimeric Antigen Receptor的缩写，意为嵌合抗原受体。
它是一种基因工程改造的受体蛋白，能够使T细胞具有识别和杀伤癌细胞的能力。
T 细胞是一种免疫细胞，具有杀伤感染细胞和肿瘤细胞的功能。
CAR-T技术的基本原理是将CAR基因导入T细胞中，使其表达CAR 蛋白。
CAR蛋白由三个主要部分组成：识别区、连接区和活化区。
识别区是CAR的重要组成部分，它通过与癌细胞表面特异性抗原结合来实现对癌细胞的识别。
连接区连接识别区和活化区，使其能够传递信号。
活化区则包含一系列的信号传导分子，能够激活T细胞，并引发针对癌细胞的免疫反应。
CAR-T技术的具体操作过程可以分为三个主要步骤：采集T细胞、基因改造和细胞治疗。
首先，需要从患者体内采集T细胞。
这些T 细胞会被送往实验室，经过一系列的处理和培养，以增加其数量和活性。
然后，将CAR基因导入这些T细胞中。
通常，这一步骤会使用病毒载体将CAR基因导入T细胞。
一旦T细胞内成功表达CAR蛋白，它们就具备了识别和攻击癌细胞的能力。
最后，经过质检和扩增后的CAR-T细胞会被重新注入患者体内。
这些改造后的T细胞将能够通过CAR识别和杀伤癌细胞，从而达到治疗的效果。
CAR-T技术的原理非常复杂，但它的基本思想是通过改造T细胞使其具备识别和攻击癌细胞的能力。
与传统的放化疗等方法相比，CAR-T技术具有更强的特异性和更高的治疗效果。
然而，CAR-T技术也存在一些挑战和限制，例如患者的免疫反应、细胞扩增和持久性等问题。
因此，未来的研究还需要在这些方面进行进一步的探索和改进。
总结起来，CAR-T技术是一种通过基因改造的T细胞来识别和攻击癌细胞的新兴治疗方法。
kymriah原理
kymriah原理Kymriah（中文名称：卡美莱）是一种通过基因工程技术开发出的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法。
该疗法旨在提供一种针对白血病和淋巴瘤等恶性肿瘤的创新治疗方式。
以下是关于Kymriah原理的详细解释：1. 嵌合抗原受体设计：嵌合抗原受体（CAR）是一种通过基因工程技术将T细胞的T细胞受体（TCR）的外膜域替换为特定抗原识别区域的蛋白质。
Kymriah中的CAR由四个基本组件构成：额外细胞外结构域、连接区、信号传导域以及共刺激域。
额外的细胞外结构域在CAR的外膜上起到特异性识别抗原的作用，连接区将其与细胞内的信号传导和共刺激分子结合在一起。
2. T细胞采集：接下来，从患者的外周血或骨髓中采集患者自己的T细胞。
这些T细胞将被用于生成具有嵌合抗原受体的CAR-T细胞。
3. CAR基因的导入：采集到的T细胞会经过体外培养和增殖，然后使用载体导入具有嵌合抗原受体（CAR）基因。
这个过程称为基因转导。
通过基因转导技术，CAR基因将被导入到T细胞的染色体中，使得T细胞能够表达CAR。
这样，CAR-T细胞就可以在患者体内识别和攻击特定肿瘤抗原。
4. CAR-T细胞的活化和扩增：导入CAR基因的T细胞会继续在体外失活，患者接受化疗以减少系统性疾病负荷，然后重新注入患者体内。
这些CAR-T细胞注入后将被激活，并通过体内扩增进一步增强抗肿瘤效果。
5. 目标抗原识别和攻击：Kymriah的CAR-T细胞具备特异性识别肿瘤细胞的能力。
CAR中的抗原识别结构域能够与肿瘤细胞表面的特定抗原结合。
一旦CAR-T细胞与肿瘤细胞上的抗原结合，信号传导和共刺激域将启动CAR-T细胞对肿瘤细胞的攻击机制。
6. CAR-T细胞的攻击机制：CAR-T细胞通过多种机制攻击肿瘤细胞，包括细胞毒作用、激活自噬和分泌炎症调节因子等。
细胞毒作用是指CAR-T细胞释放细胞毒素，直接杀死癌细胞。
激活自噬则是使癌细胞自行降解和消化，以获得必要的生存物质。
car-nk制备方法
car-nk制备方法【最新版3篇】目录（篇1）1.介绍 CAR-NK 制备方法的背景和重要性2.详述 CAR-NK 制备方法的步骤3.分析 CAR-NK 制备方法的优缺点4.总结 CAR-NK 制备方法的研究进展及未来展望正文（篇1）CAR-NK 制备方法是一种将自然杀伤 (NK) 细胞转化为具有肿瘤杀伤作用的新型免疫疗法。
这种方法通过基因工程技术，将具有识别肿瘤相关抗原的 CAR(嵌合抗原受体) 与 NK 细胞相结合，使 NK 细胞具有更强的肿瘤特异性识别和杀伤能力。
CAR-NK 制备方法在肿瘤免疫治疗领域具有广泛的应用前景，为众多肿瘤患者带来了希望。
CAR-NK 制备方法主要分为以下几个步骤：1.获取 NK 细胞：从患者或捐献者体内分离获得 NK 细胞，一般采用外周血单个核细胞分离方法。
2.CAR 基因设计与构建：根据肿瘤相关抗原的特异性，设计并构建具有相应抗原特异性的 CAR 基因。
3.CAR 基因转导：将构建好的 CAR 基因通过病毒载体等方法转导至NK 细胞中，使 NK 细胞表达 CAR。
4.CAR-NK 细胞扩增与培养：将转导后的 CAR-NK 细胞在体外进行扩增与培养，以获得足够数量的 CAR-NK 细胞用于治疗。
5.CAR-NK 细胞输注：将培养好的 CAR-NK 细胞输注至患者体内，使其在体内发挥肿瘤杀伤作用。
CAR-NK 制备方法具有以下优点：1.高度特异性：CAR-NK 细胞具有针对特定肿瘤相关抗原的高度特异性，可减少对正常细胞的毒副作用。
2.强大的杀伤能力：CAR-NK 细胞具有较强的肿瘤杀伤能力，可弥补NK 细胞在肿瘤免疫治疗中的不足。
3.适应症广泛：CAR-NK 制备方法适用于多种肿瘤类型，为不同类型的肿瘤患者提供了可能性。
然而，CAR-NK 制备方法也存在一些缺点，如病毒载体的安全性问题、CAR-NK 细胞的制备成本较高以及在体内持续时间较短等。
近年来，随着 CAR-NK 制备方法的研究不断深入，越来越多的研究者开始关注这一领域。
car-t制备工艺和质控
car-t制备工艺和质控CAR-T细胞治疗是一种新兴的癌症治疗方法，它利用改造的T细胞来攻击肿瘤细胞。
因此，CAR-T的制备工艺和质控非常重要，下面将详细介绍CAR-T制备工艺以及质控的关键点。
一、CAR-T制备工艺1. 采集T细胞：首先需要从患者体内采集T细胞，常用的方法是通过外周血进行采集。
采集后的T细胞需要进行分离和纯化，以获取高纯度的T细胞。
2. 载体构建：在制备CAR-T细胞之前，需要构建CAR（嵌合抗原受体）的载体。
CAR通常由单链抗体的外部结构域、连接区和T细胞活化域组成。
这个载体通常由质粒构建，可以通过基因工程技术获得。
3. 载体转染：将构建好的CAR载体导入T细胞中，可以使用病毒转染（如逆转录病毒或整合素病毒）或非病毒转染（如电穿孔法）等方法。
转染后，CAR会被整合进T细胞的基因组中。
4. CAR-T细胞扩增：转染后的T细胞需要进行体外扩增，以获取足够数量的CAR-T细胞。
通常使用培养基和适当的生长因子来促进细胞增殖。
5. 质量控制：制备完CAR-T细胞后，需要进行质量控制以确保其安全有效。
常用的质控指标包括细胞活性、纯度、转导效率和细胞存活率等。
二、CAR-T质控1. 细胞活性检测：细胞活性是CAR-T治疗的关键指标之一。
常用的方法包括流式细胞术和细胞增殖试验。
流式细胞术可以通过检测CAR表达和细胞表面标记物来评估细胞活性，而细胞增殖试验可以评估细胞的增殖和存活能力。
2. 纯度检测：CAR-T细胞的纯度直接影响治疗效果。
常用的方法包括流式细胞术和聚合酶链反应（PCR）。
流式细胞术可以通过检测细胞表面标记物来评估CAR-T细胞的纯度，而PCR可以检测CAR基因的存在来评估细胞的纯度。
3. 转导效率检测：转导效率是评估CAR-T细胞制备工艺的重要指标之一。
常用的方法包括流式细胞术和定量PCR。
流式细胞术可以通过检测CAR表达来评估转导效率，而定量PCR可以检测CAR基因的拷贝数来评估转导效率。
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本技术提供提供一种CAR嵌合抗原受体序列，包括单链抗体结构、胞外区结构、跨膜区结构和胞内区结构；胞外区结构的蛋白多肽序列选自CD8α蛋白多肽序列的片段；跨膜区结构的蛋白多肽序列选自NKG2D蛋白多肽序列的片段；胞内区结构包括2B4胞内区结构或/和CD3ζ胞内区结构，2B4胞内区结构的蛋白多肽序列选自2B4蛋白多肽序列的片段，CD3ζ胞内区结构的蛋白多肽序列选自CD3ζ蛋白多肽序列的片段。
本技术提供的CAR嵌合抗原受体序列可有效地激活免疫功能细胞，且能够使嵌合其的免疫功能细胞高效地识别恶性肿瘤细胞。
权利要求书1.一种CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：包括单链抗体结构、胞外区结构、跨膜区结构和胞内区结构；所述胞外区结构的蛋白多肽序列选自CD8α蛋白多肽序列的片段；所述跨膜区结构的蛋白多肽序列选自NKG2D蛋白多肽序列的片段；所述胞内区结构包括2B4胞内区结构或/和CD3ζ胞内区结构，所述2B4胞内区结构的蛋白多肽序列选自2B4蛋白多肽序列的片段，所述CD3ζ胞内区结构的蛋白多肽序列选自CD3ζ蛋白多肽序列的片段。
2.如权利要求1所述CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：所述胞内区结构包括所述2B4胞内区结构和所述CD3ζ胞内区结构，所述跨膜区结构、所述2B4胞内区结构和所述CD3ζ胞内区结构依次串联。
3.如权利要求2所述CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：所述胞外区结构包括第一胞外区结构和第二胞外区结构；所述第一胞外区结构、所述单链抗体结构、所述第二胞外区结构、所述跨膜区结构、所述2B4胞内区结构和所述CD3ζ胞内区结构依次串联；所述单链抗体结构为由SEQ ID NO.7编码的抗间皮蛋白scFv。
4.如权利要求3所述CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：其蛋白多肽序列为SEQIDNO.10。
5.如权利要求2所述CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：所述胞外区结构、所述单链抗体结构、所述跨膜区结构、所述2B4胞内区结构和所述CD3ζ胞内区结构依次串联；所述单链抗体结构为由SEQ ID NO.12编码的抗表皮生长因子受体scFv。
6.如权利要求5所述CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：其蛋白多肽序列为SEQIDNO.14。
7.一种CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：其蛋白多肽序列与如权利要求4所述CAR嵌合抗原受体系列的蛋白序列具有不低于80％的相似性。
8.一种CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：其蛋白多肽序列与如权利要求6所述CAR嵌合抗原受体系列的蛋白序列具有不低于80％的相似性。
9.一种CAR-NK细胞，其特征在于：其AAVS1位点嵌合了包括ER1a启动子和如权利要求1-8任一项所述CAR嵌合抗原受体序列的序列载体；在所述序列载体中，所述CAR嵌合抗原受体序列位于所述ER1a启动子的下游。
10.如权利要求9所述CAR-NK细胞在制备抗恶性肿瘤药物中的应用。
技术说明书一种CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞技术领域本技术属于细胞免疫治疗领域，具体地，涉及一种CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞。
背景技术恶性肿瘤是危害人类健康的主要重大疾病之一。
传统肿瘤治疗方式如手术、放疗、化疗是近几十年来用于肿瘤治疗的主要策略，但是，病人会对药物及放疗治疗产生抗性，致使高频率的肿瘤患者复发。
肿瘤细胞治疗，因其靶向性、效果显著、几无副作用等优点而得到了极大关注，逐步成为肿瘤综合治疗中的一个重要手段，被业界称为肿瘤的绿色疗法，也是当前肿瘤治疗基础研究和临床应用的热点与发展方向。
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)发挥杀伤活性不需要预先刺激，在基于细胞治疗的人类恶性肿瘤治疗中具有很大潜力。
NK细胞能够在T，B细胞不存在的情况下自发的裂解肿瘤细胞。
NK细胞与细胞毒性T细胞有很多共同特征，包括共同的前体细胞、细胞表面受体分子的重排以及颗粒酶依赖的杀伤机制。
然而，NK细胞也具有独特性，因其杀伤不需预先刺激以及杀伤肿瘤细胞没有MHC限制性。
这让NK细胞在过继肿瘤细胞免疫治疗中应用广泛，其中，过继细胞免疫治疗指的是将外源改造过的细胞回输给病人用于临床应用。
在体外分离、扩增过的NK细胞可以用于自体或异体治疗。
然而，从单个供体血液中白细胞中去除T细胞来得到NK细胞的方法获得NK细胞产量不稳定，而且数目不足以达到回输标准。
另外，NK细胞在体外非常难以培养，远远达不到细胞免疫疗法的要求。
而且，肿瘤病人NK细胞很多本身已经无法正常发挥正常功能。
即使在体外培养，也需要加入很多激活物(如IL-2，IL-12，IL-5，IL-18等)，用来增强NK细胞对肿瘤细胞反应。
虽然，目前有很多方法可以制备NK细胞，但是NK细胞的分化效率低，使得NK细胞药物的价格高昂，杀灭活性难以控制，不利于规模化生产和应用。
基于此，NK细胞的体外激活和扩增对NK细胞在肿瘤细胞免疫治疗中的进一步推广应用具有不可忽视的现实意义。
肿瘤嵌合抗原受体(CAR)疗法，指的是一种通过嵌合抗原受体在免疫细胞上治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。
通常，CAR通过基因工程技术，将免疫细胞(T细胞、NK细胞)激活，并装上定位导航装置CAR，将普通的T细胞、NK细胞对应地重组为CAR-T细胞、CAR-NK细胞，CAR-T细胞、CAR-NK细胞能够利用其嵌合的CAR，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，能够高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。
另外，将定位敲入CAR载体后的免疫细胞移植回原患者身体内，可避开自身免疫系统的攻击难题。
技术内容本技术的目的在于提供一种CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞，以有效激活免疫功能细胞并使免疫功能细胞高效地杀灭肿瘤细胞。
根据本技术的一个方面，提供一种CAR嵌合抗原受体序列，包括单链抗体结构、胞外区结构、跨膜区结构和胞内区结构；胞外区结构的蛋白多肽序列选自CD8α蛋白多肽序列的片段；跨膜区结构的蛋白多肽序列选自NKG2D蛋白多肽序列的片段；胞内区结构包括2B4胞内区结构或/和CD3ζ胞内区结构，2B4胞内区结构的蛋白多肽序列选自2B4蛋白多肽序列的片段，CD3ζ胞内区结构的蛋白多肽序列选自CD3ζ蛋白多肽序列的片段。
优选地，胞内区结构包括2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构，跨膜区结构、2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构依次串联。
优选地，胞外区结构包括第一胞外区结构和第二胞外区结构；第一胞外区结构、单链抗体结构、第二胞外区结构、跨膜区结构、2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构依次串联；单链抗体结构为由SEQ ID NO.7编码的抗间皮蛋白scFv。
优选地，其蛋白多肽序列为SEQ ID NO.10。
优选地，胞外区结构、单链抗体结构、跨膜区结构、2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构依次串联；单链抗体结构为由SEQ ID NO.12编码的抗表皮生长因子受体scFv。
优选地，其蛋白多肽序列为SEQ ID NO.14。
根据本技术的一个方面，提供一种CAR嵌合抗原受体序列，其蛋白多肽序列与上述CAR嵌合抗原受体系列的蛋白序列具有不低于80％的相似性。
根据本技术的另一个方面，提供一种CAR-NK细胞，其AAVS1位点嵌合了包括ER1a启动子和上述CAR嵌合抗原受体序列的序列载体；在序列载体中，CAR嵌合抗原受体序列位于ER1a启动子的下游。
根据本技术的另一个方面，提供上CAR-NK细胞在制备抗恶性肿瘤药物中的应用。
优选地，抗恶性肿瘤药物为抗恶性间皮细胞瘤药物。
本技术提供的CAR嵌合抗原受体序列可有效地激活免疫功能细胞，且能够使嵌合其的免疫功能细胞高效地识别恶性肿瘤细胞。
可选地，本技术提供的CAR嵌合抗原受体序列采用抗间皮蛋白scFv或抗表皮生长因子受体scFv作为其中所包含的单链抗体结构，使嵌合其的免疫功能细胞能够高效地识别恶性间皮细胞瘤细胞。
将包括上述CAR嵌合抗原受体序列的序列载体嵌合在在NK细胞的AAVS1位点，定位敲入位置明确，不会干扰宿主细胞的其他基因，也不会因转基因导致宿主细胞恶变。
同时，本技术在上述CAR嵌合抗原受体序列的上游设置能够均一地在各种细胞中高表达的EF1a启动子，可成功高效的获得具有生物学活性及功能的CAR-NK细胞，且让干细胞向NK细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。
可选地，本技术采用的序列载体可以包括IRES序列，可以使在对mRNA进行翻译以及与外源cDNA融合的时候不依赖于5‘帽结构。
可选地，本技术采用的序列载体可以包括T2A序列，使得利用序列载体生成的整条mRNA可以自剪切成两个独立的蛋白。
可选地，本技术采用的序列载体可以包括GFP序列或Puro序列，从而可以相应地利用荧光分析或药物筛选识别、检测本技术构建的CAR-NK细胞。
综上，本技术提供的CAR-NK细胞具有稳定高效、安全性高的优点，适合大规模生产及应用。
附图说明图1为实施例1构建的定位敲入CAR-NK细胞AAVS1位点的序列载体示意图；图2为实施例2的处理I在注射CAR-NK细胞I前的恶性间皮细胞瘤细胞显微镜观察图；图3为实施例2的处理I在注射CAR-NK细胞I 1小时后的恶性间皮细胞瘤细胞显微镜观察图；图4为实施例2的处理I在注射CAR-NK细胞I 3小时后的恶性间皮细胞瘤细胞显微镜观察图；图5为实施例2的处理I在注射CAR-NK细胞I 5小时后的恶性间皮细胞瘤细胞显微镜观察图；图6为实施例2的处理I在注射CAR-NK细胞I 7小时后的恶性间皮细胞瘤细胞显微镜观察图。
具体实施方式为了使本技术领域的人员更好地理解本技术方案，下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。
下述实施例中使用的术语“嵌合”指的是在体外培养时，在控制条件下，通过非特化的CAR获得特化细胞(例如NK细胞)的生物过程。
分化受细胞基因与细胞外的物理和化学条件的相互作用的控制，通常经由涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路。
下述实施例中使用的术语“约”，除非明确地指出或从上下文明显得到，应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准差内。
约可被理解为在规定值的10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％或0.01％内。
实施例1本实施例涉及的CAR嵌合抗原受体序列(CAR序列)包括CAR-A序列、CAR-AA序列和CAR-B 序列。
1.CAR-AA序列的构建1.1设计编码CAR-A序列的核苷酸序列CAR-A序列包括胞外区结构、单链抗体结构、跨膜区结构和胞内区结构。