SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
SDS-PAGE电泳实验步骤
SDS-PAGE电泳实验步骤垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋⽩质⼀、实验⽬的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋⽩质的分⼦量的原理和基本操作技术。
⼆、实验原理蛋⽩质是两性电解质，在⼀定的pH条件下解离⽽带电荷。
当溶液的pH⼤于蛋⽩质的等电点(pI)时，蛋⽩质本⾝带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH⼩于蛋⽩质的等电点时，蛋⽩质带正电，在电场中将向负极移动；蛋⽩质在特定电场中移动的速度取决于其本⾝所带的净电荷的多少、蛋⽩质颗粒的⼤⼩和分⼦形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由⼀定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合⽽成的三维⽹状孔结构。
本实验采⽤不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺⽤量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分⼦量的蛋⽩质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同⽽表现出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较⼤，不同⼤⼩的蛋⽩质分⼦在通过⼤孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进⼊⼩孔胶时，分⼦量⼤的蛋⽩质移动速度减慢，因⽽在两层凝胶的界⾯处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分⼦筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采⽤两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris⽤于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离⼦；CI-是前导离⼦。
在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离⼦，⽽在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离⼦的解离度，进⽽达到控制其有效迁移率之⽬的。
不同蛋⽩质具有不同的等电点，在进⼊分离胶后，各种蛋⽩质由于所带的静电荷不同，⽽有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分⼦筛效应及电荷效应，使不同的蛋⽩质在同⼀电场中达到有效的分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加⼊⼀定浓度的⼗⼆烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有⼤量的负电荷，且这种阴离⼦表⾯活性剂能使蛋⽩质变性，特别是在强还原剂如巯基⼄醇存在下，蛋⽩质分⼦内的⼆硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋⽩质分⼦与SDS充分结合，形成带负电性的蛋⽩质—SDS复合物；此时，蛋⽩质分⼦上所带的负电荷量远远超过蛋⽩质分⼦原有的电荷量，掩盖了不同蛋⽩质间所带电荷上的差异。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
下面是sds聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤：
1.准备凝胶溶液：将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合，加入去离
子水并搅拌直至溶解。
加入TEMED（四甲基乙二胺）和过硫酸铵，混合均匀。
2.制作玻璃板：清洗两个玻璃板，加入适量凝胶溶液，用玻璃板
夹夹住，形成模具。
等待凝胶聚合。
3.准备电泳缓冲液：混合Tris 和甘氨酸，调整pH值。
4.准备样品：将蛋白质样品与loading buffer混合，煮沸3-5
分钟。
5.上样：将样品加入凝胶顶部，用移液枪或者吸管将样品加入凝
胶的梳子底部。
6.电泳：接通电源，调节电压和电流，进行电泳。
7.转膜：将凝胶和膜一起放入电转仪中，加入Tris甘氨酸电泳
缓冲液，接通电源，进行转膜。
8.染色：将膜放入染色液中染色，用保鲜膜将染色液表面覆盖，
轻轻摇动，直至膜完全染色。
9.洗脱：将膜从染色液中取出，用去离子水洗脱。
10.分析结果：观察膜的条带，进行数据分析。
以上是基本的聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤。
需要注意的是，实验操作中需要注意安全，避免对身体有害的试剂。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一、材料准备1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。
30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。
过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。
1.10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。
2.10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。
能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。
配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。
过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。
过硫酸铵配制成10%溶液后，应当-20℃保存。
同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。
3.N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固，其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。
TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。
另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
配制方法：原液使用。
应使用电泳级TEMED。
4.30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液） :含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺。
丙烯酰胺单体（Arc）在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺。
N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis），交联剂。
丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目得学习ＳDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(ＳDS—ＰAGＥ)测定蛋白质得分子量得原理与基本操作技术、二、实验原理蛋白质就是两性电解质,在一定得ｐH条件下解离而带电荷。
当溶液得pH大于蛋白质得等电点(pＩ)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液得pH小于蛋白质得等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动得速度取决于其本身所带得净电荷得多少、蛋白质颗粒得大小与分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶就是由一定量得丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合而成得三维网状孔结构、本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量得多少,可制成不同孔径得两层凝胶;这样,当含有不同分子量得蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞得程度不同而表现出不同得迁移率。
由于上层胶得孔径较大,不同大小得蛋白质分子在通过大孔胶时,受到得阻滞基本相同,因此以相同得速率移动;当进入小孔胶时,分子量大得蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶得界面处,样品被压缩成很窄得区带。
这就就是常说得浓缩效应与分子筛效应。
同时,在制备上层胶(浓缩胶)与下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶ｐＨ=6、7—6。
8,下层胶pH=8.9;Tris—HCＩ缓冲液中得Triｓ用于维持溶液得电中性及pＨ,就是缓冲配对离子;ＣI－就是前导离子。
在pH6.８时,缓冲液中得Gly—为尾随离子,而在pH＝8、９时,Gly得解离度增加;这样浓缩胶与分离胶之间ｐH得不连续性,控制了慢离子得解离度,进而达到控制其有效迁移率之目得。
不同蛋白质具有不同得等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带得静电荷不同,而有不同得迁移率、由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在得浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同得蛋白质在同一电场中达到有效得分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度得十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDＳ带有大量得负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别就是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内得二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性得蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带得负电荷量远远超过蛋白质分子原有得电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上得差异、蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程（12%胶，）1电泳各试剂的配制1.1凝胶贮液：Acrylamide/Bis (30%T，%C)——为聚丙烯酰胺取丙烯酰胺acrylamide g、双丙烯酰胺N′N′-bis-methylene-acrylamide g至100mL量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀，过滤。
4℃避光储存。
即10%的过硫酸铵 10%APS（临用现配）称取过硫酸铵（ammonium persulfate）100 mg，加1mL去离子水溶解。
Tris-HCl，pH称取Tris base g 于量瓶中，加去离子水80mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。
4℃储存。
%（w/v）溴酚蓝：溴酚蓝，去离子水定容至100mL。
Tris-HCl，pH ：称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去离子水60mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。
4℃储存。
10%（w/v）SDS：称取10g SDS至100ml量瓶中，加90ml去离子水，缓慢搅拌至溶解，再加去离子水至刻度。
凝胶配制按下表比例配制凝胶分离胶及浓缩胶按上表比例配好后，均需脱气15 min。
临灌胶前，往分离胶中加入100 μl 10%APS及10 μl TEMED；往浓缩胶中加入100 μl 10%APS及20 μl TEMED（各试剂按比例增减）。
其中：TEMED为催化剂10×电极缓冲液，pH称取Tris base g、Glycine（甘氨酸） 144 g、SDS g于1000 mL量瓶中，溶解，加去离子水至刻度，不调pH。
4℃储存。
临用前，取出放至室温，10倍稀释，混匀，即为电极缓冲液。
样品溶解液S去离子水；0.5M Tris-HCl，pH ；glycerol （甘油）10% (w/v) SDS%（w/v）溴酚蓝总体积为 mL。
室温储存。
临用前加50 μlβ-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）于950 μl样品缓冲中，即为样品溶解液。
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。
引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。
化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。
采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。
因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
三、实验器材及数据30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml四、注意事项1、acr和bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴口罩和手套，纯化应在通风处内进行。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
【跑电泳的步骤】1、取出电泳仪器和四个烧杯；2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口；3、配制过硫酸铵溶液（AP）：+0.9g超纯水，保鲜膜封口；4、取出所有药品。
Tris-HCL(88,，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好；5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只；6、先配分离胶7、组装凝胶模具，插好板（1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里；（2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。
8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂；9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）；10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干；11、配浓缩胶；12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我；13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。
），样品煮沸3分钟；14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内；15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV；16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。
【附配方】分离胶separating gel (5mL) ( 1个板1板2板Prescription12%10%%mL mLDel H2O mL mL3mL1.5M Tris-HCL mL mL mL mL mL30%Acry/bis 2 mL mL mL mL单体胶（29.2g+0.8g/100mL）10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL10%AP50uL50uL50uL35uL70uLTEMED2uL2uL(5 uL)2uL 7uL(夏)~8uL浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL)Prescription Volume(2 mL)(2 mL)Del H2O0.5M Tris-HCL 250uL375uL30%单体胶330uL495uL10%SDS20uL30uL10%AP20uL30uLTEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL夏)【附所需试剂配制】1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g；(100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g) 超纯水定容至50mL，uM膜过滤，4℃保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在溶液中的百分比（m/V），可选择的范围为3%~30%；%C是指双丙烯酰胺与单体总质量的比值（m/m），也指交联度。
实验二十五 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）、器材
1．垂直板型电泳槽
2．直流稳压电源(电压300～600V，电流50～100mA)
3．50或100μl的微量注射器
四、操作步骤
（一）安装垂直板型电泳装置
此种夹心式垂直板电泳装置(如图2，3)的两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模子。凝胶模子由3部分组成；一个“U”形的硅胶框、两块长短不等的玻璃片、样品槽模板(俗称“梳子”)。电极槽由上贮槽(白金电极在上或面对短玻璃片)、下贮槽(白金电极在下或面对长玻璃片)和冷凝系统组成。凝胶模子的硅胶框内侧有两条凹槽，可将两块相应大小的玻璃片嵌入槽内。玻璃片之间形成一个2～3mm厚的间隙，将来制胶时，将胶灌入其中。灌胶前，先将玻璃片洗净、晾干、嵌入胶带凹槽中。长玻璃片下沿与胶带框底之间保持有一缝隙，以使此端的凝胶与一侧的电极槽相通；而短玻璃片的下沿则插入橡胶框的底槽内。将已插好玻璃片的凝胶模子置于仰放的上贮槽上，短玻璃片应面对上贮槽，再合上下贮槽，用4条长螺丝将两个半槽固定在一起。上螺丝时，要按一定顺序逐个拧紧，均匀用力。将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配制的1％琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶模板下面的窄缝(通电时又可作为盐桥)。（二）凝胶的制备
8．凝胶贮液：Acr30.0g，Bis0.8g，加蒸馏水到100ml
9．电极缓冲溶液：SDS l g，Tris6g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水至1000ml，pH=8.3。
10．固定液：取50％甲醇454ml，冰醋酸46ml，混匀。
11．染色液：1.25 g考马斯亮蓝R-250，加454 ml 50％甲醇溶液和46ml冰醋酸，混匀。
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【跑电泳的步骤】
1、取出电泳仪器和四个烧杯；
2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口；
3、配制过硫酸铵溶液（AP）：0.1gAP+0.9g超纯水，保鲜膜封口；
4、取出所有药品。
Tris-HCL(88,6.8)，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好；
5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只；
6、先配分离胶
7、组装凝胶模具，插好板
（1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里；
（2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。
8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂；
9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）；
10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干；
11、配浓缩胶；
12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我；
13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。
），样品煮沸3分钟；
14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内；
15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV；
16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。
【附配方】
分离胶separating gel (5mL) ( 1个板3.5mL)1板2板
Prescription12%10%7.5% 3.5 mL7.0 mL
Del H2O 1.6 mL 1.9mL 2.3 mL 1.3 3mL 2.66mL
1.5M Tris-HCL pH8.8 1.3 mL 1.3 mL 1.3 mL0.91 mL 1.82 mL
30%Acry/bis
2 mL 1.7 mL 1.
3 mL 1.19mL 1.38 mL 单体胶（29.2g+0.8g/100mL）
10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL
10%AP50uL50uL50uL35uL70uL
7uL(夏)~8 TEMED2uL2uL(5 uL)2uL 3.5uL
uL
浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL)
Prescription Volume(2 mL)(2 mL)
Del H2O 1.4mL 2.1mL
0.5M Tris-HCL pH6.8250uL375uL
30%单体胶330uL495uL
10%SDS20uL30uL
10%AP20uL30uL
TEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL夏)
【附所需试剂配制】
1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，2.67%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g；(100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g) 超纯水定容至50mL，0.45 uM膜过滤，4℃保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在
溶液中的百分比（m/V），可选择的范围为3%~30%；%C是指双丙烯酰胺与单体总质量的比值（m/m），也指交联度。
2、分离胶缓冲液pH8.8配制100mL(1.5M Tris-HCL pH8.8)：Tris 18.15g，部分去离子水溶解，并用HCL调pH8.8，最后定容至100 mL，过0.45 uM膜，4℃保存。
3、浓缩胶缓冲液pH6.8配制50mL(0.5M Tris-HCL pH6.8)：Tris 3.0g，部分去离子水溶解，并用HCL调pH6.8，最后定容至50 mL，4℃保存。
4、10%SDS：5g/50 mL H2O，配制后4℃保存。
5、10%AP（过硫酸铵）：用时现配，溶解状态十分不稳定，0.1g/1mL H2O。
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6、电泳缓冲液：配1000 mL
Tris 3.0g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g，去离子水定容至1000 mL。
7、染色液：
（1）原液：配制200 mL：考马斯亮蓝（R-250）：2.0g+200 mL去离子水；
（2）染色液：配制500 mL：原液62.5mL，甲醇250mL，冰乙酸50mL，去离子水137.5mL。
8、脱色液：1000 mL
甲醇500 mL，冰乙酸100 mL，去离子水定容至1000 mL。
9、TEMED原液
稳压：Stacking：90V（20mA），Seperate：120V（25mA）。