第七章基因的定点诱变
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第七章 定点诱变
3. 重叠延伸PCR诱变法 Overlap extension
对于两个具有部分重叠序列的 DNA 片段，在 经过变性和复性后，两个 DNA 片段之间通过 同源序列形成部分杂合的双链，在 DNA 聚合 酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引 导 DNA 的合成，从而形成杂合 DNA 双链
该方法需要4个引物,
再用通用引物扩增诱变的全长的DNA
5’
3’
3’
5’
4. 重叠延伸剪接法
Splicing by overlap extension, SOE
可用于将两个 DNA 片段在所期望的位点进行连接。 核心:设计一对融合寡核苷酸引物
包括两个步骤：设计一个寡聚体引物，其序列包含两个 部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在 3’ 末端， 起引物作用；重叠部分在 5’ 末端。与待融合的 DNA 片 段序列互补。
（二）位点选择诱变 Altered Sites in vitro Mutagenesis System 使用了2个寡核苷酸引物 一个是用来引入突变的突变引物 一个是用来选择用的
选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗 性基因，同时可用来选择引入突变的DNA链
1.将目的片段克隆到载体 2.得到重组质粒 3.模板DNA碱变性，与突变引物、氨苄青霉素抗性 基因修复引物（amproligo）和四环素抗性基因敲除 引物（tetsoligo）同时退火 4.用T4 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶合成突变链 5.转化大肠杆菌ES1301菌株（mutS），用氨苄青霉 素筛选 6.纯化质粒，转化大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素 筛选 7.必要的话，影印一份平板，鉴定四环素敏感的克 隆子，从而获得突变体 8.再做一轮诱变，修复四环素抗性基因并敲除氨苄 青霉素抗性基因
《定点诱变技术》课件
《定点诱变技术》PPT课 件
本课程将介绍定点诱变技术的原理、实验步骤、应用案例和未来展望，以及 它对人类社会的影响和挑战。
概述
什么是定点诱变技术？
定点诱变技术是一种精准编辑基因术？
传统的基因编辑技术往往是非特异性的，不能达到精准编辑的效果，而定点诱变技术可以 避免对非目标区域的影响。
实验步骤
1
实验前的准备工作
首先需要构建引导RNA分子、购买
细胞培养与转染
2
Cas9核酸酶，以及筛选细胞线等。这 些都需要提前准备。
将引物与Cas9，利用转染技术导入到
目标细胞中，完成复合物的构建。
3
PCR扩增和测序
利用PCR扩增技术检测目标基因组位
置是否发生了修饰，并对其进行测序，
数据分析和结果解读
定点诱变技术的应用领域
定点诱变技术可以应用于基础科研、农业生产、医疗诊断等领域，为人类社会带来了诸多 益处。
基本原理
基于CRISPR-Cas9技术实 现的定点诱变
CRISPR-Cas9技术可以在基因 组中精准识别目标区域，并将 核酸酶Cas9导入到目标位置， 再通过引导RNA分子的作用， 完成对基因组上的目标位点的 修饰。
定点诱变技术可能会带来一系 列的伦理、法律和社会问题， 例如导致人们撕裂不和，社会 不公等问题。
定点诱变技术未来发展 的瓶颈和解决方案
目前，定点诱变技术在某些肿 瘤细胞和人类胚胎细胞中并没 有得到广泛应用，需要进一步 研究，探索更为高效、精准、 安全的定点诱变技术。
4
验证修饰深度和准确性。
对PCR扩增和测序的数据进行分析， 解读实验结果，得出结论，为下一步
的研究提供指导。
应用案例
定点诱变技术在基因 修复中的应用
本课程将介绍定点诱变技术的原理、实验步骤、应用案例和未来展望，以及 它对人类社会的影响和挑战。
概述
什么是定点诱变技术？
定点诱变技术是一种精准编辑基因术？
传统的基因编辑技术往往是非特异性的，不能达到精准编辑的效果，而定点诱变技术可以 避免对非目标区域的影响。
实验步骤
1
实验前的准备工作
首先需要构建引导RNA分子、购买
细胞培养与转染
2
Cas9核酸酶，以及筛选细胞线等。这 些都需要提前准备。
将引物与Cas9，利用转染技术导入到
目标细胞中，完成复合物的构建。
3
PCR扩增和测序
利用PCR扩增技术检测目标基因组位
置是否发生了修饰，并对其进行测序，
数据分析和结果解读
定点诱变技术的应用领域
定点诱变技术可以应用于基础科研、农业生产、医疗诊断等领域，为人类社会带来了诸多 益处。
基本原理
基于CRISPR-Cas9技术实 现的定点诱变
CRISPR-Cas9技术可以在基因 组中精准识别目标区域，并将 核酸酶Cas9导入到目标位置， 再通过引导RNA分子的作用， 完成对基因组上的目标位点的 修饰。
定点诱变技术可能会带来一系 列的伦理、法律和社会问题， 例如导致人们撕裂不和，社会 不公等问题。
定点诱变技术未来发展 的瓶颈和解决方案
目前，定点诱变技术在某些肿 瘤细胞和人类胚胎细胞中并没 有得到广泛应用，需要进一步 研究，探索更为高效、精准、 安全的定点诱变技术。
4
验证修饰深度和准确性。
对PCR扩增和测序的数据进行分析， 解读实验结果，得出结论，为下一步
的研究提供指导。
应用案例
定点诱变技术在基因 修复中的应用
第七章诱变育种
诱变育种的主要目标是选育某种代谢产物合成能力强的高 产突变株，代谢产物生产能力强弱是一种数量性状。 1.遗传变异的质量性状：大多数典型的遗传性状是不连续的， 即不同的基因型产生相当不同的表型，相互之间没有重叠。如 孢子的颜色，形状；荚膜有无等形态特征，营养缺陷型等生理 特征。 2.遗传变异的数量性状：①是一个连续分布内的变化，例如抗 生素、氨基酸、有机酸、核苷酸等微生物代谢产物的生产能力 从高到低的差异是连续性差异。②数量性状是由多个基因的积 累作用所控制，每个基因所起的作用是有限的，③环境条件在 决定表型上起着很大的作用。
第七章诱变育种
②筛选工作有一定的盲目性：由于数量性状的变异是连续的， 选育高产菌株往往缺乏明确的正负效应，造成筛选工作具有一 定的盲目性。 ③诱变育种工作难度较大：产量突变是许多细微突变的多次积
累，高产菌株选育中多采用多步叠加累积诱变选育法。一般 很难一次性得到产量大幅度提高的菌株；单个诱变阶段产量 提高幅度不高，一般仅5－15％，这一幅度与亲本群体的生 产能力波动范围差不多，加上操作误差也很大，有时甚至超 过5－15％，所有这些都增加了诱变育种工作的难度。
(2)诱导解除基因表达抑制的突变。
改进菌种的生长效率
提高菌株对底物的利用率方法： (1) 通过确定并改变代谢中的耗能部分; (2) 由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。 (3) 赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底 物的利用能力，由此可降低操作费用。
第七章诱变育种
第一节 诱变育种的作用和特点
诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止 国内外提高菌种产量、性能的主要手段。
第七章诱变育种
诱变
物理、化学或生物诱变方法
第七章诱变育种
一、诱变育种的作用
第七章诱变育种
②筛选工作有一定的盲目性：由于数量性状的变异是连续的， 选育高产菌株往往缺乏明确的正负效应，造成筛选工作具有一 定的盲目性。 ③诱变育种工作难度较大：产量突变是许多细微突变的多次积
累，高产菌株选育中多采用多步叠加累积诱变选育法。一般 很难一次性得到产量大幅度提高的菌株；单个诱变阶段产量 提高幅度不高，一般仅5－15％，这一幅度与亲本群体的生 产能力波动范围差不多，加上操作误差也很大，有时甚至超 过5－15％，所有这些都增加了诱变育种工作的难度。
(2)诱导解除基因表达抑制的突变。
改进菌种的生长效率
提高菌株对底物的利用率方法： (1) 通过确定并改变代谢中的耗能部分; (2) 由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。 (3) 赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底 物的利用能力，由此可降低操作费用。
第七章诱变育种
第一节 诱变育种的作用和特点
诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止 国内外提高菌种产量、性能的主要手段。
第七章诱变育种
诱变
物理、化学或生物诱变方法
第七章诱变育种
一、诱变育种的作用
基因的定点诱变
因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制 后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频 率较小。 与校正和修复有关的基因突变后细胞内 基因突变频率大大增加，这样的菌株叫 突变菌株。
流程： 把携带待突变基因的质粒转入增变菌株 扩增，------随机突变体库。 把该库的重组质粒转化到正常宿主中， 筛选鉴定突变体。
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的 寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：
人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补 错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位，每侧至少10-15个碱基 通常采用化学合成 无回文，重复和自身互补序列
即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质
Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。 不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
基因工程第七章DNA定点诱变
• 3’端所形成的杂交体足以引导DNA合成。如果
错配核苷酸太靠近3’端，3’端将不能形成稳定的 杂交体，易被外切活性降解。所以3’端需有79bp完全配对;
• 为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长
度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp, 错配在 中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体 之间的热稳定性差异足够大。
位点选择定点诱变法
三、Transformer SiteDirected mutagenesis
转化子诱变法
Synthesize second strand
Digest DNA (primary digestion)
Transform E.coli mutS to propagate plasmids
ATG ATG
ATG ATG
BamHI
ATG
BamHI
PCR ATG
ATG
EcoRI
PCR
ATG
EcoRI
重叠延伸
BamHI
ATG
PCR EcoRI
第二节 嵌套缺失
第二节 嵌套缺失
1. 外切核酸酶III的消化
Exonuclease III 5‘ 3‘
5‘ 3‘
5‘ 3‘
2. BAL 31的消化
DNA ligase
U
U
U
U
U
2．原理
Insert target DNA
转化 E.coli CJ236
U
U
U U
U
U
Isolate phagemid ss DNA 与突变寡核苷酸退火
转化E.coli MV1190 (dut+/ung+)
UU
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
23
24
酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 因。
14
一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
3
㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
32
33
? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
34
四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
24
酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 因。
14
一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
3
㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
32
33
? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
34
四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
定点诱变的原理和应用
定点诱变的原理和应用1. 引言定点诱变是一种基因工程技术，可以通过人为干预基因组，使其发生特定的变异。
定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍定点诱变的原理和应用。
2. 定点诱变的原理定点诱变的原理是通过人为设计和构建特定的DNA片段，然后将其导入宿主细胞中，通过一系列的分子生物学技术将该DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。
定点诱变技术主要有以下几个关键步骤：•设计目标位点：首先需要确定要进行定点诱变的目标位点，通常是某个特定基因或基因组区域。
•构建修饰DNA片段：根据目标位点的序列信息，设计和合成能够与目标位点配对的DNA片段。
这些DNA片段通常包含所需的突变基因或序列。
•导入宿主细胞：将修饰DNA片段导入宿主细胞中，常用的方法有电转化、化学法和病毒介导的转导等。
•插入目标位点：通过一系列的分子生物学技术，将修饰DNA片段插入到细胞染色体的目标位点上。
常见的方法有CRISPR/Cas9技术、基因敲除、基因转座等。
3. 定点诱变的应用定点诱变技术在科研、生物医药等领域具有广泛的应用价值。
以下是其中几个常见的应用领域：3.1 基因功能研究定点诱变技术可以用来研究基因的功能和表达调控机制。
通过在目标位点上插入突变基因，研究者可以观察到这些突变对基因功能和表达的影响，进而揭示基因的作用机制和生物学功能。
3.2 疾病模型构建定点诱变技术可以用来构建疾病模型，以研究疾病的发生机制和治疗方法。
通过在目标位点上插入与特定疾病相关的突变基因，可以模拟疾病的发生过程，进一步研究疾病的发病机理，并寻找治疗疾病的新方法。
3.3 转基因作物育种定点诱变技术可以用来改良作物品种，提高其产量、抗病性等性状。
通过在目标位点上插入与所需性状相关的突变基因，可以直接导入所需性状，避免传统杂交育种中的不可控性，并加快育种进程。
3.4 基因治疗定点诱变技术可以用来进行基因治疗，治疗一些遗传性疾病或基因突变导致的疾病。
基因定点诱变
2.4.2 寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基 的寡核苷酸片段作引物,启动 单链DNA分子进行复制，随 后这段寡核苷酸引物便成为了 新合成DNA子链的一个组成 部分。
寡核苷酸引物诱变过程
正链DNA合成 突变引物合成 异源双链DNA分子制备 闭环异源双链DNA分子富集 转化 突变体筛选
寡核苷酸引物诱变法的局限性
异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修 复体系修复
提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法
(1) Kunkel 定点诱变法: 1985年由
(2) 硫代磷酸诱变法: 已知有些限制酶不能切割 硫代磷酸DNA分子．在异源双链DNA分子 制备时，加入硫代核苷酸，使之掺入突变 链中．然后用前述酶切割，并用外切酶局 部消化后，进行聚合反应，从而产生具有 定点突变的异源双链DNA
2.4.３ ＰＣＲ诱变
(1) 重组PCR定点诱变:克服寡 核苷酸引物诱变能力仅限于5’ 端.
特点:经3轮PCR反应,一对互补 的带有突变碱基的内侧引物和 2个外侧引物
(2) 大引物诱变:核心是第一 轮PCR产物为第二轮PCR引 物
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使用化学合成的含有突变碱基 的寡核苷酸片段作引物,启动 单链DNA分子进行复制，随 后这段寡核苷酸引物便成为了 新合成DNA子链的一个组成 部分。
寡核苷酸引物诱变过程
正链DNA合成 突变引物合成 异源双链DNA分子制备 闭环异源双链DNA分子富集 转化 突变体筛选
寡核苷酸引物诱变法的局限性
异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修 复体系修复
提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法
(1) Kunkel 定点诱变法: 1985年由
(2) 硫代磷酸诱变法: 已知有些限制酶不能切割 硫代磷酸DNA分子．在异源双链DNA分子 制备时，加入硫代核苷酸，使之掺入突变 链中．然后用前述酶切割，并用外切酶局 部消化后，进行聚合反应，从而产生具有 定点突变的异源双链DNA
2.4.３ ＰＣＲ诱变
(1) 重组PCR定点诱变:克服寡 核苷酸引物诱变能力仅限于5’ 端.
特点:经3轮PCR反应,一对互补 的带有突变碱基的内侧引物和 2个外侧引物
(2) 大引物诱变:核心是第一 轮PCR产物为第二轮PCR引 物
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第十章 DNA诱变
突变是研究基因结构与功能的最基本手 段。
经典的方法是根据突变体的表型，采用 遗传学的方法鉴定相应的基因。
传统的诱变方式
利用能够修饰DNA分子的化学或物 理诱变剂处理生物体
➢ 射线（紫外线、X射线、γ射线等）
➢ 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚 硝基胍等）
不足：
➢ 生物体的任何基因都可能发生突变，目 的基因突变率较低，筛选困难
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。
不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
用一套随机引物与模板配对延伸，产生 不同位点的短DNA片段混合物（含有少 量点突变），以这些短DNA片段为引物 重新组装成全长基因。
错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位，每侧至少10-15个碱基
通常采用化学合成 无回文，重复和自身互补序列
②基本步骤：
将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体， 制备单链DNA
将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火， 在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNA
将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因 突变体的筛选：寡核苷酸探针杂交筛选法
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的
寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：
人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补
单 链 的 M 13 重组分子
AGTACGA
TCAGGCT
化学合成的寡核苷酸
杂交退火
TCAGGCT AGTACGA
D N A聚 合 酶
D N A连 接 酶
TCAGGCT AGTACGA
TCATGCT
TCAGGCT AGTCCGA
野生型
转化大 肠杆菌
突变型
局限性：突变体子代频率低
退火时，有些单链模板DNA未与寡核苷 酸配对
基本步骤:
目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个 基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同 源性的基因
DNaseI酶切：将基因随机切割成约50～100bp左 右的小片段
不加引物的PCR：在Taq酶的作用下将切割后的 DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可 能发生许多突变和重组
加引物的PCR：加入目的基因片段两端的引物, 使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。
包括两种方式： 盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变
野 生 型 DNA
H in d I I I 移走小片段
E coR I
H in d I I I E coR I
人工合成的寡核苷酸片段 退火
H in d I I I
H in d 序列
E coR I
D N A连 接 酶
简 单 盒 式 取 代 诱 变
主要方法有：随机诱变，DNA体外重组， 寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失
第一节 随机诱变
随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突 变，引入位置和性质均为随机性的。
包括：1.错误掺入诱变（易错PCR)
2.盒式诱变
3.增变菌株的诱变作用
4.化学诱变
随机突变的策略：
1. 易错PCR（error-prone PCR）
与校正和修复有关的基因突变后细胞内 基因突变频率大大增加，这样的菌株叫 突变菌株。
流程：
把携带待突变基因的质粒转入增变菌株 扩增，------随机突变体库。
把该库的重组质粒转化到正常宿主中， 筛选鉴定突变体。
4 化学诱变
➢ 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲 基磺酸乙酯）、亚硝基胍等）处理DNA 片段，产生随机突变体库。
野 生 型 DNA
突 变 DNA
H in d I I I
E coR I 野 生 型 D N A
混合寡核苷酸诱变
用于取代的是含有随机突变的混合双联 寡核苷酸，可引入大量的随机突变。
在合成寡核苷酸片段时，需要带限制性 内切酶位点，以便介导它们互为引物
3增变菌株的诱变作用
因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制 后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频 率较小。
DNA体外重组
依赖序列同源性的DNA体外重组，包括 DNA洗牌(DNA shuffing)，交错延伸（ StEP)，随机引发重组（RPR).
2. DNA shuffling （DNA 重排或改组）
DNA shuffling 是指DNA分子的体外重 组,是基因在分子水平上进行有性重组。 通过改变单个基因（或基因家族）原有 的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表 达产物以新功能
基因直接进化的步骤
突变
基因突变库的建立
筛选
基因突变库的活体或离体筛选
Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment
体外诱变
是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变 其核苷酸序列，获得突变基因。研究基 因的结构与功能的关系，获得所需功能 的突变体蛋白质
在扩增目的基因的过程中，通过改变 PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、 改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入 碱基错配，导致目的基因的随机突变
2. 盒式诱变
Cassette mutagenesis
利用一段人工合成的具有突变序列的 寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野 生型基因中的相应序列
➢ 即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上
➢ 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质
Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
细胞内甲基介导的错配修复机制会修复 新合成链中的错配碱基
一、Kunkel 法 或称“U”法 1．背景知识
dut- dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转
突变是研究基因结构与功能的最基本手 段。
经典的方法是根据突变体的表型，采用 遗传学的方法鉴定相应的基因。
传统的诱变方式
利用能够修饰DNA分子的化学或物 理诱变剂处理生物体
➢ 射线（紫外线、X射线、γ射线等）
➢ 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚 硝基胍等）
不足：
➢ 生物体的任何基因都可能发生突变，目 的基因突变率较低，筛选困难
基因家族的改组
交错延伸重组 图10-5
以两个以上的有一定同源性的DNA片段 为模板进行PCR反应，通过交换模板机制 实现DNA序列的重新组装。
不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。
随机引发重组 图10-6
用一套随机引物与模板配对延伸，产生 不同位点的短DNA片段混合物（含有少 量点突变），以这些短DNA片段为引物 重新组装成全长基因。
错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子 的中央部位，每侧至少10-15个碱基
通常采用化学合成 无回文，重复和自身互补序列
②基本步骤：
将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体， 制备单链DNA
将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火， 在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNA
将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因 突变体的筛选：寡核苷酸探针杂交筛选法
寡核苷酸介导的定点诱变
①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的
寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物 便成为了新合成DNA子链的一个组成部 分，因此所产生出来的新链便具有已发 生突变的碱基序列
作为诱变剂的寡核苷酸序列：
人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中 除了所需的碱基突变外，其余的则与目 的基因编码链的特定区段完全互补
单 链 的 M 13 重组分子
AGTACGA
TCAGGCT
化学合成的寡核苷酸
杂交退火
TCAGGCT AGTACGA
D N A聚 合 酶
D N A连 接 酶
TCAGGCT AGTACGA
TCATGCT
TCAGGCT AGTCCGA
野生型
转化大 肠杆菌
突变型
局限性：突变体子代频率低
退火时，有些单链模板DNA未与寡核苷 酸配对
基本步骤:
目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个 基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同 源性的基因
DNaseI酶切：将基因随机切割成约50～100bp左 右的小片段
不加引物的PCR：在Taq酶的作用下将切割后的 DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可 能发生许多突变和重组
加引物的PCR：加入目的基因片段两端的引物, 使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。
包括两种方式： 盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变
野 生 型 DNA
H in d I I I 移走小片段
E coR I
H in d I I I E coR I
人工合成的寡核苷酸片段 退火
H in d I I I
H in d 序列
E coR I
D N A连 接 酶
简 单 盒 式 取 代 诱 变
主要方法有：随机诱变，DNA体外重组， 寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失
第一节 随机诱变
随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突 变，引入位置和性质均为随机性的。
包括：1.错误掺入诱变（易错PCR)
2.盒式诱变
3.增变菌株的诱变作用
4.化学诱变
随机突变的策略：
1. 易错PCR（error-prone PCR）
与校正和修复有关的基因突变后细胞内 基因突变频率大大增加，这样的菌株叫 突变菌株。
流程：
把携带待突变基因的质粒转入增变菌株 扩增，------随机突变体库。
把该库的重组质粒转化到正常宿主中， 筛选鉴定突变体。
4 化学诱变
➢ 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲 基磺酸乙酯）、亚硝基胍等）处理DNA 片段，产生随机突变体库。
野 生 型 DNA
突 变 DNA
H in d I I I
E coR I 野 生 型 D N A
混合寡核苷酸诱变
用于取代的是含有随机突变的混合双联 寡核苷酸，可引入大量的随机突变。
在合成寡核苷酸片段时，需要带限制性 内切酶位点，以便介导它们互为引物
3增变菌株的诱变作用
因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制 后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频 率较小。
DNA体外重组
依赖序列同源性的DNA体外重组，包括 DNA洗牌(DNA shuffing)，交错延伸（ StEP)，随机引发重组（RPR).
2. DNA shuffling （DNA 重排或改组）
DNA shuffling 是指DNA分子的体外重 组,是基因在分子水平上进行有性重组。 通过改变单个基因（或基因家族）原有 的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表 达产物以新功能
基因直接进化的步骤
突变
基因突变库的建立
筛选
基因突变库的活体或离体筛选
Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment
体外诱变
是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变 其核苷酸序列，获得突变基因。研究基 因的结构与功能的关系，获得所需功能 的突变体蛋白质
在扩增目的基因的过程中，通过改变 PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、 改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入 碱基错配，导致目的基因的随机突变
2. 盒式诱变
Cassette mutagenesis
利用一段人工合成的具有突变序列的 寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野 生型基因中的相应序列
➢ 即使获得期望表型的突变体，无法保证 突变确实发生在目的基因上
➢ 在基因克隆和核酸测序技术发展之前， 无法知道基因中突变的位置和性质
Directed evolution （定向进化或直接进化）
对目的基因人为制造大量突变，然后 按照特定的需要和目的，给予选择压力， 反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适 合特定目的的分子筛选出来，获得满足需 要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管 中分子水平的模拟进化。
细胞内甲基介导的错配修复机制会修复 新合成链中的错配碱基
一、Kunkel 法 或称“U”法 1．背景知识
dut- dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转