酶切原理
实验六-酶切
五、利用限制性内切酶克隆
克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设
计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同 酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸 露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加 上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对 其识别位点进行有效切断。 酶切位点（内切酶的识别序列）要加在引物的 5‘端 具体为：5'-保护碱基+酶切位点+引物序列-3'
四、使用限制酶注意事项
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进
一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸 管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各 自的最适盐浓度。 若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。 若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先 使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。 也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1 倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后臵-70℃低温 冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶 切反应。
割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。
第二类内切酶
酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸
识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴
同尾酶；切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的 一类限制性内切酶。
这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相
同的粘性末端。 由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补 作用彼此连接起来的。当把同尾酶切割的DNA片断与原来的限 制性内切酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在， 不能被原来的限制性内切酶所识别。
酶切原理
一、DNA的限制性酶切实验原理 DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型 根据限制酶的识别切割特性， 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ 型三大类。 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 第一类（ 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序 能识别专一的核苷酸顺序， 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它 们在识别位点很远的地方任意切割DNA DNA链 们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA DNA重 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克 DNA 隆基因。 隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
材料、 三 材料、设备及试剂
质粒 ：pUC118、pEGFP 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式 高速离心机， 电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、微波炉 试剂： 试剂：琼脂糖 、TAE电极缓冲液、Lamdar DNA EcoR I /HindⅢ 、 EB 、 加样缓冲液
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
平头末端： 平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双 链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ | 3’…… CTA|TAG …… 5’ | 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
一、DNA的限制性酶切实验原理 DNA的限制性酶切实验原理
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
酶切原理及步骤
酶切原理及步骤一、酶切原理1.酶切反应酶切反应是指使用酶作为催化剂，对底物进行切割或降解的反应。
在酶切反应中，酶的活性中心与底物特异性结合，通过催化作用将底物分解成小分子片段。
2.酶切位点酶切位点是指酶与底物特异性结合的部位。
不同的酶具有不同的酶切位点，通常由特定的氨基酸序列组成。
3.酶切动力学酶切动力学描述了酶切反应的速度和底物浓度之间的关系。
在一定条件下，当底物浓度高于某一阈值时，反应速度将达到最大值。
二、酶切步骤1.酶液准备在进行酶切实验前，需要准备适量的酶液。
根据实验需求选择合适的酶种类和浓度。
通常，酶液需要在冰箱中冷藏保存。
2.样品准备将待测样品进行预处理，以便与酶液混合后进行反应。
样品处理方法因实验而异，常见的处理方法包括细胞破碎、蛋白质提取等。
3.酶切反应设置将准备好的酶液和样品混合，加入适量的缓冲液（如pH 7.4的Tris-HCl缓冲液），设置反应温度和时间。
4.酶切反应温度和时间设置根据所选酶的活性要求和实验条件，设置适宜的反应温度和时间。
通常，适宜的反应温度为37℃，反应时间因底物种类和浓度而异。
5.反应终止和产物检测在反应结束后，需要终止反应并检测产物。
常用的终止方法包括加入酚/氯仿抽提、加热或加入抑蛋白剂。
产物检测方法因实验而异，常见的检测方法包括蛋白质印迹、电泳、光谱分析等。
三、酶切实验设计1.酶种选择2.根据实验需求选择合适的酶种类。
不同的酶具有不同的特异性，需要根据目标蛋白质序列选择具有相应酶切位点的酶。
同时还需要考虑所选酶的活性、稳定性和安全性。
3.实验条件优化在进行酶切实验前，需要对实验条件进行优化。
主要包括底物浓度、缓冲液pH值、离子强度、反应温度和时间等方面的优化。
通过调整实验条件可以提高产物的产量和质量。
4.产物检测方法选择根据实验需求选择合适的产物检测方法。
常用的检测方法包括蛋白质印迹、电泳、光谱分析等。
需要根据目标产物性质选择适宜的检测方法以便于后续分析。
质粒DNA的酶切和PCR
发现使PCR技术能够广泛地应用于各个相关
领域。
• 平常放负20℃保存，用时候放在冰上。
质粒DNA的酶切实验步骤
• 酶切体系(20ul)
DNA（质粒） 8.0 ul
10×Buffer 2.1 2.0 ul
EcoRI
0.5 ul
BamHI
0.5 ul
ddH2O
9.0 ul
20ul 5 ul × 10 体系 5 ul 90ul
实验说明
• EcoRⅠ是从大肠杆菌R菌株中分离出来的第一 个限制酶,酶切序列为 ,形成黏性末端。
• BamHⅠ由淀粉芽孢杆菌产生,它也是一种限
制酶，酶切序列为5' G^GATCC 3‘ 3' CCTAG^G5'
,
形成黏性末端。
• Taq酶即DNA聚合酶，是来源于高温嗜热菌，
其最大的特点就是高温下不失活，Taq酶的
每管12.0 ul分装
加完体系后，将离心管放入水浴锅37℃， 3h左右即可。
PCR体系和程序
PCR体系（20ul）
DNA（质粒）
1.0 ul
ddH2O 引物（M13 F） 引物（M13 R）
dNTP 10×PCR Buffer Mg2+（MgCl2） Taq酶 (最后加)
14.0 ul 0.5 ul 0.5 ul
实验二：质粒DNA的酶切和PCR
2015.11.10
• 1 酶切原理 • 2 PCR原理 • 3 实验说明 • 4 注意事项
酶切原理
质粒DNA
酶切
PCR原理
• 聚合酶链反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction，简 称PCR）。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分 子生物学技术，可看作生物体外的特殊DNA复制，PCR的 最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
酶切反应原理
酶切反应原理酶切反应原理酶切反应是一种广泛应用于生物学、分子生物学、基因工程等领域的技术。
它是利用特定的酶对DNA分子进行切割，从而实现DNA分子的特定序列分离和提取的方法。
本文将详细阐述酶切反应的原理。
一、DNA结构为了更好地理解酶切反应的原理，首先需要了解DNA结构。
DNA是双链螺旋结构，由四种碱基（腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G和胞嘧啶C）组成。
两条链通过氢键相互配对，A与T形成两个氢键，G 与C形成三个氢键。
这种稳定的配对方式保证了DNA分子在遗传信息传递中的准确性。
二、限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别和切割DNA特定序列的酶。
它们广泛存在于细菌和古菌中，并且具有高度的特异性和高效率。
目前已经发现了数百种限制性内切酶，并且不同种类之间具有不同的切割位点和切割方式。
三、酶切反应酶切反应是一种利用限制性内切酶对DNA分子进行特异性切割的方法。
在酶切反应中，首先需要选择一种合适的限制性内切酶，并确定其特定的切割位点。
然后将待处理的DNA分子与该限制性内切酶一起加入反应体系中，经过一定时间后，DNA分子会被该限制性内切酶在特定位点上进行断裂。
四、DNA片段在酶切反应中，被限制性内切酶识别和断裂的DNA分子称为DNA片段。
根据不同的限制性内切酶和不同的DNA分子，可以得到不同大小和不同序列的DNA片段。
这些DNA片段可以通过电泳等方法进行分离和提取，从而实现对特定序列的精确检测和分析。
五、应用由于其高度的特异性和高效率，酶切反应已经成为现代生物学、分子生物学、基因工程等领域中最为重要和常用的技术之一。
它被广泛应用于基因克隆、基因组测序、PCR扩增、DNA指纹鉴定等方面，为人类认识生命、治疗疾病和改善人类生存环境做出了巨大贡献。
六、总结酶切反应是一种利用限制性内切酶对DNA分子进行特异性切割的方法。
它通过选择不同的限制性内切酶和不同的DNA分子，可以得到不同大小和不同序列的DNA片段，从而实现对特定序列的精确检测和分析。
基因工程酶切实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握基因工程中常用的酶切技术；2. 掌握DNA酶切实验的基本操作步骤；3. 熟悉DNA酶切反应的原理及影响因素。
二、实验原理DNA酶切实验是基因工程中的重要技术之一，通过限制性核酸内切酶（RE）对DNA 分子进行切割，产生具有特定黏性末端或平末端的DNA片段。
这些DNA片段可用于后续的基因克隆、基因表达等实验。
限制性核酸内切酶（RE）是一种能够识别并切割特定DNA序列的酶，其识别序列通常由4-6个核苷酸组成。
根据酶切位点的不同，RE可分为三类：I类、II类和III 类。
其中，II类RE是最常用的酶切酶，具有高度特异性和稳定性。
三、实验材料1. DNA模板：提取自细菌、动物或植物细胞的总DNA；2. 限制性核酸内切酶（RE）：根据目的基因序列选择合适的酶切酶；3. 10×酶切缓冲液；4. dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）；5. Taq DNA聚合酶；6. 1×PCR缓冲液；7. 25℃反应体系；8. 灭菌水；9. 1.5%琼脂糖凝胶；10. 电泳仪；11. DNA回收试剂盒。
四、实验步骤1. DNA酶切反应：取2μl DNA模板，加入4μl 10×酶切缓冲液、2μl RE、2μl dNTPs、4μl Taq DNA聚合酶和2μl灭菌水，混匀后置于PCR仪上，进行酶切反应。
反应条件根据酶切酶说明书进行调整。
2. PCR扩增：取酶切反应产物，加入2μl 1×PCR缓冲液、2μl Taq DNA聚合酶、2μl dNTPs、2μl 10×PCR缓冲液和4μl灭菌水，混匀后置于PCR仪上，进行PCR扩增。
扩增条件根据目的基因序列和酶切酶说明书进行调整。
3. 琼脂糖凝胶电泳：将PCR扩增产物加入1.5%琼脂糖凝胶中，进行电泳分离。
根据DNA分子大小，调整电泳电压和时间。
4. DNA回收：将凝胶中的目的DNA片段用DNA回收试剂盒回收，得到纯化的DNA片段。
DNA的限制性酶切实验原理
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一、DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它 们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制
与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13
噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
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二、琼脂糖凝胶电泳实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具 有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓 度。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物， 其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估 计样品DNA浓度。
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琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。
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