菠萝蛋白酶的提取实验报告

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定

12食安2班陈志廉

摘要

本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。关键词

菠萝蛋白酶纯化酶活性

前言

菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。

在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。

在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。

菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。

1实验材料与仪器

1.1实验材料与试剂

新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250

1.2实验仪器

722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；

TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；

D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；

DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；

可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；

AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；

BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；

DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；

HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司

2实验方法

2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取

称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。

2．2盐析

根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后，酶蛋白沉淀析出，4°C3000rpm离心6min，收集沉淀，加入0.1mo1/L pH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。

2．3透析

将溶解液装入2.5cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液

放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。

2．4酶活力测定方法

取4支试管，设置1支为实验对照，3支为平行样品。取0.1mL 酶液，加入0.9mL 激活剂，37℃预热10min ，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL ，准确反应10min ，加入10%三氯乙酸3mL 反应终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。离心（3000r/min ，5min ）或过滤，清液于280nm 波长下测定光吸收值。酶活单位定义：在上述条件下，每10min 增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U ）。

2.5蛋白质含量测定方法

2.5.1标准曲线的绘制

0~1000μg/mL 标准曲线的绘制：另取6支试管编号，按下表加入试剂。管号

1234561000μg/mL 牛血清白蛋白（mL ）

蒸馏水（mL ）

蛋白质浓度（μg/mL ）01.000.20.82000.40.64000.60.8 1.00.40.206008001000

得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL ，准确吸取各管溶液0.lmL ，加入5ml 考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min ，测定595nm 吸光值，绘制0-1000μg/mL 标准曲线。

2.5.2样品的测定

准确吸取样品溶液0.1mL 放入具塞刻度试管中，与步骤（1）操作相同，测得样品的光吸收值A595nm 。

3实验结果与分析

3．1蛋白质含量计算

由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（μg/mL ），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。

样品蛋白含量(μg/g 鲜重)＝────────────────────────────────────────

3．2酶活力计算酶液活力（U/mL ）=×稀释倍数

A 280nm

0.001×0.1查出的蛋白提取液浓度（μg/mL）×定容体积(mL)样品重量(g)

3．3酶比活的计算

酶比活（U/mg·蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量

3．4酶纯化过程中回收率计算

回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100

=〔（纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100 3．5酶纯化倍数的计算

纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力

3．6实验结果

3.6.1蛋白质含量

样品蛋白含量=758.2309μg/g（鲜重）

3.6.2酶活力