实验一、骨髓瘤细胞的培养
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备（一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定.1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip （腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0。
5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射）↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
高中生物单克隆抗体实验总结
⾼中⽣物单克隆抗体实验总结 考试是检测学⽣学习效果的重要⼿段和⽅法，考前需要做好各⽅⾯的知识储备。
下⾯是店铺为⼤家整理的⾼中⽣物单克隆抗体实验总结，希望对⼤家有所帮助! ⾼中⽣物单克隆抗体实验总结 (⼀)动物的选择 ⽬前应⽤最⼴的是⼩⽩⿏和⼤⽩⿏，尤以⼩⽩⿏为好。
就品系⽽⾔以Balb/c⼩⽩⿏应⽤最⼴，由于所有的⼩⽩⿏⾻髓瘤系均从Balb/c⼩⽩⿏系诱导出来。
Balb/c系⼩⽩⿏必须⽤纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。
⼤⽩⿏也可，能产⽣较多量的单抗体。
现在已经在⼩⿏杂交瘤的基础上，发展了⼩⿏-⼤⿏，⼩⿏-⼈以及⼈-⼈杂交瘤技术。
(⼆)免疫 ⼀般⽽⾔，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。
免疫程序、剂量和⽅法是关系到是否能得到所需要的单抗体的关键之⼀。
正常⼩⿏脾脏含有能产⽣各种不同抗体的B淋巴细胞，⼀只纯种⼩⽩⿏估计能产⽣1.0×107~5.0×107种不同的抗体。
因此⼀只正常的⼩⽩⿏的脾细胞与⼩⿏⾻髓瘤融合，只能有千万分之⼀的机会获得某⼀种特定抗体。
所以为了进步得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产⽣特异性抗体的B淋巴细胞⼤量增加。
B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很⼤影响。
有⼈以为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，⽽免疫以后7~8天，固然是抗体产⽣的⾼峰时期，但形成有活⼒的杂交瘤细胞的可能反⽽减少。
故⼀般以为加强免疫后的第三天应杀⿏取脾做细胞融合。
1.可溶性抗原(蛋⽩质) 以1mg/ml～5mg/ml的溶液加等量的弗⽒完全佐剂乳化，分多点⼩⿏⽪下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔3～5周再同样注射⼀次，10天后，断尾取⾎⼀滴，测抗体效价，选滴度⾼的⼩⿏做融合试验。
⼀个⽉后可以经静脉(尾静脉)给予⽆佐剂抗原0.2ml～0.4ml，3～4天后，杀死⼩⿏取脾做融适⽤。
2.颗粒性抗原如抗原来源⽅便，可以不加佐剂⽽增加免疫次数，缩短间隔时间。
筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法是一种常用的免疫学检测方法，用于检测细 胞表面抗原或分泌型抗原。该方法的基本原理是将特异性抗 体与酶结合，然后与细胞表面抗原或分泌型抗原结合，最后 通过酶反应显色来检测抗原的存在。
克隆化培养
克隆筛选
通过有限稀释法或流式细胞术等 方法，将杂交瘤细胞克隆化培养 ，以获得单克隆杂交瘤细胞。
培养条件
提供适宜的培养条件，如适宜的 培养基、温度、气体等，以保证 杂交瘤细胞的生长与繁殖。
抗体检测与筛选
抗体筛选
通过抗原结合试验进一步筛选出具有 高亲和力和特异性的杂交瘤细胞克隆。
抗体纯化
对筛选出的杂交瘤细胞克隆产生的抗 体进行纯化，以提高抗体的纯度和特 异性。
荧光激活细胞分选法的优点是灵敏度高、分辨率高、操作自动化，适用于大量细 胞的筛选。但是，该方法需要使用
细胞融合
选择合适的骨髓瘤细胞与免疫细胞融合
01
选择具有高免疫反应的骨髓瘤细胞系，如SP2/0、X63-
Ag8.653等，与免疫细胞融合，以产生杂交瘤细胞。
生物制品生产
抗体生产
杂交瘤细胞可以作为生产抗体的重要来 源，用于生产治疗性抗体或诊断试剂。
VS
细胞培养技术
通过筛选高表达量的杂交瘤细胞，可以优 化细胞培养技术，提高生物制品的生产效 率和质量。
05
杂交瘤细胞筛选的挑战与解决方案
克隆不稳定问题
克隆不稳定是指杂交瘤细胞在培养过程中出现生长缓慢、 停滞甚至死亡的现象，导致难以获得稳定表达抗体的细胞 株。
克隆扩大培养与建株
细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告细胞生物学实验报告动物细胞融合【实验目的】⒈了解动物细胞融合的常用方法。
⒉学习化学融合的基本操作过程。
⒊观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。
【实验原理】细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。
目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。
⒈病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。
这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒和宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。
用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
⒉化学诱导融合很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。
这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。
PEG是被广泛使用的化学融合剂。
⒊电激诱导融合包括电诱导、激光诱导等。
其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。
电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
【实验用品】⒈材料鸡血红细胞。
⒉试剂50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。
⒊器材正置显微镜、离心机、离心管、载玻片、盖玻片、滴管、注射器等。
【实验步骤】⒈鸡血红细胞的制备和保存用无菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再从鸡翼下静脉取血0.5~1ml，取出后放入刻度离心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使总量为4~5ml，混匀并封口，置于4℃冰箱内。
RHO0细胞的培养和应用
无线粒体功能， )*+" 细胞是指一类线粒体内 ,-. 缺失， 依靠糖酵解存活的细胞系。因为没有线粒体功能这种特殊性， 使这类细胞在线粒体 ,-.、 线粒体功能、 线粒体遗传及线粒体 与缺氧、 疾病、 长寿、 损害等的研究中有广泛应用。国内对这类 细胞的研究和应用还较少， 本研究回顾了这类细胞的培养和应 用方面的文献。
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线粒体是细胞能量的主要来源， 线粒体功能的正常发挥关
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缺氧感受和细胞调节研究中的应用
应用 !"#$ 细胞研究线粒体在缺氧反应和 "BS,. 诱导中的
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成都石室中学2024～2025学年度上期高2025届高三半期考试生物试卷
成都石室中学2024～2025学年度上期高2025届半期考试生物试卷本试卷分选择题和非选择题两部分。
第Ⅰ卷为选择题，第ⅠⅠ卷为非选择题，共8页，满分100分，考试时间75分钟。
第Ⅰ卷（选择题，共48分）本卷共16小题，每小题3分，共计48分。
每小题给出的四个选项中只有一个符合题意。
1．下列关于高中生物学实验的叙述，错误的是A．“用高倍显微镜观察叶绿体”实验中，利用藓类叶片为材料对于制作临时装片十分有利B．“探究温度对酶活性的影响”实验中，将淀粉和淀粉酶先置于不同温度处理后再混合C．“探究植物细胞的失水和吸水”实验，细胞随着质壁分离程度的加深，吸水能力增强D．“用伞形帽和菊花形帽伞藻进行嫁接实验”得出结论：伞藻帽形的建成主要与细胞核有关2．北京烤鸭是北京的传统特色美食。
饲喂选做食材用的北京鸭时，主要以玉米、谷类和菜叶为饲料，使其肥育，这样烤出的鸭子外观饱满，皮层酥脆，外焦里嫩。
北京鸭的脂肪会积累在一种由内质网衍生而来的油质体中，如图所示。
下列相关叙述正确的是A．玉米、谷类和菜叶可为北京鸭提供了富含脂肪的饲料B．检测脂肪时，可以用50%的盐酸洗去多余的苏丹Ⅲ染液C．北京鸭的皮下富含不饱和脂肪酸的固态脂肪D．油质体中的脂肪会在两层磷脂分子之间积累3．泛素蛋白会与细胞中需降解的蛋白质结合，当降解蛋白质上连接4个以上泛素蛋白后会被细胞内的蛋白酶体识别并降解（如图1）。
蛋清溶菌酶与细胞提取液混合后会逐渐通过泛素降解途径降解。
为探究蛋清溶菌酶的降解过程，进行以下实验。
实验组：放射性同位素标记的蛋清溶菌酶与细胞提取液混合。
对照组：放射性同位素标记的蛋清溶菌酶与不含细胞提取物的缓冲液混合。
反应一段时间后，进行蛋白质电泳，放射性自显影显示含有放射性同位素的蛋白质条带如图2所示。
下列叙述错误的是A．泛素蛋白含量降低将不利于某些需降解的酶的降解B．据图2可知，实验组中蛋清溶菌酶的种类多于对照组C．蛋清溶菌酶的降解需要蛋白酶体、泛素连接酶等多种酶参与D．泛素蛋白、泛素连接酶在蛋白降解过程中可以重复发挥作用4．当人体内血糖浓度升高时，葡萄糖进入胰岛B细胞，引发一系列生理反应促进胰岛素分泌，如右图所示。
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用 The latest revision on November 22, 2020单克隆抗体的制备及应用单克隆是由杂交瘤产生的、只针对复合上某一单个。
技术(monoclonalantibodytechnique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的，并以此生产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。
1单克隆抗体的优点与局限性：1.1单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA 等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。
1.2单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。
由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。
2单克隆抗体的制备：单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与、细胞融合、选择杂交瘤细胞及检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。
多发性骨髓瘤
部分t（11；14）易位的MM患者可能存在淋巴浆细胞性或小而成熟的浆细胞形态， 并有与WM类似的CD20表达，然而，WM中不存在t（11；14）易位
+孤立性浆细胞瘤
浆细胞瘤是由不同成熟阶段浆细胞构成的肿瘤，组织学上与MM表现相同 如果浆细胞瘤单独发生在骨骼，则称为孤立性骨浆细胞瘤，如果发生在骨骼以
+ 【实验室和其他检查】
2.血钙、血磷 骨质破坏，出现高钙血症，血磷正常。不伴成骨过程，血清碱性磷酸酶
正常 3.血清β2 微球蛋白和血清白蛋白
β2 微球蛋白由浆细胞分泌，与全身骨髓瘤细胞总数有显著相关性。血 清白蛋白量与骨髓瘤生长因子IL-6的活性呈负相关
均可用于评估肿瘤负荷及预后 4.CRP和LDH
+MGUS——意义未明的单株免疫球蛋白血症
血清M蛋白＜3g/dl 克隆性骨髓浆细胞＜10% 没有可归因于浆细胞增殖性疾病的溶骨性病变、贫血、高钙血症和
肾功能损伤（终末期器官损伤） MGUS进展为MM的风险为每年1%
+ SMM冒烟型多发性骨髓瘤
M蛋白≥3g/dl和/或骨髓浆细胞占10%-60% 无终末器官损害或其他骨髓瘤定义事件，并且没有淀粉样变性
+ （二）骨髓瘤细胞分泌单株免疫球蛋白（monoclonal
immunoglobulin,M蛋白）引起的全身紊乱
1.感染 是导致死亡的第一位原因。因正常多株免疫球蛋白产生受抑 及中性粒细胞减少，免疫力底下，容易发生各种感染，如细菌性肺炎 和尿路感染，甚至败血症。病毒感染以带状疱疹多见。
2.高黏滞综合症 血清中M蛋白增多，尤以IgA易聚合成多聚体，可 使血液黏滞性过高，引起血流缓慢、组织淤血和缺氧。在视网膜、中 枢神经和心血管系统尤为显著。症状有头昏、眩晕、眼花、耳鸣、手 指麻木、冠状动脉供血不足、慢性心力衰竭等患者可发生意识障碍
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实验一、骨髓瘤细胞的培养
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系， 这样杂交融合率高， 也便于接种杂交瘤细胞 在同
一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。
常用骨髓瘤细胞系有： NS1、 SP2／0、 X63 Ag8.653 等。
骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如 RPMI1640, DMEM培养基。小牛血清的浓度
一般在10〜20%,细胞的最大密度不得超 106/ ml, 一般扩大培养以1 : 2稀释传代，每2〜
3天传代一次。细胞的倍增时间为 16〜20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴
壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
二 材料：
1. 试剂：
（ 1 ）培养基 杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有 RPMI-1640 或 DMEM（Dulberco
Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤 除菌
（0.22um滤膜），分装，4 C保存。
不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液 96ml,100 X L.G.溶液1ml，双抗溶液 1ml,
7.5% NaHCO溶液 1-2ml , HEPES溶夜 1ml。
不完全 DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水 980ml, NaHCO3.7g , 100X L.G. 溶液
10ml，双抗溶液10ml , 7.5% NaHCO溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤 除菌，分装
4C保存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全 RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血 清
15-20ml ,用于骨髓瘤细胞 SP2/0 和建株后杂交瘤细胞培养。
（2） 小牛血清灭活：从-20 C冰箱取出小牛血清，室温自然融化， 56C 30min即可充分 灭
活，分装小瓶（5ml/瓶）,-20 C冻存备用，尽量避免反复冻融。
（3） 青、链霉素（双抗）溶液（100X ）取青霉素 G （钠盐）100万单位和链霉素（硫酸 盐）
1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（ 4-5ml/瓶），-20 C 冻
存。
2. 器材 ：
超净工作台、CQ恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、 10ml吸管、
100ml 细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等
三 方法 ：
细胞冻存及复苏
先用 24 孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株, 当长满时, 再扩大到 100ml 细胞
瓶。当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含 10% DMS0 40% FCS的
DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成 1-3 X 10
6
个/ml,每个细胞冻存管分装 1ml，移至液氮罐 口悬吊
2小时或-70 C冰箱过夜，然后沉入液氮中。复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置 入40C水浴中，
在1min内融化，1500rpm离心5min,弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮 细胞,移入 24 孔板中培
养
。
四、细胞培养应注意事项
1. 细胞培养瓶、吸管：使用前要严格消毒,对于新购置或已经使用的玻璃器皿,一般先用 先用 0.1%
新洁而灭浸泡 24小时,再用自来水清洗,晾干,然后放置酸缸浸泡 24小时,带 胶手套,捞起,用自来水
将酸液冲洗干净（一般冲洗 8-10 次）,用去离子水浸泡 12小时, 再用超纯水浸泡 12 小时，捞起烘
干，细胞瓶用锡铂纸包扎瓶口，吸管塞上绵花，装入吸管
桶内，165.5 C干热灭菌2-3小时，待冷却后，转入消毒柜里备用。
2. 培养基：大多数实验室采用的基础培养基是
DMEM或 RPMI-1640,按厂家规定的方法配制
一般不会出问题。 但是配制培养基的水的质量和血清添加成分是影响融合最重要的培养基素 因各地
水质差异很大， 所以至少应用三蒸水或四蒸水， 并定期检查制成的纯水质量。 国内实 验室大多采
用新生犊牛血清配制培养基， 不同来源和不同批次的血清支持杂交瘤生长的差异 很大，应筛选出好
的血清供作配制融合后选择性培养的 HAT培养基。
准备重组药物的实验：
1、 配制 AMPLB固体培养基 600ml，倒 AMPLB平皿20个
2、 AMPLB液体培养基400ml
3、 空的试管 20支
4、 1.5ml EP 管 1 盒
将以上灭菌。
附：LB培养基配方： 胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L 酵母提取物 (Yeast extract) 5g/L 氯化钠
(NaCl) 10g/L 另外根据经验值用 5mol/LNaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4。
LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并 且倒好
板。
LB 固体培养基倒板
① 配制： 100ml LB 培养基加入 1.5g 琼脂粉
② 抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB固体培养基置与 55C的水浴中，待培养
基温度降到55C时(手可触摸)加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
③ 倒板：一般 20ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后,打开盖子,在紫外下照 10-15 分钟。
④ 保存：用封口胶封边，并倒置放于 4C保存，一个月内使用。
抗生素终浓度 Amp 100ug/ml