cDNA文库的构建和筛选
名词解释cdna文库
CDNA 文库
CDNA 文库是一种 cDNA(互补 DNA) 文库，它包含了生物体中所有基因的 mRNA 转录本的互补 DNA 序列。
在 CDNA 文库中，mRNA 被逆转录成 cDNA，然后被克隆到载体中，最终形成一个包含所有基因信息的文库。
CDNA 文库的构建过程通常包括以下步骤:
1. 从生物组织中提取 mRNA，并去除 rRNA 和 tRNA 等非编码RNA。
2. 将 mRNA 逆转录成 cDNA，使用逆转录酶将 mRNA 转录成cDNA，并在此过程中添加适配体，以产生特定长度的 cDNA 片段。
3. 将 cDNA 片段连接到载体上，通常使用质粒载体。
4. 将连接好的载体转化到大肠杆菌中，并筛选出阳性克隆。
5. 对阳性克隆进行测序和分析，以确定其序列信息。
CDNA 文库在基因组学研究中具有广泛的应用，例如:
1. 基因克隆：通过 CDNA 文库，可以克隆出感兴趣的基因，并对其进行进一步的研究。
2. 基因表达分析：通过比较不同组织或条件下的 CDNA 文库，可以分析基因的表达情况，了解基因在生物体内的功能和调控机制。
3. 基因组测序：通过 CDNA 文库，可以对生物体的基因组进行测序，以确定其基因组序列信息。
cdna文库的构建步骤
cdna文库的构建步骤CDNA文库是基因组学和转录组学研究中非常常见的技术，它可以用来快速鉴定不同组织或不同生长条件下基因表达的变化情况。
下面将介绍CDNA文库的构建步骤。
一、RNA提取RNA提取是构建CDNA文库的第一步，它是从不同组织或生长条件下采集的样品中提取出RNA。
RNA提取需要注意以下几点：1. 样品必须在冰上保存，并尽可能快地进行处理。
2. RNA提取要使用无菌工具和试剂，并严格遵守操作规程。
3. RNA提取要避免DNA污染，可使用DNase对RNA进行处理。
4. RNA质量要进行检测，以保证后续实验的可靠性。
二、反转录反转录是将RNA转化为cDNA的过程。
反转录需要注意以下几点：1. 反转录试剂必须新鲜，并且使用前应该预先热处理。
2. 反转录反应时间和温度要根据实验需求进行调整。
3. 可以选择使用随机引物或寡聚dT引物作为反转录引物。
三、二代测序前的PCR扩增PCR扩增是将cDNA扩增为足够的量以进行二代测序的过程。
PCR扩增需要注意以下几点：1. PCR反应体系要严格控制，避免引物和模板过量。
2. PCR反应时间和温度要根据实验需求进行调整。
3. 可以选择使用高保真PCR酶，以保证扩增产物的准确性。
四、文库构建文库构建是将PCR扩增产物连接到载体上，形成完整的CDNA文库的过程。
文库构建需要注意以下几点：1. 选择合适的载体，如pBluescript II SK+、pUC19等。
2. 连接PCR扩增产物时要控制连接比例，避免连接过多或过少。
3. 连接后可以进行转化、筛选和纯化等步骤，得到CDNA文库。
五、二代测序二代测序是对CDNA文库进行高通量测序的过程。
二代测序需要注意以下几点：1. 选择合适的平台和测序模式，如Illumina HiSeq、NovaSeq等平台。
2. 测序深度要根据实验需求进行调整，以保证数据质量和覆盖度。
3. 测序后得到原始数据后，需要进行质控、去除低质量数据、拼接等步骤，得到高质量的测序数据。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线以cdna基因文库构建的基本路线为标题的文章概述CDNA基因文库是基因组学研究中的一个重要工具，可以用于克隆和表达特定基因。
本文将介绍构建cdna基因文库的基本路线，包括RNA提取、逆转录、cDNA合成、文库构建和筛选等步骤。
第一步：RNA提取构建cdna基因文库的第一步是从所研究的生物样品中提取总RNA。
这可以通过使用商业化的RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿法等方法来实现。
在提取RNA的过程中，需要注意样品的保存和处理，以确保所提取的RNA完整无损。
第二步：逆转录逆转录是将RNA转化为相应的cDNA的过程。
逆转录反应通常使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）进行，该酶能够将RNA模板上的信息转录成DNA。
在逆转录反应中，需要加入随机引物、dNTPs和逆转录酶，以及适当的缓冲液。
逆转录反应的温度和时间也需要根据具体的逆转录酶和反应体系进行优化。
第三步：cDNA合成在逆转录反应完成后，需要对产生的cDNA进行纯化。
一种常用的方法是通过酶切和连接反应，将cDNA连接到载体上，形成重组DNA，再通过转化等方法将其导入到大肠杆菌等宿主中。
在cDNA 合成的过程中，需要注意对cDNA的纯化和测序质量的控制，以确保所获得的cDNA具有高质量和完整性。
第四步：文库构建文库构建是指将cDNA插入到合适的载体中，形成cdna基因文库。
常用的载体包括质粒和噬菌体等。
在文库构建的过程中，需要对cDNA和载体进行受限酶切，然后使用DNA连接酶将其连接起来。
连接后的DNA需要进行转化，将其导入到适当的宿主细胞中，形成文库。
不同的文库构建方法有所差异，可以根据实验需求选择合适的方法。
第五步：筛选构建cdna基因文库后，需要对文库进行筛选，以寻找感兴趣的基因。
常用的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选和基于功能的筛选等。
根据所研究的基因或表达产物的特性，可以选择合适的筛选方法。
筛选后的阳性克隆可以进一步进行测序和鉴定，以确认所克隆的基因的准确性和完整性。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达和功能的调查。
本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线，包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。
一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前，需要准备一些实验材料和试剂。
主要包括：1. 细胞或组织样品：可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。
2. 细胞破碎液：用于细胞破碎和RNA保护，常用的有三种类型：TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。
3. 反转录试剂盒：包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。
4. 克隆载体：用于构建基因文库的载体，常用的有质粒载体和噬菌体载体。
5. 细菌培养基和抗生素：用于细菌的培养和筛选。
二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步，目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。
常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。
提取的RNA应具有较高的纯度和完整性，以保证后续的反转录和文库构建质量。
三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。
在这一步中，需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应，合成cDNA。
反转录的条件包括温度、时间和反应体系等，需要根据试剂盒的说明进行操作。
四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。
一般采用PCR扩增的方法，在反应中加入适量的引物和dNTPs，进行多轮扩增，最终得到足够量的双链cDNA。
合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。
五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。
常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。
在构建文库的过程中，需要将双链cDNA与克隆载体进行连接，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中，得到大量的重组质粒。
六、筛选构建完基因文库后，需要进行筛选以获得感兴趣的基因。
cdna文库的构建和测序方法
cdna文库的构建和测序方法**CDNA Library Construction and Sequencing Methods**The construction of a cDNA library is a fundamental technique in molecular biology, enabling researchers to isolate, clone, and study specific genes. The process begins with the isolation of mRNA from a target cell or tissue. This mRNA is then reverse-transcribed into cDNA using a reverse transcriptase enzyme. The resulting cDNA fragments are subsequently cloned into a suitable vector, such as a plasmid or bacteriophage, to form a recombinant DNA molecule. These recombinant molecules are then introduced into host cells, typically bacteria, for amplification and storage.cDNA文库的构建是分子生物学中的一项基础技术，它使研究者能够分离、克隆和研究特定的基因。
该过程始于从目标细胞或组织中分离出mRNA。
随后，使用逆转录酶将这种mRNA逆转录成cDNA。
接着，将得到的cDNA片段克隆到合适的载体中，如质粒或噬菌体，形成重组DNA分子。
然后，这些重组分子被引入宿主细胞，通常是细菌，进行扩增和保存。
**Sequencing of cDNA Library**Once the cDNA library is constructed, sequencing becomes the next crucial step. Sequencing technologies have evolved significantly in recent years, with next-generation sequencing (NGS) platforms becoming increasingly popular. NGS allows for high-throughput sequencing, generating millions of reads in a short time. Thesereads are then aligned to a reference genome or transcriptome, enabling the identification and analysis of individual genes and gene expression patterns.cDNA文库构建完成后，测序成为下一个关键步骤。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
构建cdna文库的基本步骤
构建cdna文库的基本步骤《构建cDNA文库的基本步骤》引言：cDNA文库的构建是基因组研究中重要的实验技术之一，它可以利用转录酶逆转录RNA为cDNA，然后将其插入适当的载体中，最终形成一个具有表达能力的基因文库。
本文将介绍构建cDNA文库的基本步骤。
一、总RNA的提取首先，需要从细胞或组织中提取总RNA，并保证RNA的完整性和纯度。
常用的提取方法包括酚/氯仿法、硅胶柱法等。
提取得到的总RNA可以用琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
二、逆转录反应逆转录反应是将RNA逆转录为cDNA的过程。
在逆转录反应中，需使用逆转录酶、引物和核苷酸等。
逆转录酶能合成第一链cDNA，引物通常采用寡聚dT引物或随机引物。
三、DNA合成和连接在逆转录反应后，需要使用DNA聚合酶和核苷酸进行第二链cDNA的合成。
然后，将合成的cDNA连接到选择的载体上，常见的载体有质粒、噬菌体等。
连接过程一般采用连接酶催化反应。
四、转化和筛选将连接好的载体转化到合适的宿主细胞中，可以通过热冲击法、电穿孔法等方法进行转化。
之后，将转化后的细胞涂在筛选板上，并在含有抗生素的培养基上筛选，筛选出含有目标基因的克隆。
五、鉴定和分析最后，对构建好的cDNA文库进行鉴定和分析。
可以利用限制性内切酶等方法进行单克隆检测和鉴定，也可以通过PCR扩增目标基因进行进一步分析。
结论：构建cDNA文库是一项关键的技术，它为基因组研究提供了丰富的资源。
通过提取总RNA、逆转录反应、DNA合成和连接、转化和筛选，最终可以得到一个具有表达能力的cDNA文库。
这些步骤的顺利进行和准确操作，对于后续的基因组研究具有重要意义。
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
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A、用已知氨基酸序列来获得简并序列
某些基因编码的蛋白质的性质已知 通过氨基酸序列反推核苷酸序列
Bait plasmid
AD gene prey gene
prey plasmid
Gal4 Bait (X)BD 结合 operator 域
BD gene
Bait gene
LacZ
Repoter gene
Gal4 Prey (Y)AD 激活
operator
域
LacZ
Repoter gene
Bait plasmid
第一节：将mRNA转变成cDNA
二、cDNA 的合成 A、用polyT作为引物
mRNA G U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAA
cDNA
Reverse transcriptase
TTTTTTTTTTTTTTT
逆转录polyT引物
B、基因特异的引物
C、随机引物
第一节：将mRNA转变成cDNA
C、利用同源基因中的目标基因序列
用不同来源的DNA分子制备成探针进行检测。 如：用来自鼠的基因A去检测人类中基因A 或基因家族中成员A去检测成员B
D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针
差示杂交P112 表达目标基因
不表达目标基因
提取
RT反应获
提取
RT反应mR制10-15%. 将mRNA 中的
信息翻译成氨基酸（携带正确的氨基酸）
mRNA特点
信使RNA的表达在生物体内具有组织和时空特异 性。因此， mRNA对于了解细胞中的信息流非常
重要. • Size – examine differential splicing（
检测可变剪接） • Sequence – 预测蛋白产物 • Abundance – 检测表达水平 • Dynamics of expression – （1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋
白称诱饵蛋白（bait）； （2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的
蛋白称靶蛋白（prey）； （3）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。 C、酵母双杂系统的工作原理
BD gene Bait gene
AD gene prey gene
prey plasmid
诱饵与靶蛋白之间 的相互作用激活了 报告基因的表达
Gal4激活 Prey (Y)AD Gal域4 Bait (X)BD
结合 operator
LacZ
Repotep-
Gal4
BD X
• 水相在上层 (contains total 乙醇沉吸R淀取NRNA上A)并清用至水新重管新溶解
• 洗白破碎物以及大片段的基因 组DNA在两相界面
用层析柱分离总 RNA
Lyse cells, and spin to remove large particulates/cell debris
Apply lysate (containing nucleic acids and cellular contaminants) to column with glass
DNA
2´ H (deoxyribose)
Thymine binds Adenine (A,T,C,G)
Multiple types and roles One biological form
Often permanently modified Permanently modifications
via splicing
are rare (mutation)
Usually single-stranded Double stranded
Intermolecular binding Double helix structure
第一节：将mRNA转变成cDNA
一、mRNA的分离纯化 RNA在体内具有容易被内切核酸酶（RNase）降解
➢局限性：
表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与
天然状态不符，造成结果的不准确
本身就具有转录激活活性 的兴趣蛋白
不适合于该系统
不能定位于核内 的兴趣蛋白不适合于
该系统
需要翻译后修饰的蛋白 不适合该系统
第五节：体外克隆编码细胞内信号蛋白的 基因
研究目的 鉴定突变体细胞中编码蛋白酶的cDNA克隆 研究基础以及原理备标
记的cDNA 转
转 记的cDNA
膜
膜
杂交获得杂交信号
杂交获得杂交信号
目标基
D、利用差异表达基因的扣除cDNA探 针
扣除杂交P112
A B 剪C 切
A C 用生物素标记
变性、退火
和杂交
B基白质与蛋白质之
以及自然降解的特性。分离以及保存RNA需针对 上述特点进行。 加入RNase抑制剂
RNA 分离
RNA 分离
• Total RNA from biological samples
– Organic extraction – Affinity purification
• mRNA from total RNA – Oligo(dT) resins
酵母双杂交技术 噬、噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因
或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因 的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋 白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳 蛋白融合表达。 B、融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬 菌体表面。 C、被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间 结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。
➢优点：
根据兴趣蛋白的基因序列 即可筛选与
其作用的目的蛋白
蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，
蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况 ，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被 检测出来
可以直接获得目的蛋白的基因序列，从
而可以初步判断目的蛋白的结构和功能 。
酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)
翻译
三、研究策234578
G
H K
I L
J
自动 制备 质粒
体外 翻译
A B CD E F G H I
1
JKL
2
3
4
5
6 7 8
检测荧 光信号
突变 体细 荧胞光提反 应取底物物
• mRNA的 3’ 末端具有polyA 尾巴 • Oligo(dT) 探针用于分离总RNA中的mRNA • mRNA can be eluted from oligo(dT) matrix using water or low-salt buffer
Messenger RNA Isolation
membrane
用乙醇洗涤柱子，核酸结合在柱子上，其他物质 从侄子中流出。用 DNase 处理污染的DNA
Apply water to the column; purified RNA washes off
the glass and is collected
Messenger RNA Isolation第三节 cDNA表达的筛选2 酵母双杂交系统 原理
A、转录激活因子GAL4
✓ N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)
✓ C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
✓ GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则 能激活UAS下游的基因进行转录
第一节：将mRNA转变成cDNA
三、cDNA克隆载体 1、根据不同的筛选策略选择 不同的载体 质粒载体：用功能测定的方法进行筛选 噬菌体载体：分子杂交或抗体筛选。 2、噬菌粒载体：是一类人工构建的含有
单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒 复制子、克隆位点、标记基因的特殊类 型的载体。
COOH
+
共转化
?
Gal4
AD cDNA COOH Leu-
Gal4
BD
X
Promoter
cDNA library
Gal4
AD Reporter
酵母双杂交系统的小结
➢用途：
快速筛选与一种已知蛋白结合的目的蛋白，发现新 基因
验证 已知蛋白间的相互作用及作用强度
酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)
TGG-GAT/C-GAA/G-AAT/C-AAT/C-ATG 进行至少两轮的筛选才能获得阳性的克隆
B、利用抗体进行杂交
免疫学筛查：检测克隆基因编码的蛋白 免疫学筛查所需要的抗体 免疫学筛查首先获得抗原
抗原 一 抗
二酸序列
发育阶段和组织的特异性。
第一节：将mRNA转变成cDNA
cDNA：与mRNA互补的DNA，称为cDNA。 由某个生物体的某个器官或组织mRNA反
转录形成的总cDNNA
2´ OH group (ribose)
Uracil binds Adenine (A,U,C,G)
三、cDNA克隆载体
它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质 粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的 复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬 菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬 菌粒同时具有噬菌体和质粒的特征，可 以像噬菌体或质粒一样复制。。
优点：1.双链DNA既稳定又高产，具有 常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁 琐又费时的步骤；3.由于载体足够小， 故可得到长达10kb的外源DNA区段的单 链。
• mRNA from biological samples – Oligo(dT) resins