菠萝蛋白酶的提取实验报告
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶是一种有机物，也称为溶菌酶或蛋白水解酶。
它的特点是可以分解蛋白质，具有较强的酸性和碱性环境适应能力，因此，广泛应用于医疗、食品、化妆品等领域中。
从菠萝中提取菠萝蛋白酶是一项艰巨的任务。
以下是一些步骤：第一步是采集新鲜的菠萝果肉。
必须选用成熟度好的金丝菠萝果肉。
应选择外皮金黄色、果肉红黄相间的菠萝果肉。
第二步是制备浸出液。
将新鲜的菠萝果肉去皮、去核，切成小块，加入适量的水，搅拌并煮沸，经过静置、过滤，即可得到浸出液。
第三步是提取菠萝蛋白酶。
将制备好的浸出液冷藏，待其沉淀，将上层的冰冷水慢慢倒出，留下沉淀。
然后，在沉淀中加入适量的酸性酶解剂，轻轻摇晃，放置几小时。
第四步是酶活测定。
将提取的菠萝蛋白酶放在适宜的酶活测定条件下，如适宜的温度和酸碱度等，测定其活性或浓度。
以上是从菠萝中提取菠萝蛋白酶的一些步骤。
菠萝蛋白酶的应用范围广泛，可用于肉制品、啤酒、乳制品、水产品等食品中。
同时，它还能被用于医疗和化妆品领域，例如用于抗肿瘤、消炎、增加皮肤弹性等。
因此，菠萝蛋白酶的提取十分重要，细节决定了酶的纯度和活性，也影响到菠萝蛋白酶在不同领域中的应用。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取一．实验目的:1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性；2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。
二．实验原理：菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。
主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。
其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。
高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。
有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。
本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是一种有发展的方法。
在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,所使用的锌离子对酶有激活作用,乙二胺四乙酸是一种螯合物,可有效地螯合原料中某些重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则具有还原性,分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以EDTA 和L2半胱氨酸组合,效果最佳。
单宁用量多少会直接影响酶产量,一般范围0. 15 %～0. 25 %的浓度。
采用Folin-酚法测定蛋白酶含量，发生双缩脲反应的蛋白中酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色，在650nm和66onm处有最大吸收值。
Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取一、实验目的：1、了解菠萝蛋白酶的提取和纯化工艺2、优化和加深熟悉菠萝蛋白酶提取技术二、实验原理：菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000 ，等电点为9.55 。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
产品已被广泛应用于食品、医药等行业。
结果表明。
提取菠萝中菠萝蛋白酶最佳提取工艺条件是添加单宁溶液的浓度为0．2％，提取时最适pH值为6．5～8．5左右，而最适提取温度为60℃。
菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
三、实验步骤操作要点：菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。
上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。
虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。
离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml，搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
菠萝中蛋白酶的提取研究
烬８０ 髓６０
４０ ２０
２
口Ｈ值 田ｌ 不周ｐＨ值环境对菠萝蛋白酶活力的影响
２．２ ｐＨ值对菠萝中的菠萝蛋白酶活力的影响 虽然菠萝的ｐＨ值为３．５左右，但菠萝蛋白酶
的最适ｐＨ值并不一定是３．５，酶活性的测定应在最 适ｐＨ值下进行。取菠萝汁加水稀释，分装于７支试 管中，分别用乳酸或ＮａＯＨ溶液调ｐＨ成ｐＨｌ．７，测 定各ｐＨ下的蛋白酶活力，即可得到ｐＨ对酶活性 的影响结果，见图２。
采用正交实验,运用盐析法从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶,对菠萝蛋白酶的提取工艺及其影响因素进行了研究,并对提取后得到的菠萝蛋白酶进行测定.
5.期刊论文 李兴.林哲甫 某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响 -药物生物技术2001,8(6)
当温度恒定时A,菠萝中菠萝蛋白酶的热失活过程遵循一级蜕变规律:d[E]/dt=-Kd.t,失活半寿期是常数,可以用作衡量菠萝蛋白酶热稳定性的指标.某 些羧酸盐和金属离子能明显延长菠萝蛋白酶在较高温度下的半寿期.这些物质的稳定化作用可能是由于它们影响了溶剂结构和疏水相互作用,从而维护了 酶分子的活性三维构象的结果.
将菠萝肉直接捣碎，用４００目的分样筛过滤， 滤汁测定酶活备用。分别向菠萝皮汁和菠萝肉汁中 加入适量的９５％食用酒精，静置２０ｍｉｎ后，在 ２０００ｒｐｍ下离心分离１５ｍｉｎ。收集沉淀，干燥后即为 菠萝蛋白酶。 １．４测定方法 １．４．１菠萝蛋白酶测定方法刚 １．４．２糖度测定方法使用糖度计测定 １．４．３酸度测定方法使用精密ｐＨ计测定
２结果与讨论 ２．１菠萝的成熟度对果实ｐＨ值的影响
菠萝成熟度不同，含糖萤不同，口感风味不同， 其果实的ｐＨ值有所不同稍有差别，其中菠萝蛋白 酶的含量必定有所差异，研究中对市场上的不同成 熟度的菠萝进行了测定，结果觅表ｌ。 表１菠萝成熟度（以糖度表示）对其ｐＨ值的影响
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取摘要：，运用盐析法从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶，对菠萝蛋白酶的提取工艺及其影响因素进行了研究，并对提取后得到的菠萝蛋白酶进行测定。
关键词：菠萝皮，菠萝蛋白酶，白陶土吸附，盐析法一目的要求：学习盐析法提取菠萝蛋白酶的方法二实验原理菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称, 主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同, 分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。
物理性质：白色至浅棕黄色无定形粉末。
溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
是一种糖蛋白, 一般提取用的酶源是凤梨，但是价格较贵。
而用菠萝皮，不但可以减少资源的浪费，降低费用，又能减少环境的污染。
蛋白质在水溶液中的溶解度由蛋白质周围。
集聚而沉淀（实验书第3页）盐析法提取菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，是一种分子量为33000u的蛋白质，硫酸铵是强电解质，有强烈的水化作用，可破坏蛋白质颗粒表面的水化膜，并能中和蛋白质颗粒所带的电荷，使蛋白质在溶液中凝聚而析出但只有达到蛋白质等电点时，其才易于沉淀对于菠萝蛋白酶来说，使用盐析法提取是比较理想的一种方法，也使用得最广泛。
其基本原理是：因不同的蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同而能分离。
此法简便、安全白色至浅棕黄色无定形粉末。
溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
属糖蛋白。
三实验材料1试剂70%-80%成熟度的无刺卡因品种菠萝皮20g 高岭土化学纯品(用于作为吸附剂)、95%乙醇无水乙醇碳酸钠饱和溶液硫酸铵粉末14% NaCl溶液0.05%的苯甲酸钠(作为防腐剂)2实验仪器天平，砝码一套100ml量筒一个，50ml烧杯4个，滴管，玻璃棒，离心管2支高速组织捣碎机低速离心机一台四实验方法（1）滤液制备以全班为单位，选取干净的菠萝皮160g，除杂，在清水中漂洗三次，沥干，放入冰箱4℃冷冻备用-------用不锈钢剪刀将菠萝皮剪成碎片，放入高速组织捣碎机中，制备匀浆，打碎后的匀浆用纱布过滤，并150ml 95%乙醇进行第二次浸提、过滤合并两次滤液,滤液添加lml0.05%的苯甲酸钠，实验两人一组，每组取10ml左右于50ml小烧杯中（2）吸附、洗脱滤液置于冰水浴中，不断搅拌，加入汁液量 4%的白陶土搅拌20min，在10℃吸附15~20min ，于冰箱中4℃静置过夜，次日清晨虹吸除去上清液，留下湿陶土，加入冰冷的碳酸钠饱和液调节 PH6.5~7，再加入吸附物重50%的硫酸铵粉末，于冰水浴中振摇 40min进行洗脱，然后压滤，弃去杂物，收集洗脱滤液(3) 待测酶制备将上述洗脱液分装入2支离心管中，每两管天平平衡，3000转离心20min，用吸管吸取下层清液弃去，加入等体积14%NaCl沉淀（盐析），5min后2000r/min 离心10min，弃上清液，用95%乙醇沉淀洗涤一次，2000转离心10min，弃去上清液，用用无水乙醇沉淀洗涤一次，2000转离心10min，弃去上清液，用保鲜膜封口，膜上扎5~10个小孔，放入真空干燥器中干燥。
[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因
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[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因菠萝蛋白酶提取一、实验目的：1、了解菠萝蛋白酶的提取和纯化工艺2、优化和加深熟悉菠萝蛋白酶提取二、实验原理：菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
其外观为浅灰色粉末状，分子量为 33000 ，等电点为 9.55 。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
产品已被广泛应用于食品、医药等行业。
结果表明。
提取菠萝中菠萝蛋白酶最佳提取工艺条件是添加单宁溶液的浓度为0．2％，提取时最适pH值为6．5～8．5左右，而最适提取温度为60℃。
菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
三、实验步骤操作要点：菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。
上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。
虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。
离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml，搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶是一种常见的蛋白酶，它可以在菠萝中找到。
菠萝蛋白酶可以分解蛋白质，因此在食品、医药和日化等行业中有广泛的应用。
提取菠萝蛋白酶的方法有很多种，其中最常用的是浸提法和萃取法。
浸提法是将菠萝切碎，放入含有酸性物质的溶液中浸泡，使菠萝蛋白酶释放出来。
萃取法则是利用有机溶剂将菠萝中的菠萝蛋白酶提取出来。
提取菠萝蛋白酶后，可以通过一系列的分离纯化步骤来获得高纯度的菠萝蛋白酶。
这些步骤包括超滤、离子交换层析和凝胶过滤等。
除了用于医药和食品工业中，菠萝蛋白酶还可以用于日常生活中，例如在洗涤剂中添加菠萝蛋白酶可以去除衣物表面的蛋白质污渍，同时不会损伤衣物。
因此，提取菠萝蛋白酶对于提高生活质量和促进工业发展来说都具有重要意义。
- 1 -。
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。
2、学习酶活力测定的方法。
3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。
4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。
5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。
二、实验原理菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
分子量为33 000 , 等电点为，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。
对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。
2、本实验采用离子交换技术纯化菠萝蛋白酶。
与化学方法相比，它分离条件温和，不引起分子结构的变化。
它用于纯化菠萝蛋白酶的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件。
3、菠萝蛋白酶活性单位的定义：一个酶活力单位（U）定义为特定条件下[，(37±1℃)]酶作用于干酪素底物1min产生1μg酪氨酸所需的酶量。
菠萝蛋白酶将酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275 nm处有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度计(275 nm)测定溶液中所含肽的数量。
菠萝蛋白酶酶活计算公式参照何铁剑的方法 [91]。
每毫升酶液活性单位（U/ml）=A-A0/Aw×M 标×V/t×样品稀释倍数/供测体积式中：( A - A0) 为275nm 波长下待测酶液与对照的光密度差值；Aw 指以水为对照，275nm 波长下50μg/mL 标准酪氨酸光密度值；M 标为标准酪氨酸溶液浓度；V 为反应体系总体积（mL）；t 为反应时间10min。
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菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2．2盐析根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后，酶蛋白沉淀析出，4°C3000rpm离心6min，收集沉淀，加入0.1mo1/L pH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。
2．3透析将溶解液装入2.5cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。
若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2．4酶活力测定方法取4支试管，设置1支为实验对照，3支为平行样品。
取0.1mL 酶液，加入0.9mL 激活剂，37℃预热10min ，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL ，准确反应10min ，加入10%三氯乙酸3mL 反应终止酶反应。
对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。
离心（3000r/min ，5min ）或过滤，清液于280nm 波长下测定光吸收值。
酶活单位定义：在上述条件下，每10min 增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U ）。
2.5蛋白质含量测定方法2.5.1标准曲线的绘制0~1000μg/mL 标准曲线的绘制：另取6支试管编号，按下表加入试剂。
管号1234561000μg/mL 牛血清白蛋白（mL ）蒸馏水（mL ）蛋白质浓度（μg/mL ）01.000.20.82000.40.64000.60.8 1.00.40.206008001000得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL ，准确吸取各管溶液0.lmL ，加入5ml 考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min ，测定595nm 吸光值，绘制0-1000μg/mL 标准曲线。
2.5.2样品的测定准确吸取样品溶液0.1mL 放入具塞刻度试管中，与步骤（1）操作相同，测得样品的光吸收值A595nm 。
3实验结果与分析3．1蛋白质含量计算由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（μg/mL ），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。
样品蛋白含量(μg/g 鲜重)＝────────────────────────────────────────3．2酶活力计算酶液活力（U/mL ）=×稀释倍数A 280nm0.001×0.1查出的蛋白提取液浓度（μg/mL）×定容体积(mL)样品重量(g)3．3酶比活的计算酶比活（U/mg·蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量3．4酶纯化过程中回收率计算回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100=〔（纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100 3．5酶纯化倍数的计算纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力3．6实验结果3.6.1蛋白质含量样品蛋白含量=758.2309μg/g（鲜重）3.6.2酶活力3.6.3酶比活3.6.4酶纯化回收率盐析回收率=40.53%；透析回收率=45.43%3.6.5酶纯化倍数盐析纯化倍数=3.022；透析纯化倍数=2.714菠萝蛋白酶分离纯化表4实验结论与讨论粗酶盐析和透析三个步骤中的蛋白质浓度来看，粗酶中的蛋白质浓度要低于盐析和透析后的酶液处理过的蛋白质浓度，但是蛋白质含量是粗酶最高，证明了实验步骤确实有效地提取出了菠萝蛋白酶。
但是盐析的蛋白质含量计算值比透析的少，原因可能是盐析出来的沉淀溶解的过程中沉淀不能完全溶解导致溶液中蛋白质较透析液少。
盐析和透析后的酶活力比粗酶的高。
在温度在大于50℃后,40min 后，菠萝果浸提液中菠萝蛋白酶的活性将明显损失[1]，可能因为酶浓度的不同，导致加热步骤总体积（mL）总蛋白质含量（mg）总活力（U）比活力（U/mg·蛋白）回收率（%）纯化倍数粗提取58.322.759.231*10^54.058*10^4——盐析16.410.84 3.741*10^53.450*10^440.53%0.8501透析19.811.214.194*10^5 3.741*10^445.43%0.9217速度不一致，因而盐析和透析的酶活力会比较高。
在实验范围内，Fe3+、Fe2+、Cu2+存在对浸提液中菠萝蛋白酶活性的影响较大,可能是与它们具有氧化还原性性有关[2]，所以在盐析之前，受金属离子影响，粗酶的酶活力和酶比活会较盐析和透析之后的酶活力和酶比活低。
但是实验结果发现粗酶的酶比活非常高，与理论应该出现的梯次上升不符，分析应该是粗酶活力测定的时候粗酶放置的时间比较久，影响了酶活性，第二个原因可能是底物浓度不足，盐析和透析步骤中的酶将底物分解完全，而粗酶因为酶含量较低并不能完全分解，导致计算的时候盐析和透析酶活力偏低，同时TCA的添加顺序也有一定影响。
硫酸铵固体加入法却不能保证所加入的2.43g固体硫酸铵全部溶解完全，结果得到的菠萝蛋白酶沉淀中就很有可能含有未溶掉的硫酸铵盐成分，从而使得沉淀的质量有所增加，而溶液加入法则是在先前完全溶解后再移取到菠萝汁里的，得到的菠萝蛋白酶中不会有未溶解的硫酸铵盐颗粒存在；再有，硫酸铵固体加入法不如其溶液加入法温和，固体加入法容易造成菠萝皮浸提液中局部硫酸铵盐浓度过高而导致部分菠萝蛋白酶失活，从而导致酶活回收率降低[3]。
在加入硫酸铵的时候使部分菠萝蛋白酶失活，导致回收率降低。
盐析的纯化倍数要比透析的纯化倍数高，因为盐析后的酶浓度会比透析的酶浓度高，所以就单位酶活力来说，盐析的比活会比透析的高，所以算盐析的纯化倍数会高。
思考题：1.酶的失活原因主要是金属离子的结合，高温，有机溶剂等逆环境的抑制，所以分离纯化的时候要注意不能用不洁净的仪器（盛装过PBS）来盛装酶液，不能靠近万用炉，不能用自来水作为透析液。
2.U/mL酶液：表示每单位体积样液中酶活力的情况，适用于表示液体酶中的酶活大小。
U/mg蛋白质：表示每单位质量样品中酶活力的情况，适用于含一种或多种蛋白质的样品中的酶活大小。
U/g鲜重或干重：表示每g原始样品中的酶活力的情况，适用于原始样品的酶活力表示。
U/g酶粉：表示每g酶粉中的酶活力情况，适用于酶制剂的酶活力测定或者酶制剂的相应浓度配制。
3.盐析法，有机溶剂法，重金属法，生物碱法，其中盐析法可逆，重金属法有机溶剂法、和生物碱法不可逆[4]。
4.随着硫酸铵浓度的逐渐增大，盐析得到的菠萝蛋白酶的酶活回收率逐渐增大，当硫酸铵的饱和度达到40%的时侯菠萝蛋白酶的酶活回收率最大，为83. 6%，往后开始逐渐减小，这与易元龙文献中报道中的相一致，当硫酸铵的饱和度越大时，菠萝皮浸提液的盐析效果越好[5]，所以取30%左右的最好。
参考文献[1]易元龙,李媚,谢涛,蓝丽红,廖安平,广西民族大学学报,2008,12，Vol.14，No.4[2]易元龙,李媚,谢涛,蓝丽红,廖安平,广西民族大学学报,2008,12，Vol.14，No.4[3]梁宏宇，菠萝蛋白酶提取方法的研究，2012年4月[4]田亚平，]生化分离原理与技术，化学工业出版社，2010[5][3]梁宏宇，菠萝蛋白酶提取方法的研究，2012年4月附菠萝蛋白酶实验原始数据粗液59.0mL离心液58.3ml盐析液57.3ml+10.08g硫酸铵透析前离心沉淀溶解16.4ml透析液19.8ml蛋白质吸光值粗酶0.315盐析0.505透析0.440吸光值粗酶盐析透析对照0.5430.3780.389 1号 1.983 2.781 2.543 2号 2.230 2.730 2.589 3号 2.166 2.466 2.389。