细菌的人工培养方法及意义(平板划线)
平板划线法分离菌种
实验六平板划线法分离菌种一、实验目的1、了解平板划线法分离菌种的基本原理2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。
一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。
通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。
实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。
平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。
具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。
由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。
鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。
这样的培养基称之为鉴别培养基。
例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。
（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数）其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。
伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。
在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。
微生物平板划线法
3
细菌接种方法
常见的几种细菌的培养和基接种方法举例
平板划线接种 法 菌种 培养 基 葡萄球菌和大 肠杆菌的混合 菌液 普通琼脂平板
斜面培养基 接种法
液体培养基 接种法 大肠杆菌培养 物枯草杆菌培 养物 普通肉汤 培养基
2
培养基
在土壤、水、食品、空气以及人和动、植 物中，不同种类的细菌混杂地生活在一起。若 要研究其中某种细菌，就必须将各种细菌进行 分离，以得到只含有这一种细菌的纯培养。当 细菌分离成纯种后，常需要接种到有关的培养 基中，以测试其各种生物学性状，不同的细菌 需要不同的培养基进行培养。
培养基的种类
平板划线法——接种方法
（三）取菌种 左手持装有金黄色葡萄球菌或大肠杆菌菌液 的试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试 管塞，将试管管口迅速通过火焰2~3次进行灭菌。 将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中， 取一接种环的菌液，然后退出菌种管，将菌种管 管口及试管塞再次通过火焰2~3次灭菌，塞好试管 塞，放至原来的位置。
平板划线法——接种方法
（一）标记 在培养皿底面，用记号笔注明接种 的菌名、接种者姓名、日期等。
平板划线法——接种方法
（二）灭菌接种环 点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环 ，并放置火焰中烧灼灭菌，先将接种环的接 种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延 至金属端，再直接烧灼金属环直至烧红，然 后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随 后再反方向通过火焰，如此2~3次。然后将接 种环移开火焰，待其冷却。
平板划线法——接种方法
（四）分离划线接种细菌（四区接种法） （1）左手手掌持琼脂平板培养基，大 拇指与中指轻轻将平皿盖子拿起，右手持接 种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一细菌 薄膜（约占平板的1/10），视为一区。划线 时使接种环与接种平板面呈30~40度角，以 腕力在平板表面行轻而快地来回滑动动作。
细菌的人工培养方法
细菌的人工培养方法[适用对象]生物工程专业[实验学时] 4学时一、实验目的了解常用的液体、固体和半固体培养基的成分、制备方法和用途。
初步掌握各种培养基接种技术；观察细菌在培养基中的生长现象；认识菌落、菌苔。
二、实验原理培养基是用人工方法将微生物生长繁殖所需的多种营养物质调配在一起，形成的一种营养物质的混合物，用以分离、传代和培养细菌。
按培养基的用途分为基础（普通）培养基、营养培养基、鉴别培养基，选择培养基、厌氧培养基等。
按培养基的物理形状又分为液体、固体和半固体三种。
三、仪器设备三角烧瓶、天平、试管、平皿、高压消毒灭菌器。
四、相关知识点培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
在自然界，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基的种类很多。
但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。
了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。
五、实验步骤（一）常用培养基的制备1、普通液体培养基(1)将新鲜的精牛肉除去脂肪和筋膜制成肉馅，取500克牛肉馅加l000ml蒸馏水，置4℃冰箱浸泡过夜，使牛肉中的水溶性营养物质充分浸出。
(2)次日将浸泡过夜的牛肉馅加热煮沸30分钟，放凉，使残余的脂肪凝固，然后用纱布和滤纸过滤，最后将滤液补足为原量，此种液体为牛肉浸汁。
(3)取1 000ml牛肉浸汁加蛋白胨10克，氯化钠5克加热溶解，冷至50℃左右时用氢氧化钠调整pH至7．6，再煮沸10分钟(因牛肉浸汁中部分碳水化合物，经加热破坏产酸，影响pH；产生多磷酸盐，培养基不澄清)待冷却后，再调整pH至7．6，然后以滤纸过滤，滤液必须澄清，此种液体称为肉汤培养基。
(4)将肉汤培养基分装于试管或三角烧瓶中，塞好试管和瓶塞，包装好后，用15磅(121℃)蒸气15～30分钟灭菌。
2-5动物微生物--细菌的人工培养(实验一)
1、3：有动力 2：无动力
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（2）在琼脂斜面上长成菌台。
a丝状
b刺毛状 c念珠状 d扩展状
e树状 f假根状
2、在液体培养基中的生长情况
（1）表面生长：液体清晰，细菌生长在 液面上形成菌膜。 （2）混浊生长：液体均匀混浊或有少量 沉淀。 （3）沉淀生长：液体清晰，细菌生长在 管底，形成沉淀。
三. 细菌在液体培养基中的生长情况
（1）在平板上形成肉眼可见的细菌集团， 称为菌落，观察菌落的大小、形状、边缘、 表面、颜色、溶血等情况。
Colony morphology
¹ ÌÅ à Ñ øÏ ù íµ ± æ Ï ¸Î ú ¾ úÆ ä Ï ¸ ¾ ú ¸» ° û µ Ä çÃ × Ó Ï Ô ¢¾ ¾ µ Í ¼ ¬Â
实验一
细菌的人工培养
一、实验目的
1、掌握平板划线、斜面、液体和半固体 培养基等各种接种方法。 2、熟悉接种细菌用具、接种细菌的环境 要求和无菌操作要领。
3、熟悉细菌在各种培养基的生长现象。
二、实验原理
1、细菌在适宜的生长环境下，如营养、 酸碱度、温度和氧等条件下进行生长繁殖。 2、细菌的分离培养是根据细菌在固体 培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个 细胞繁殖而成的集合体。因此可通过调取单 菌落而获得一种纯培养。
菌膜
对照
菌沉淀
均匀浑浊
3、在半固体培养基中的生长情况 （1）有鞭毛的细菌，由于能运动，在半 固体培养基内沿穿刺线弥漫生长，原来的 穿刺线不清。 （2）无鞭毛的细菌，因不能运动，接种 后仍沿穿刺线生长，穿刺线与周围界限清 晰。
细菌在半固体培养上的培养特征
abd 沿穿刺线生长
cef运动生长
三. 细菌在半固体培养基中的生长情况
细菌的人工培养
任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；
常规高压蒸汽灭菌： 1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟
培养基制备的一般程序
调配
培养基灭菌
★ 基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟
溶化
矫正pH
★ 含糖培养基：113 ℃灭菌15分钟 过滤澄清 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 分装 灭菌 检定 ★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
保存
1、选用和设计培养基的原则和方法
目的明确 营养协调 理化条件适宜
经济节约
1）目的明确
根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。
培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为： S 10g MgSO4.7H2O 0.5g NH4)2SO4 0.4g CaCl2 0.25g H2O 1000ml FeSO4 0.01g H2PO4 4g
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生物的 基础理论和应用方面的研究
含有一般微生物生长繁殖所 需的基本营养物质的培养基 按 用 途 不 同 划 分 基础培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的 一类营养丰富的培养基。特殊营养物质包括血 液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等 在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质， 用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体 抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物 中分离出来的培养基 的生长
4）经济节约
以粗代精
以氮代朊
以野代家
以废代好 以简代繁
以纤代糖
微生物平板划线试验
在液体培养基中加入一定量凝固 剂，使其成为固体状态，琼脂含 量一般为1.5%-2.0%
按 物 理 状 态 不 同 划 分
固体培养基 半固体培养基
固体培养基常用来进行微生物的分 离、鉴定、活菌计数及菌种保藏
琼脂含量一般为0.2%-0.7%
观察微生物的运动特征、分类鉴 定及噬菌体效价滴定
液体培养基
不加任何凝固剂 大规模工业生产及在实验室进行 微生物的基础理论和应用方面的 研究
平板划线实验实习
一、相关基础理论－－细菌的培养
一般细菌均可用人工方法进行培养，使其生长繁殖， 以便进一步观察和研究他们的各种生物学特征。为 了获得良好的细菌培养物，在分离培养细菌时，除 采用适宜的培养基，并考虑到其他的培养条件之外， 掌握各种分离培养和接种的基本技术，也是重要环 节。
1、培养基
圆形、突起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽， 不透明菌落，直径1～2mm
4、平板划线接种法
图2-4 灭菌接种环
4、平板划线接种法
（3）取菌种 左手持装有金黄色葡萄球菌或大肠杆菌菌液的 试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管塞， 将试管管口迅速通过火焰2~3次进行灭菌。 将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取 一接种环的菌液，然后退出菌种管，将菌种管管口 再次通过火焰2~3次灭菌，塞好试管塞，放至原来 的位置。
2、液体培养基接种方法
步骤:（1）用记号笔在待接种培养基上写明标记。 （2）如斜面培养基的接种方法一样，握持菌种管及 接种的肉汤管。 （3）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管取少量细菌再 伸入肉汤管内，在接近液面管壁处轻轻研磨， 蘸取少量肉汤调和，使菌混于肉汤中。塞好试 管塞后，摇动液体，使细菌在液体中均匀分布。 （4）接种完毕，将接种环灭菌后放回试管架上。肉 汤管放37℃温箱培养，18～24小时后观察生长 情况。
细菌的人工培养一般检验方法主要动物细菌
（3） 致病性与抵抗力
致病力主要是毒素和酶,所 致的疾病为畜禽的化脓性疾 病，如：创伤感染、脓肿、 皮炎、乳房炎、败血症等。
抵抗力是在不形成芽胞的 细菌中是最强的，80℃30分 钟才被杀死，碳酸效果最好。
对青霉素、庆大霉素高度 敏感。耐药菌株逐年增多。
（4）检查： 根据病型采集病料，如取血液，乳汁，脓汁等
链球菌在血平板上菌落特征
丙链
甲链
乙链
（3）致病性与抵抗力： 产生多种酶和外毒素，不同的血清群的链球菌所致动
物的疾病不同，引起急性败血症，肺炎，淋巴结脓肿，脓 毒败血症。
本菌抵抗力不强，青霉素是首选药物。
（4）检查 根据不同的疾病，采集相应的病料，如取血液，乳汁，
脓汁、渗出物等。
• 1、直接涂片镜检：链状排列的球菌。 • 分离培养：病料接种于血液琼脂平板。
菌 膜
对
液体培养基
照
菌沉 淀
均匀浑浊
固体培养基
半固体培养基 粘液型菌落
细菌的生长表现
菌落：细菌在固体培养基上定点繁殖时，形成孤立的、肉 眼可见的堆积物。 表现：大小、形态、透明度、隆起度、度、湿润度，表面 光滑、粗糙、有无光泽。 菌苔：许多菌落融合成一片。
培养基的基本要求
1、有丰富的营养物质 2、PH、水分 3、均匀透明，易于观察。 4、经过灭菌和无菌检验
破伤风梭菌
猪丹毒杆菌G+
能力单元一（ 1-3）
细菌的人养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖 或积累代谢产物营养基质。
根据培养基的用途来分
基础培养基：满足一般微生物生长繁殖所需要的营养物质。 牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。
营养培养基:在自然界中各种微生物通常是混杂在一起的， 了解了某一些微生物的营养要求，配制适合这种微生物生长 而不适合其他微生物生长的培养基，就达到了从自然界中分 离这种微生物的目的，这种培养基就称为营养培养基。一般 常加入血、血清或动植物提取液等。－－－－“投其所好”
细菌的接种与培养方法操作规程
细菌的接种与培养方法操作规程一、细菌的接种根据待检标本的来源、培养目的及所用培养基的性状，采用不同的接种方法。
l、平板画线分离法（1）、连续画线分离法此法主要用于杂菌不多的标本。
用接种环取标本少许，于平板l/5处密集涂布，然后回来作曲线连续划线接种，线与线间有一定距离，划满平板为止。
（2）、分区画线分离法此法适用于杂菌较多的标本。
先将标本均匀涂布于平板边缘一小区(约占平板1/5)，再在二、三区依次连续画线，每画线一区均将接种针灭菌一次。
每一区的划线均接触上一区的接种线1～2次。
以获得单个菌落。
2、斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养。
用灭菌接种针取菌少许，从培养基斜面底部向上划一直线，然后从底部向上作连续曲线画线。
一直画到斜面顶端。
3、液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。
用灭菌接种环取菌少许，在试管内壁与液面交接处的管壁上轻轻研磨，使细菌混合于液体中。
4、穿刺接种法主要用于半固体培养基、明胶及双糖铁的接种。
用接种针取菌少许，从半固体培养基中央，平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接触管底，然后接种针原路退出。
5、倾注平板法临床上主要用于尿液等标本的细菌计数。
将标本经适当稀释后，取一定量加入已灭菌的平皿内，倾入已经溶化并冷却至45℃左右的定量培养基，混匀，待凝固后倒置、培养。
6、涂布接种法常用于纸片药物敏感性测定，也可用于被检标本的细菌计数。
加定量的被检菌液于琼脂平板表面，然后用灭菌的棉签反复涂布几次，使被检菌均匀分布在琼脂平板表面。
然后贴上药敏纸片培养，或直接培养观察结果。
二、细菌培养方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同的环境进行培养。
常用的有需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。
1、需氧培养法本法是临床细菌室常用的培养方法，即将已经接种好的平板、斜面和液体培养基等。
置于35℃温箱中孵育18～24小时。
2、二氧化碳培养法本室用CO2孵箱将已接种好的培养基置于CO2孵箱内培养。
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固体斜面培养基接种
液体培养基接种
细菌的人工培养
三、细菌生长结果观察
固体琼脂平板上
菌落 菌苔
EMB琼脂平板上大肠菌 SS琼脂平板上大肠
菌落具有金属光泽
杆菌为粉红菌落
➢半固体培养基观察细菌动力
无运动性 有运动性
表面生长 混浊生长 沉淀生长
➢液体培养基上生长现象
复习思考题：
1、培养基按用途分有哪些种类？麦糠凯琼 脂、SS琼脂分别属于哪类?分别用于那些菌 的分离培养？
•
9、一个人即使已登上顶峰，也仍要自 强不息 。上午 9时9分 46秒上 午9时9 分09:0 9:4620. 12.11
• 10、你要做多大的事情，就该承受多大的压力。12/11/
2020 9:09:46 AM09:09:462020/12/11
• 11、自己要先看得起自己，别人才会看得起你。12/11/
剂。
细菌的人工培养
一、培养基 二、细菌接种技术 三、细菌生长结果观察
细菌的人工培养
一、培养基
概念: 培养基是用人工方法将多种营养物质按 照各类微生物生长的需要而合成的一种混合养料。
任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大 营养要素：
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理
（2）右手拿接种 环，在火焰上烧灼 灭菌，特别是箍处。
（3）火焰边取下 两个棉塞，不能放 下；烧灼管口一周。
（4）将接种环伸 入试管内，冷却后， 轻轻挑取少量菌体， 立即将接种环抽出。
（5）火焰旁将沾有 菌种的接种环迅速伸 到斜面培养基的底部， 由里向外画蛇形细线， 线要画得细些。
（6）抽出接种环后， 烧管口，塞棉塞，接 种环灭菌。
•
3、越是没有本领的就越加自命不凡。 20.12.1 109:09: 4609:0 9Dec-20 11-Dec-20
•
4、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的 错儿。 09:09:4 609:09: 4609:0 9Friday , December 11, 2020
•
5、知人者智，自知者明。胜人者有力 ，自胜 者强。 20.12.1 120.12. 1109:0 9:4609: 09:46D ecembe r 11, 2020
不加任何凝固剂
用于增菌，大规模工业生产及在实验 室进行微生物的研究
固体培养基
半固体培养基
液体培养基
按用途不同划分
基础培养基 营养培养基 选择培养基 鉴别培养基 特殊培养基
含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养 物。比如 肉汤培养基。
在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一 类营养丰富的培养基。如血琼脂培养基。
谢 谢 大 家 2020 9:09 AM12/11/2020 9:09 AM20.12.1120.12.11
• 12、这一秒不放弃，下一秒就会有希望。11-Dec-2011 December 202020.12.11
• 13、无论才能知识多么卓著，如果缺乏热情，则无异 纸上画饼充饥，无补于事。Friday, December 11, 202011
2、增菌培养用什么类型培养基？分离细菌 用什么类型培养基？
3、什么是菌落？分离菌落的意义？ 4、人工培养细菌的意义？
•
1、有时候读书是一种巧妙地避开思考 的方法 。20.1 2.1120. 12.11Fr iday, December 11, 2020
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2、阅读一切好书如同和过去最杰出的 人谈话 。09:0 9:4609: 09:4609 :0912/ 11/2020 9:09:46 AM
在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学 物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于 所需微生物的生长。用来将某种或某类微生物 从混杂的微生物群体中分离出来。如SS琼脂培 养基。
利用细菌代谢产物不同而使指示剂显色反应 不同的原理，鉴别和鉴定细菌。如麦糠凯琼 脂培养基。
如厌氧培养基。用于厌氧菌的培养。
细菌的人工培养
第三单元 细菌的人工培养
主讲人：齐雪茹 廊坊职业技术学院动物科学系
人工培养细菌的意义
在医学中的应用：诊断；细菌鉴定；生物制品。 在工农业生产中的应用：细菌在培养过程产生多种代谢
产物，经过加工处理，可制成抗生素、维生素、氨基酸、有 机溶剂、酒、酱油、味精等产品。
在基因工程中的应用：制备出胰岛素和干扰素等生物制
高压蒸 汽灭菌
按物理状态不同划分
培养基的分类：
固体培养基 半固体培养基
液体培养基
在液体培养基中加入一定量凝固剂，使 其成为固体状态，琼脂含量一般为 1.5%-2.0%
固体培养基常用来进行微生物的分离、 鉴定、活菌计数及菌种保藏
琼脂含量一般为0.2%-0.7%
观察微生物的运动特征、分类鉴定及 噬菌体效价滴定
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6、意志坚强的人能把世界放在手中像 泥块一 样任意 揉捏。 2020年 12月11 日星期 五上午 9时9分 46秒09 :09:462 0.12.11
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7、最具挑战性的挑战莫过于提升自我 。。20 20年12 月上午 9时9分 20.12.1 109:09 December 11, 2020
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8、业余生活要有意义，不要越轨。20 20年12 月11日 星期五 9时9分 46秒09 :09:461 1 December 2020
-Dec-2020.12.11
• 14、我只是自己不放过自己而已，现在我不会再逼自 己眷恋了。20.12.1109:09:4611 December 202009:09
培养基的制备：
细菌的人工培养
二、细菌的接种技术
分离培养接种法——平板划线法、平行划线法 纯种细菌接种法 ——固体斜面培养基接种法
液体培养基接种法 半固体培养基接种法
细菌的人工培养
➢平板划线分离培养法
菌落平行划线法来自固体斜面接种法（1）用左手大姆 指、食指和无名指 夹住菌种试管和待 接种和斜面试管， 右手拧松棉塞、不 取下。