课件--第六章 毛细管电泳仪

第六章 毛细管电泳仪 * 绪言 1、概念：在极细的毛细管内所进行的各种形式的电泳，称为毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)。 2、类型：有毛细管区带电泳，胶束电动力学毛细管色谱、毛细管筛分电泳、毛细管等电聚焦电泳、毛细管等速电泳等。 3、毛细管电泳特点： (1)高效、快速、微量、可全部自动化。 (2)与高效液相色谱(HPLC)相比，毛细管电泳(CE)成本低，选择性大，且几乎不消耗溶剂。 (3)散热效率高，分离质量好。 (4)灵敏度和分辨率高，操作简便，污染小，应用范围广。 4、历史发展： 1967年：最先在3mm直径毛细管中作自由溶液的区带电泳。 1974年：用200～500m内径的毛细管作电泳分离。 1981年：用75m内径玻璃毛细管柱，加30kV电压实现电泳。 1984年：引入了胶束毛细管电动力学色谱的方法。 1987年：实现了毛细管等电聚焦及毛细管凝胶电泳。 1988年：首次利用CE作微量物质提取。并把激光引入CE检测器，大大提高了检测灵敏度。

第一节 毛细管电泳的工作原理 一、带电粒子的迁移 (一) 偶电层和Zeta势 1、偶电层： 固体与液体接触时，若固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力会使其周围液体带有相反电荷，即在液-固界面形成偶电层，两者之间存在电位差，叫Zeta势。 * 毛细管电泳中，带电粒子表面和毛细管壁表面都有偶电层。 2、粒子的Zeta势： 电解质中的任何带电粒子被异性电荷的离子所包围，部分异性离子被吸附到粒子上，部分则游离在附近。被吸附的“固定”离子有一个切平面，和带电粒子间的电势差，称为粒子的Zeta势。 3、管壁的偶电层和Zeta势： (1)偶电层：毛细管一般为石英管，内表面为硅胶表面并带负电(pH>3) 。则管子中溶液的正离子因受静电引力就会聚集紧贴在表面附近，从而形成偶电层。 (2)Stern层：偶电层中由于吸附而紧贴在表面的离子叫Stern层；其它可移动的游离离子为扩散层，游离离子的电荷密度随与表面距离增大而急剧减小。 (3)管壁的Zeta势：Stem层和管壁表面间的电势差称为管壁的Zeta势。 * 偶电层的厚度： 管壁的Zeta势随与管壁表面距离增大而按指数规律衰减，使其衰减一个指数单位所需的距离叫偶电层的厚度。

(二) 恒定场强下带电粒子的迁移 1、带电粒子移动速度vep：电泳时，vep为 vep=epE 式中ep为带电粒子的迁移率，E为场强。 2、粒子的迁移率ep：在充满自由溶液的开口管中，ep为 ep=i/4 式中是流体的介电常量，是介质的粘度。i是粒子的zeta电势。 3、影响i的因素： (1)表面电荷越大，i越大。 (2)如果电荷给定，则质量越大，i越小。 (3)对非胶体粒子，i近似正比于(Z/M)2/3。(M、Z分别是粒子的分子量和净电荷)

(三) 电渗 1、概念：指高电场下由偶电层中水合阳离子或质子所引起的流体朝负极方向运动的现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF）。 2、电渗的迁移率： eo=w/4 其中w为管壁的Zeta势。 * 电渗流的速度： veo=eoE=wE/4 上式与电泳的迁移率和电泳移动速度类似。 3、影响电渗因素：管壁的Zeta势越大，偶电层越薄，介质粘度越小，电渗流速就越大。 通常电渗流速是电泳流速的5～7倍。 4、带电粒子运动速度v和迁移率 ：因毛细管内同时存在着电泳和电渗，不考虑它们的相互作用，则 v=vep+veo=(ep+eo)E 式中 Ld是毛细管从进样口到检测器的距离， tr是粒子通过该距离所用的时间， Lt是毛细管柱的全长， U是电压，E=U/Lt。 5、粒子移动特点：因电渗流从阳极流向阴极，所以 正离子：运动方向和电渗一致，故它最先流出毛细管。 中性粒子：其电泳速度为“零”，故它随电渗而移动。 负离子：运动方向和电渗相反，故当 电渗流速大于电泳流速时，它在中性粒子之后流出毛细管； 电渗流速小于电泳流速时，则它将无法流出。 6、控制电渗流的不同方法：

(四) 梯度场强下带电粒子的迁移 * 恒定场强下的毛细管电泳，某组分区带的移动速度： dx/dt=E 式中为该组分在场强E下的迁移率，是指电渗和电泳两者移动速度的代数和。 * 梯度场强下的毛细管电泳，因场强是时间的函数，即： E=E(t) 故在一段时间内某一组分在管柱内移动的距离为：

UtLLEvrtdeoep/

21)(ttdttEx

二、影响谱带展宽的因素 (一) 几个概念 1、柱效和塔板高度 因CE和色谱技术很相似，故电泳谱带展宽可直接沿用色谱的塔片高度和柱效的概念作为指标。 * 理论塔扳数N：指虚拟的塔板的数量。即把色谱柱近似看成精馏塔，以虚拟的塔板数的多少来衡量分离效率的高低。 N可从分离结果的色谱图直接计算，即： N=5.54(t/W)2 式中 t称为保留时间，即流出曲线最高点所对应的时间； W叫半峰宽，即峰高一半处的宽度。 * 单位塔板的高度：H=L/N 这里L是柱长。 2、流型： 电渗是流体相对于带电管壁的移动，即带电的外壳离子把电渗力传递进去使流体移动。当电渗力与粘滞力平衡时，整个流体像一个塞子一样匀速前进，整个流型呈扁平型的塞子流(谱带展宽很小)。这是CE的理想状态。 * 直径小于200m的毛细管中，这种流型不受管径的影响。 * 在这种流型电泳中，反映柱效高低的塔板数为： N=vLd/2D=ELd/2D 式中v和为带电粒子的运动速度和迁移率， Ld为进样口到检测器的距离， D为溶质的扩散系数， E为场强。

(二) 影响谱带展宽的原因：有两类。 ①是来源于溶液和溶质本身，如自热、扩散和吸附。 ②是来源于系统，如进样和检测等。 1、自热 (1) 电解质溶液在高电场下会产生焦耳热，散热过程中，在毛细管内形成径向温度梯度（中心温度高），破坏了扁平塞子流型，导致谱带展宽。 (2) 管径大，电阻小，电流大，产生焦耳热多，且不易散热。 (3) 抑制焦耳热和温度梯度的方法：见下表。 2、扩散和吸附 (1) 扩散：是物质分子由高浓度区域自发迁移到低浓度区域的输运过程。扩散会引起谱带的展宽。 扩散系数D小的物质，展宽程度较小。 (2) 吸附：溶质与毛细管壁间存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽。 * 吸附原因： ①是阳离子溶质和带负电管壁的离子相互作用。 ②是存在疏水相互作用。 蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。 * 特点：细内径毛细管柱，有利于散热，但比表面积大(柱内表面积和体积之比)会使吸附增加，引起组分谱带的展宽也越大，故须尽可能抑制。 第二节 毛细管电泳仪基本结构 * 由高压电源、毛细管柱、检测器，两个缓冲液槽，及记录装置组成。 记录装置可为记录仪、积分仪，或是有控制功能的计算机工作站。 CE的分离过程是在毛细管内完成的，故毛细管是核心部件，下面就毛细管柱的尺寸、形状和材料作介绍。

一、毛细管柱： 一般为圆管型。应是化学和电惰性的，可透光，有一定柔性，易于弯曲。 1、材料： (1)聚四氟乙烯：可透紫外光，电渗很弱。缺点是管子内径不均，对样品有吸附，热传导差等。 (2)玻璃：电渗最强，但有杂质。 (3)石英：最常用，分天然和人造两类，基本成分是二氧化硅。 2、内径： 内径140m以下散热较好，目前使用的多在25～75m。 * 细管柱优点：(1)可减小电流，即减少自热。 (2)散热快，可保持电渗流流型的扁平性及分离的高效。 缺点：(1)不利于抑制吸附。 (2)进样、检测和清洗困难。 3、长度： 由塔板数公式N=ELd/2D知： (1) 场强恒定时，塔板数与柱长成正比。但柱长不能无限增加，因要使场强恒定，柱两端须增加电压。 (2) 电压恒定时，柱长增加，可减少自热。但会降低场强，增加分析时间。 * 常用柱长约30cm。 4、管壁厚度： 壁厚有两部分，包括石英本身和外面的涂层(热导率很低的聚酰亚胺)。 通常有两种规格，厚壁的石英管外径375m，薄壁的外径150m。一般厚壁管可改善散热。

二、检测器： 有紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器、电化学检测器、拉曼光谱检测器等；前两种使用最广。 (一)紫外检测器： 1、原理：入射紫外光通过样品时，被吸收的多少符合朗伯-比耳定律。 检测点在靠近末端的管柱上，检测点管子的外涂层要烧掉。 2 、例子：如图为HPE-100型紫外检测器原理。样品光6和参比光7相对比，可知样品吸收了多少紫外光。 3、三种紫外检测方法 ①固定波长：光源为低紫外氘灯，用滤光片获固定波长的光。 ②可变波长：光源为氘灯或钨灯，用单色器(棱镜或光栅)获连续可调波长的光。 ③快速扫描：有两类，其一用线性二极管阵列装置快速捕获紫外光，另一则利用硅光电倍增