细胞毒实验
医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验
医疗器械生物学评价第 5 局部：体外细胞毒性试验1范围GB/T 16886 的本局部阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。
这些方法规定了以下供试品以直接或通过集中的方式与培育细胞接触和进展孵育；a〕用器械的浸提液，和／或b〕与器械接触。
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反响。
2标准性引用文件以下文件中的条款通过GB/T 16886 的本局部的引用而成为本局部的条款。
但凡注日期的引用文件，其随后全部的修改单〔不包括订正的内容〕或均不适用于本局部，然而，鼓舞依据本局部达成协议的各方争论是否可使用这些文件的最版本。
但凡不注日期的引用文件，其最版本适用于本局部。
GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1 局部：评价与试验〔GB/T 16886.1-2023,idt ISO 10993- 1:1997〕CB/ T 16886. 12-2023 医疗器械生物学评价第12 局部：样品制备和参照材料〔idt ISO 10993-12 :1996〕3术语与定义GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1 中确立的以及以下术语和定义适用于本局部。
3.13.2 阴性比照材料negative control material依据本局部试验时不产生细胞毒性反响的材料。
注：阴性比照的目的是验证背景反响，例如高密度聚乙烯1〕牙科材料的阴性比照物。
阳性比照材料 pos itive control material依据本局部试验时可重现细胞毒性反响的材料。
已作为合成聚合物的阴性比照材料，氧化陶瓷棒则用作注：阳性比照的白目的是验证相应试验系统的反响，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯的阳性比照，酚的稀释液用于浸提液的阳性比照。
2）已用作固体材料和浸提液1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会〔Rockvillie, Maryland, USA〕和Hatano 争论所食品和药品安全中心〔Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan〕获得。
细胞毒性实验总结
细胞毒性实验总结一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识 (1)二、细胞毒性实验方案的确立 (3)三、细胞毒性实验方法稳定后的部分数据 (4)四、细胞毒性实验质量评价指标 (5)五、细胞毒性实验SOP (6)（一）目的 (6)（二）适用范围 (6)（三）责任人 (6)（四）规程 (6)1. 试验准备 (7)2. 试验操作 (8)3．数据处理和分析 (8)六、总结 (9)一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识细胞毒性是化学物质（药物）作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应。
按作用机制可分3种类型：①基本细胞毒性，涉及一种或多种上述结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞；②选择细胞毒性，存在于某些分化细胞上，主要通过化学物质的生物转化，与特殊受体结合或特殊的摄入机制所引发；③细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。
类似毒性作用可通过细胞因子、激素和递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或特殊的转运过程而实现。
毒性作用也可能来自化学物质对细胞外过程的干扰，任何一种非动物检测系统对多种因素都应加以考虑。
1983年Ekwall提出“基本细胞功能”的概念，即多数化学物质毒性作用是对细胞功能的非特异性损伤，却可引起器官功能的特异性改变甚至机体死亡。
有研究显示化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好的相关性。
化学物质产生的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变，由此推测体外细胞毒性可以预测体内急性毒性。
体外方法有助于预测化学物质急性暴露引发的全身和局部影响，并评估体内毒性浓度。
目前较为理想的抗HBV药物有拉米夫定（3TC）、恩替卡韦（ETV）等。
3TC是核苷左旋对呋体，早期用于艾滋病的治疗。
细胞毒性实验步骤-3
细胞毒性实验步骤一、样品准备准备规则尺寸样品，平行样≥3个。
所有样品采用75%酒精杀菌消毒how？，烘干后紫外照射how long？，灭菌处理。
二、浸提液制备样品灭菌后按照1.25cm2/mL（1cm2/mL、3cm2/mL）比例加入含10%小牛血清和100U/ml 双抗（青霉素和链霉素）的DMEM，置于37℃，5%CO2培养箱内培养24h（72h）得到浸提液，0.22μm微孔滤膜除菌后备用。
三、实验分组样品浸提液为实验组，阳性对照组为10%的DMSO（二甲基亚砜），阴性（空白）对照组为含10%小牛血清和100U/mL双抗的DMEM。
实验组共3（6）个点，分别为24h（72h）浸提液各培养1、3、5天。
四、L929细胞浓度选择及细胞计数选择生长状态良好的细胞用PBS冲洗三次，2.5g/L胰蛋白酶消化后离心，制备不同浓度的细胞悬液（1×103/mL、1×104/mL、2×104/ mL、3×104/ mL、1×105/ mL）。
细胞计数：将细胞悬液滴在细胞计数板上，盖上盖玻片（从一头压到另一头，防止气泡产生），在显微镜下计数，数计数板上四个角上四个区域所含细胞总数X，细胞浓度为X/4×104 /ml。
五、细胞形态观察和细胞毒性测定将配好浓度的细胞悬液加入3块96孔板，3块培养板分别编号1天、3天、5天，每孔100μL（根据实验组计算好加入量，每种金属浸提液对应8-16孔细胞悬液），37℃ , 5 % CO2条件下培养24h，待细胞贴壁生长后弃去原培养液，PBS冲洗3遍后分别加入实验组24h、（72h）浸提液、阳性对照组10%的DMSO、阴性对照组含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM,，每孔100μL继续培养。
1、3、5天各取一块培养板在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。
每孔加入10μL MTT后继续培养4h，小心抽出每孔内浸提液，每孔加入150 μL DMSO. 水平振荡器（脱色摇床）振荡培养板10min，570nm波长下用自动酶标检测仪上测定各孔OD值。
免疫学实验：NK细胞毒检测
·12·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数(cpm)， 即可计算出NK细胞毒活性。
·13·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
·14·
乳酸脱氢酶释放法
免疫学实验
靶细胞 NK YAC-1 杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH 释放到细胞外
无色底物
LDH底物 还 原
测OD570值
有色物质
实验值-自发释放值
杀伤率( %)= Max- S自发
×100
最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值
·2·
主要内容
❖实验分组及材料 ❖实验原理 ❖检测方法 ❖主要操作步骤 ❖结果判定
免疫学实验
·3·
实验分组及材料
免疫学实验
❖ 器材
1. 75%酒精
若干
2. 5ml注射器
1个/组
3. 100ml烧杯
1个/组
4. 无菌纱网
1块/组
5. 无菌平皿
1块/组
6. 无菌吸头（大、中、小）3盒/room
7. 无菌96孔培养板
❖同位素释放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR
❖乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用)
·11·
同位素释放法
免疫学实验
G0
G1
S
New DNA
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
细胞毒性试验流程
细胞毒性试验流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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T细胞介导的细胞毒试验名词解释
T细胞介导的细胞毒试验名词解释一、引言T细胞介导的细胞毒试验（T cell-mediated cytotoxicity assay）是一种常用的实验室技术，用于研究免疫系统的细胞毒性。
在这篇文章中，我们将对与这项试验相关的重要概念和技术进行解释和探讨。
二、T细胞介导的细胞毒试验的原理在免疫系统中，T细胞是一类关键的免疫细胞，具有细胞毒性，可以直接杀死某些感染细胞或异常细胞。
T细胞介导的细胞毒试验旨在评估T细胞的细胞毒性功能。
该试验通常通过将靶细胞与潜在杀伤细胞（如T细胞）共同培养，并测量细胞死亡的程度来评估细胞毒性。
三、培养条件和试剂需求在进行T细胞介导的细胞毒试验时，需要特定的培养条件和试剂。
培养基是细胞生长必需的营养物质和环境因子的混合物。
典型的培养基包括离心培养基和细胞因子。
离心培养基中包含氨基酸、糖、盐和维生素等成分，提供细胞生长所需的能量和营养。
细胞因子是一类调节细胞生长和功能的蛋白质，其中包括白细胞介素和干扰素等。
四、细胞标记和排序技术为了进行T细胞介导的细胞毒试验，通常需要标记细胞以便于后续的分析和排序。
细胞标记是利用染料、标记剂或荧光素等对细胞进行特异性标记的技术。
常用的细胞标记技术包括免疫荧光染色和共轭抗体标记。
这些技术可以帮助研究人员追踪和鉴定特定的细胞类型，以便于后续的流式细胞术或细胞分选。
五、测量细胞毒性的方法T细胞介导的细胞毒试验常用的方法之一是利用荧光素释放测定法。
这种方法基于细胞膜损伤的原理，通过测量目标细胞释放的荧光素或其他可测量的物质来评估细胞的死亡程度。
另外，还有一些其他的方法，如放射性同位素标记法和荧光光学方法，用于测量细胞的毒性。
六、应用领域和临床意义T细胞介导的细胞毒试验在免疫学和医学研究中具有广泛的应用。
它被用于评估免疫系统对肿瘤细胞的抗肿瘤反应，研究病毒感染等。
此外，该试验还可以用于评估新药的毒性和疗效，为药物研发提供重要的数据支持。
结论T细胞介导的细胞毒试验是一种重要的实验室技术，用于评估T细胞的细胞毒性功能。
医疗器械生物学评价体外细胞毒性试验
【分享】医疗器械生物学评价-体外细胞毒性试验什么是体外细胞毒性试验？体外细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境，检测医疗器械及生物材料接触机体组织后所发生的细胞溶解、抑制细胞生长和其他毒性作用的体外试验。
体外细胞毒性试验是医疗器械生物学评价体系中最重要的检测指标之一，几乎也是医疗器械及生物材料临床应用前的必选项目。
哪些产品需要进行体外细胞毒性试验？与人体接触或植入体内的医疗器械都需要进行细胞毒性试验。
与人体接触的部位包括：1）表面：皮肤，粘膜，损伤表面。
2）外部接入：组织/骨/牙，循环血液。
3）体内植入：组织/骨，血液。
体外细胞毒性试验的目的和意义目的：评级医疗器械和生物材料致细胞毒性反应的潜在性，并预测最终生物体应用时的组织细胞反应。
通过体外细胞培养技术，可检测供试品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、细胞溶解、死亡或其他毒性反应。
意义：可在短时间内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为动物试验的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械及生物材料的研制和应用提供了重要保证。
体外细胞毒性试验依据的相关标准o ISO 10993-5:2009 Biological Evaluation of MedicalDevices -- Part 5: Tests for in vitro Cytotoxicityo GB/T16886.5-2007医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验，GB/T16886是由ISO 10993转化过来的标准o GB/T 16175-2008 医用有机硅材料生物学评价试验方法o GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物试验方法o YY/T0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价第2单元试验方法细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法细胞系和培养基的选择优先采用已建立的细胞系并从认可的贮源获取。
试验只能使用无支原体污染细胞，使用前应该检测原代培养细胞是否存在支原体。
USP 87 细胞毒性 体外试验
87BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITROThe following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalian cell cultures following contact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or indirect patient contact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specimen cannot be determined, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to prevent contamination with microorganisms and other foreign matter.Three tests are described (i.e., the Agar Diffusion Test, the Direct Contact Test, and the Elution Test).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its intended use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; contacting media; inks; adhesives; absorption, adsorption, and permeability of preservatives; and conditions of storage. Evaluation of such factors should be made by appropriate additional specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its intended use. Materials that fail the in vitro tests are candidates for the in vivotests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88.USP R EFERENCE S TANDARDS 11— USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS.Cell Culture Preparation— Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells inserum-supplemented minimum essential medium having a seeding density of about 105 cells per mL. Incubate the cultures at 37 ± 1in a humidified incubator for NLT 24 h in a 5 ± 1% carbon dioxide atmosphere until a monolayer, with greater than 80% confluence, is obtained. Examine the prepared cultures under a microscope to ensure uniform, near-confluent monolayers. [NOTE—The reproducibility of the In Vitro Biological Reactivity Tests depends upon obtaining uniform cell culture density. ]Extraction Solvents—Sodium Chloride Injection (see monograph—use Sodium Chloride Injection containing 0.9% of NaCl). Alternatively, serum-free mammalian cell culture media or serum-supplemented mammalian cell culture media may be used. Serum supplementation is used when extraction is done at 37for 24 h.Apparatus—Autoclave— Employ an autoclave capable of maintaining a temperature of 121 ± 2, equipped with a thermometer, a pressure gauge, a vent cock, a rack adequate to accommodate the test containers above the water level, and a water cooling system that will allow for cooling of the test containers to about 20, but not below 20, immediately following the heating cycle.Oven— Use an oven, preferably a mechanical convection model, that will maintain operating temperatures in the range of 50–70within ± 2. Incubator— Use an incubator capable of maintaining a temperature of 37 ± 1 and a humidified atmosphere of 5 ± 1% carbon dioxide in air.Extraction Containers— Use only containers, such as ampuls or screw-cap culture test tubes, or their equivalent, of Type I glass. If used, culture test tubes, or their equivalent, are closed with a screw cap having a suitable elastomeric liner. The exposed surface of the elastomeric liner is completely protected withan inert solid disk 50–75 µm in thickness. A suitable disk can be fabricated from polytef.Preparation of Apparatus— Cleanse all glassware thoroughly with chromic acid cleansing mixture and, if necessary, with hot nitric acid followed by prolonged rinsing with Sterile Water for Injection. Sterilize and dry by a suitable process for containers and devices used for extraction, transfer, or administration of test material. If ethylene oxide is used as the sterilizing agent, allow NLT 48 h for complete degassing.Procedure—Preparation of Sample for Extracts— Prepare as directed in the Procedureunder Biological Reactivity Tests, In Vivo 88.Preparation of Extracts— Prepare as directed for Preparation of Extracts inBiological Reactivity Tests, In Vivo 88using either Sodium Chloride Injection (0.9% NaCl) or serum-free mammalian cell culture media as Extraction Solvents. [NOTE—If extraction is done at 37for 24 h in an incubator, use cell culture media supplemented by serum. The extraction conditions should not in any instance cause physical changes, such as fusion or melting of the material pieces, other than a slight adherence. ]Agar Diffusion TestThis test is designed for elastomeric closures in a variety of shapes. The agar layer acts as a cushion to protect the cells from mechanical damage while allowing the diffusion of leachable chemicals from the polymeric specimens. Extracts of materials that are to be tested are applied to a piece of filter paper. Sample Preparation— Use extracts prepared as directed, or use portions of the test specimens having flat surfaces NLT 100 mm2 in surface area. Positive Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Negative Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation.Procedure— Using 7 mL of cell suspension prepared as directed under Cell Culture Preparation, prepare the monolayers in plates having a 60-mm diameter. Following incubation, aspirate the culture medium from the monolayers, and replace it with serum-supplemented culture medium containing NMT 2% of agar. [NOTE—The quality of the agar must be adequate to support cell growth. The agar layer must be thin enough to permit diffusion of leached chemicals. ] Place the flat surfaces ofSample Preparation, Negative Control Preparation, and Positive Control Preparation or their extracts in an appropriate extracting medium, in duplicate cultures in contact with the solidified agar surface. Use no more than three specimens per prepared plate. Incubate all cultures for NLT 24 h at 37 ± 1, preferably in a humidified incubator containing 5 ± 1% of carbon dioxide. Examine each culture around each Sample, Negative Control, and Positive Control, under a microscope, using a suitable stain, if desired.Interpretation of Results— The biological reactivity (cellular degeneration and malformation) is described and rated on a scale of 0–4 (see Table 1). Measure the responses of the cell cultures to the Sample Preparation, the Negative Control Preparation, and the Positive Control Preparation. The cell culture test system is suitable if the observed responses to the Negative Control Preparation is grade 0 (no reactivity) and to the Positive Control Preparation is at least grade 3 (moderate). The Sample meets the requirements of the test if the response to the Sample Preparation is not greater than grade 2 (mildly reactive). Repeat the procedure if the suitability of the system is not confirmed. Table 1. Reactivity Grades for Agar Diffusion Test and Direct Contact TestGrade Reactivity Description of Reactivity Zone0 None No detectable zone around or under specimen1 Slight Some malformed or degenerated cells under specimen2 Mild Zone limited to area under specimen and less than 0.45 cm beyond specimen3 Moderate Zone extends 0.45 to 1.0 cm beyond specimen4 Severe Zone extends greater than 1.0 cm beyondGrade Reactivity Description of Reactivity ZonespecimenDirect Contact TestThis test is designed for materials in a variety of shapes. The procedure allows for simultaneous extraction and testing of leachable chemicals from the specimen with a serum-supplemented medium. The procedure is not appropriate for very low- or high-density materials that could cause mechanical damage to the cells.Sample Preparation— Use portions of the test specimen having flat surfaces NLT 100 mm2 in surface area.Positive Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Negative Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Procedure— Using 2 mL of cell suspension prepared as directed under Cell Culture Preparation, prepare the monolayers in plates having a 35-mm diameter. Following incubation, aspirate the culture medium from the cultures, and replace it with 0.8 mL of fresh culture medium. Place a single Sample Preparation, a Negative Control Preparation, and a Positive Control Preparation in each of duplicate cultures. Incubate all cultures for NLT 24 h at 37 ± 1in a humidified incubator containing 5 ± 1% of carbon dioxide. Examine each culture around each Sample, Negative Control, and Positive Control Preparation, under a microscope, using a suitable stain, if desired. Interpretation of Results— Proceed as directed for Interpretation of Results under Agar Diffusion Test. The Sample meets the requirements of the test if the response to the Sample Preparation is not greater than grade 2 (mildly reactive). Repeat the procedure if the suitability of the system is not confirmed.Elution TestThis test is designed for the evaluation of extracts of polymeric materials. The procedure allows for extraction of the specimens at physiological or。
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实验步骤
• 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣 碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩 余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。
LAK细胞并非是一个独立的淋巴群或亚群，而是NK细胞或T细 胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀 伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细 胞（lymphokine activated killer cells,LAK）。目前应用 LAK细胞过继免疫疗法（adoptive immunotherapy）与直接注 射IL-2等细胞因子联合治疗某些肿瘤，已获得一定的疗效。
(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一
吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。
乳酸脱氢酶释放法
靶细胞 NK
YAC-1
杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH 释放到细胞外
无色底物
LDH底物 还 原
测OD570值
有色物质
实验值-自发释放值
杀伤率( %)=
Max- S自发 ×100
• 细胞计数： 1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中， 混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取 20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 2. 调脾细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为1ml 3. 调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml
抗原与抗体结合
+ 补体
台盼蓝染液
抗体依赖性细胞介导细胞毒实验 （ADCC）：
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用是指表达IgGFc受体的 NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等，通过与已结合在病毒感 染细胞和肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，而杀 伤这些靶细胞的作用，是不同效应细胞群介导的杀伤性效应机 制之一。
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定
细胞毒T淋巴细胞 (CTL)活性测定是研究机体细胞免疫功 能的重要方法之一。传统的51 Cr释放法虽然有效 ,但也 存在某些不足。随着荧光标记、流式细胞分析和报告基 因等技术的广泛应用 ,促进了寻找灵敏可靠、简单易行 的非同位素法测定CTL活性的方法学研究。
淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测 定
同位素释放法
• 应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞， 当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏， 释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损 伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉 冲数 （cpm)，即可计算出NK细胞活性。
同位素释放法
NK细胞
利用测Cr的放射脉 冲得效应细胞活性
行测定。
• 因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的 CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析 和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素 测定法。
MTT（或MTS）还原法
本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细 胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进 入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后 比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可 计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便易行，无需预标靶细胞，与 51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。 MTT类似物MTS在细胞内还原的formazan产物具有水溶性，性质较稳定， 其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假 阳性结果。
细胞毒实验
分类 原理 检测方法 应用
分类
细胞毒检测技术主要根据原理 不同进行区分
补体依赖细胞毒实验
细胞介导细胞毒实验 抗体依赖性细胞介导细胞毒实验（ADCC) 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定 淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测定 肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定
补体依赖的细胞毒实验
系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。
NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗
原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。
YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细
胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。
100ul YAC-1 cells+ 50ul spleen Cells + 50ul 10%1640
100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells + 75ul 10%1640
100ul YAC-1 cells+ 100ul 1% NP-40
100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640
200ul 10% 1640
4-6
7-9
B,C,D
A
实验孔值-自然释放孔值
Max- S自发
×100%
10-12
加 法板
方
Max=E-F S自发=A-G
结果处理
算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐标 为E:T,纵坐标为SI值。
把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用 Excel作的图一起贴到实验记录本上。
• 注： S自发 ＜0，做“0”处理
A
自然释放孔
B
(E:T=100:1）
C
(E:T=50:1）
D
(E:T=25:1）
E
最大释放孔
F
最大释放对照孔
G
培养基对照孔
SI=
1-3
100ul YAC-1 cells+ 100ul 10% 1640
100ul YAC-1 cells+ 100ul spleen Cells
NK细胞分离方法
• 密度梯度离心
Ficoll 密度梯度离心 Percoll密度梯度离心
• 磁化细胞分离器分离法
同位素释放法
同位素释放法
G0
G1
S
New DNA
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值 最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。
• 细胞培养：
1. 按图所示加板。
2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%CO2培养箱中，培养2小时。 • LDH底物：
1. 在培养2小后，1000rpm，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入LDH底物 100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。
1.2.1 PE-mAb/FITC-annexin V 荧光标记法 正常细胞的磷酯酰丝氨（PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡时翻转露于 膜外侧，可与annexinV高亲合力结合。研究发现PS外翻为细胞凋亡的早 期事件，先于膜通透性增加所致51Cr或其他染料的释放。将效应细胞与 靶细胞充分共育后，用PE结合的效应细胞特异性单克隆抗体（如CD8PE）标记效应细胞（不能与PE-mABA结合的细胞即为靶细胞），再用 FITC-annexin V标记凋亡靶细胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同 的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞%。本法①简单快捷，无需 预标记，直接将上二试剂加入测定管即可；②与51Cr法相关性好 （r=0.989），在早期时段更为灵敏，还可在进行分析，尤其适用于动力 学分析；③可允许效应细胞与靶细胞长时间共育，对探讨E通过合成及 分泌某些细胞因子（如TNF）而杀伤靶细胞的机理性研究特别有利；④ 可用荧光显微镜观察测定。
要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及 注意事项。
SI
50 40 30 20 10
0 100:1
Excel 作 图
NK杀伤实验
50:1 E：T
25:1
检测方法
1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法 alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体
酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织 厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组 间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤， 适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不 影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增 细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细 胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞 系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔 即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果
2. 室温避光保存15min。
3. 取出，加入1mol/L柠檬酸， 30l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。
• 结果测定：
1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。
2. 结果判定：
实验孔值-自然释放孔值
SI=
Max- S自发
×100%
• Max （ 靶细胞最大释放）=最大释放孔均值-最大释放对照孔均值 • S自发 （靶细胞自发释放） =自发释放孔均值-培养基对照孔均值
调细胞浓度 7
1×10 /ml
30l /孔 1mol/L柠檬酸