CTCF通过ALAS2调控K562细胞红系分化

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K562细胞株侧群细胞分离及耐药蛋白和细胞周期的表达

K562细胞株侧群细胞分离及耐药蛋白和细胞周期的表达范瑞华;李惠民;郭殿选;高勇;陈小飞【摘要】背景:血液肿瘤细胞中的侧群细胞能够逃避细胞周期化疗药物的作用,可能与白血病复发有关.目的:鉴定人慢性粒细胞白血病细胞株K562中是否存在侧群细胞,并观察侧群细胞亚群与非侧群细胞亚群耐药蛋白、细胞周期表达的差异.方法:采用流式细胞术检测K562细胞株中是否存在侧群细胞;并分析K562侧群细胞和非侧群细胞两亚群间耐药蛋白P-gp、ABCG2以及细胞周期的表达情况.结果与结论:K562细胞株中均存在侧群细胞,这群细胞比例均少.侧群细胞亚群耐药蛋白ABCG2表达高于非侧群细胞亚群(P < 0.05),两亚群耐药蛋白P-gp中表达差异无显著性意义;侧群细胞亚群中G0/G1期细胞占80%,非侧群细胞亚群中G0/G1期细胞占43.7%.证实K562细胞株中确实存在较少比例的侧群细胞,其和主群细胞在耐药蛋白表达上有异质性,大部分处于静止期,可能富含和肿瘤耐药有关的白血病干细胞.%BACKGROUND: It is possible that leukemia relapse is related with side population (SP) cells, which can escape cell cyles phasespecific chemotherapeutic drugs .OBJECTIVE: To isolate and preliminarily identify whether the human chronic myeloid leukemia cell line-K562containsSPcellsor not, and to further research K562 SP cells and study the expression of multidrug resistance proteins and DNA content in twosubpopulations.METHODS: Flow cytometry with UV excitation light was used to detect the percentage of SP cells in logarithmic growthperiodK562, which were then sorted by the fluorescence activating cell sorter, and then SP and non-SP subpopulations were collected.The expression of multidrug resistance proteins were examined by flowcytometry technique in two subpopulations. DNA contentof two subpopulations was examined by flow cytometry.RESULTS AND CONCLUSION: The K562 cell line contained SP cells, and the proportion of SP cells was much lower. Althoughthere were no differences between these two subpopulations in P-gp expression, ABCG2+ cells expression in the SPsubpopulation was significant higher than that in the non-SP subpopulation (P < 0.05). The G0/G1 phase cells in theK562SPsubpopulation accounted for about 80% of the total cells. According to the significant differences in the expression of MDRproteins between the SP subpopulation and the non-SP subpopulation, and the majority in a quiescent period, it is possible thatleukemia stem cells are enriched in SP cells.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)045【总页数】4页(P8479-8482)【关键词】白血病干细胞;侧群细胞;流式细胞术;耐药蛋白;细胞周期【作者】范瑞华;李惠民;郭殿选;高勇;陈小飞【作者单位】淮安市第一人民医院肿瘤内科,江苏省淮安市,223300;昆明医学院第一附属医院血液内科,云南省昆明市,650031;淮安市第二人民医院老年病科,江苏省淮安市,223300;淮安市第一人民医院肿瘤内科,江苏省淮安市,223300;淮安市第一人民医院肿瘤内科,江苏省淮安市,223300【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言近年来对干细胞和肿瘤研究的深入，已表明干细胞自我更新和肿瘤生成有惊人的相似之处，而且肿瘤中某些数量极少的细胞具有干细胞特性，提出了肿瘤干细胞学说[1-2]，认为肿瘤干细胞是肿瘤转移、复发和耐药的根源。

新型人转录因子hBKLF对K562细胞增殖分化及血红蛋白合成作用的研究

新型人转录因子hBKLF对K562细胞增殖、分化及血红蛋白合成作用的研究【摘要】孕22周的胎肝是胎儿的主要造血器官，其中含有大量与造血相关的调控因子。

人碱性Krüppel样因子(human basic Krüppel- like factor，hBKLF)是本研究室从这一时期胎肝cDNA文库中新克隆的转录因子。

对其C端的结构分析发现，它含有3个特征性C2H2锌指结构，因此属于KLF转录因子家族。

前期的表达谱研究工作显示，hBKLF在成人外周血白细胞、骨髓和胎肝中表达量高，在红系中有表达，这提示它可能与造血相关。

本研究以K562细胞为模型，研究hBKLF与造血细胞增殖、分化及血红蛋白合成的关系。

构建hBKLF正义及反义真核表达载体，转染K562细胞，经G418筛选4周，得到稳定细胞株；用RT- PCR、Western blot方法测定转染后K562细胞hBKLF表达水平的变化；以转染空质粒的K562细胞为对照组，在显微镜下直接观察转染正义质粒和反义质粒的两组细胞形态的改变；用MTT法比较增殖速率的变化；用甲基纤维素半固体培养法比较集落形成率的差别；用苯息丁法观察氯高铁血红素（hemin）诱导K562细胞分化后血红蛋白合成水平的差异。

结果表明：正义质粒和反义质粒经NcoI酶切鉴定构建正确。

转染正义质粒的K562细胞（正义组）中hBKLF的mRNA及蛋白质表达水平增加，转染反义质粒的K562细胞（反义组）中hBKLF的mRNA水平降低。

增殖活性在反义组、正义组、对照组分别为1.335±0.022、1.067±0.010、1.118±0.014，反义组K562细胞的增殖速率加快，正义组细胞增殖速率减慢（P<0.001）。

细胞形态在各组间无明显区别。

集落形成率在反义组、正义组、对照组分别为148±13、136±10、141±10，各组间无显著差异（P>0.05）。

人白血病K562细胞红系分化的研究进展

抑癌基因
:O’基因是公认的能抑制肿瘤发生的基因"即抑癌基因的重要成员%\O%$ 细胞株在 7% 有学者将野生型 :O’ 基因转染 _@Q$P_R 阳性 :O’ 阴性的 \O%$ 细胞"发现在抗肿瘤药物依托泊甙 !0+):)*5-0#的作用下":O’ 转染细胞不能于细胞周期 Z$ 期停滞而诱导其凋亡"这一机制可能是 \O%$细胞特异的"也可能是由于 \O%$ 细胞有很强的抗 Z$ 检查点所致的细胞周期停滞"并对高水平的 JXP 损伤有耐受性%用另一抗肿瘤药物诺考达唑!6)9)-8D)90#捕捉转染细胞和控制细胞的有丝分裂期"发现转染细胞有丝分裂指数显著升高"阐明了在依托泊甙作用下":O’ 取消了 Z$ 检查点"减少 2/4$检查点蛋白与依托泊甙诱导 @J\& 酪氨酸 &O !c&O#的磷酸化"从而增加了 \O%$ 细胞对依托泊甙的凋亡敏感性 "使凋亡发生 %
态的细胞中 2H7.2基因变化不大% 其中 2H7.2是 2H 7.? 直接的转录调节靶点"它可下调红系分化的进程"但它不能阻止细胞的红系分化%b, 等利 *’+ 用组
国际检验医学杂志$""%年%月第$#卷第%期!I6+VR8? B0-!V,60$""%!W)9=$#!X)=%

氯化高铁血红素诱导K562细胞红系定向分化细胞模型的构建

１．３实验仪器
３７ ℃５％ＣＯ，孵箱；水浴箱（江苏太
李慧，周华友，代喜平，晁艳，刘持翔，于艳涛。
广东省中医院血液科（广州５１０５２０）；南方医科大学南方医院输血科（广州５１０５１５）；广东省佛山市顺德中心
血站（５２８３００）
【摘要】目的
假说。目前还没有好的诱导适应性调节产生的方
二甲基亚砜（广州威佳公司）；氯化高铁血红素（Ｈｅ —
ｍｉｎ）（美国Ｓｉｇｍａ公司，批号：５１６０８２７７）；联苯胺、亚硝
基铁氰化钠、３０％ＨＯ（广州康龙生物有限公司）；１Ｘ
Ｈｅｍｉｎ持续诱导Ｋ５６２
细胞第１～７天，联苯胺染色阳性率在４ｄ达高峰，后逐步下降；３、４、５ｄ联苯胺染色阳性率之间比较差异无统计学意义（Ｆ＝２８．５５，Ｐ＞０．０５）。５—７ｄ持续诱导、无诱导两组间比较，联苯胺染色阳性率差异有统计学意义（Ｆ＝２２．００１，Ｐ＜０．０５）。Ｈｅｍｉｎ诱导１～７ｄ的ＦＵＴ１ｍＲＮＡ相对表达量分别为对照组的０．６６７－４－０．０Ｏ４、０．６１６± ０．００６、
０．６１５± ０．０２９、１．１３８±０．０４９、０．６６± ０．００２、０．７５２± ０．０２９、０．６７４± ０．０１４倍。结论Ｈｅｍｉｎ可诱导Ｉ＜＿５６２细胞红系

氯化高铁血红素诱导K562 细胞红系分化对其细胞周期的影响

生物技术进展２０２０年㊀第１０卷㊀第４期㊀４０９~４１６ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０２０￣０３￣２０ꎻ接受日期:２０２０￣０５￣１５㊀基金项目:国家重点研发计划项目(２０１６ＹＦＡ０１０２３００ꎻ２０１７ＹＦＡ０１０３１０２)ꎻ国家自然科学基金项目(８１８７００８９ꎻ８１７００１０５ꎻ８１８９０９９０)ꎻ中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(２０１６￣Ｉ２Ｍ￣１￣０１８ꎻ２０１６￣Ｉ２Ｍ￣３￣００２ꎻ２０１７￣Ｉ２Ｍ￣１￣０１５)ꎻ中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费(２０１８ＰＴ３１０３３ꎻ２０１９ＰＴ３１００２２)ꎻ国家重点实验室自主课题(１５７￣Ｚｋ１８￣０６ꎻ１５７￣ｚ１８￣０７)ꎻ北京协和医学院研究生创新基金项目(２０１７￣０７１０￣０２)ꎮ㊀联系方式:马艺戈Ｅ￣ｍａｉｌ:ｍａｙｉｇｅ＠ｉｈｃａｍｓ.ａｃ.ｃｎ∗通信作者刘丽君Ｅ￣ｍａｉｌ:ｌｉｕｌｉｊｕｎ＠ｍａｉｌ.ｎｅｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ石莉红Ｅ￣ｍａｉｌ:ｓｈｉｌｉｈｏｎｇｘｙｓ＠ｉｈｃａｍｓ.ａｃ.ｃｎ氯化高铁血红素诱导Ｋ５６２细胞红系分化对其细胞周期的影响马艺戈１ꎬ㊀王冰蕊１ꎬ㊀高洁１ꎬ㊀刘金花１ꎬ㊀佟静媛１ꎬ㊀刘丽君２∗ꎬ㊀石莉红１∗１.北京协和医学院ꎬ中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)ꎬ实验血液学国家重点实验室ꎬ国家血液病临床医学研究中心ꎬ天津３０００２０ꎻ２.东北大学生命科学与健康学院ꎬ沈阳１１０１６９摘㊀要:细胞周期的测量是细胞增殖动力学的研究基础ꎮ通过添加３０μｍｏｌＬ－１氯化高铁血红素(Ｈｅｍｉｎ)诱导人慢性髓系白血病Ｋ５６２细胞红系分化ꎬ利用５￣溴脱氧尿嘧啶核苷(ＢｒｄＵ)与７￣ＡＡＤ双染的方法检测Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２红系分化细胞对细胞周期各期比例的影响ꎬ未诱导的Ｋ５６２细胞周期各期比例作为对照ꎬ检测发现Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２红系分化细胞对其细胞周期相对值无明显影响ꎮ应用ＢｒｄＵ间隔染色结合流式细胞术的方法ꎬ通过分析ＢｒｄＵ间隔染色后ＢｒｄＵ阳性细胞群的动态变化规律ꎬ从而推算出Ｋ５６２红系分化细胞的倍增时间及细胞周期各期时长ꎮ根据测量结果发现ꎬ未诱导的Ｋ５６２细胞总倍增时间约为２０ｈꎬ与通过生长曲线公式法计算倍增时间的结果相符ꎬＨｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞的细胞周期倍增时长约为２３ｈꎮＨｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２红系分化细胞较未诱导的Ｋ５６２细胞倍增时间与各期时长无明显差异ꎮ因此ꎬＨｅｍｉｎ诱导Ｋ５６２细胞红系分化对其细胞周期绝对值及相对值均无明显影响ꎮ关键词:细胞周期ꎻＫ５６２细胞ꎻ氯化高铁血红素ꎻ５￣溴脱氧尿嘧啶核苷ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０２０.００３３ＴｈｅＥｆｆｅｃｔｏｆＨｅｍｉｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄＥｒｙｔｈｒｏｉｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎＫ５６２ＣｅｌｌｓｏｎＣｅｌｌＣｙｃｌｅＭＡＹｉｇｅ１ꎬＷＡＮＧＢｉｎｇｒｕｉ１ꎬＧＡＯＪｉｅ１ꎬＬＩＵＪｉｎｈｕａ１ꎬＴＯＮＧＪｉｎｇｙｕａｎ１ꎬＬＩＵＬｉｊｕｎ２∗ꎬＳＨＩＬｉｈｏｎｇ１∗１.ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙꎬＮａｔｉｏｎａｌＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｌｏｏｄＤｉｓｅａｓｅｓꎬＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆ＢｌｏｏｄＤｉｓｅａｓｅｓＨｏｓｐｉｔａｌꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ＆ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＴｉａｎｊｉｎ３０００２０ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅａｎｄＨｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮｏｒｔｈｅａｓｔｅｒｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈｅｎｙａｎｇ１１０１６９ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅｌｅｎｇｔｈ.Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒꎬ３０μｍｏｌＬ－１ＨｅｍｉｎｉｎｄｕｃｅｄｅｒｙｔｈｒｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａＫ５６２ｃｅｌｌｓ.Ｈｅｍｉｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄＫ５６２ｅｒｙｔｈｒｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅｐｈａｓｅｓｂｙｕｓｉｎｇ５￣ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ(ＢｒｄＵ)ａｎｄ７￣ＡＡＤｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｇ.ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｅａｃｈｐｈａｓｅｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｃｏｎｔｒｏｌ.ＩｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔＨｅｍｉｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄＫ５６２ｅｒｙｔｈｒｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃｅｌｌｓｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｖａｌｕｅｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅ.ＩｎｔｅｒｖａｌｓｔａｉｎｉｎｇｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｅｏｆＢｒｄＵｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｔｈａｔｔｈｅｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅａｎｄｃｅｌｌｃｙｃｌｅｄｕｒａｔｉｏｎｏｆｅｒｙｔｈｒｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄ.ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓꎬｔｈｅｔｏｔａｌｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｗａｓａｂｏｕｔ２０ｈｏｕｒｓꎬｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅｂｙｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｍｅｔｈｏｄｓ.ＴｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＨｅｍｉｎｗａｓａｂｏｕｔ２３ｈｏｕｒｓ.ＴｈｅｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＨｅｍｉｎｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍＫ５６２ｃｅｌｌｓ.ＴｈｅｒｅｆｏｒｅꎬＨｅｍｉｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｅｒｙｔｈｒｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅａｂｓｏｌｕｔｅｖａｌｕｅａｎｄｒｅｌａｔｉｖｅｖａｌｕｅｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅ.. All Rights Reserved.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｃｅｌｌｃｙｃｌｅꎻＫ５６２ｃｅｌｌｓꎻＨｅｍｉｎꎻＢｒｄＵ㊀㊀细胞周期是精细有序的生物学过程ꎬ间期和分裂期两个阶段分工明确地合作ꎬ完成一次完整的细胞周期ꎮ细胞周期的正确连续进行不仅在细胞生物学层面对于生长发育意义重大ꎬ而且在病理生理状态下对于癌症的发病机制和治疗机理的研究至关重要[１]ꎮ细胞周期在正常的造血进程中对造血干细胞的自我更新和造血祖细胞的谱系定向分化进行严格调控[２]ꎮ在血液系统疾病如骨髓增生异常综合征中ꎬ细胞周期紊乱造成的细胞非正常增殖是它的重要生物学特征[３]ꎮ在一个完整的细胞周期过程中ꎬＤＮＡ合成前期(Ｇ１期)至ＤＮＡ合成期Ｓ期㊁ＤＮＡ合成后期(Ｇ２期)至分裂期(Ｍ期)这两个阶段由于ＤＮＡ含量的变化致使细胞周期呈高活跃状态ꎬ受到细胞内检测点调控[４]ꎮ因此这两个阶段的长度及比例ꎬ对于研究正常及异常的细胞周期状态都有重要意义ꎮ细胞周期的比例为所处细胞周期阶段的细胞数量占总细胞量的比例ꎮ而细胞周期的总倍增时间及各期的时间长度为完成一次完整细胞周期所需的总时间和在各期所用的时间长短ꎮ因此ꎬ各期所占细胞周期的比例为细胞周期变化的相对值ꎬ细胞周期的倍增时间及各期长度为细胞周期变化的绝对值ꎮ人慢性髓系白血病Ｋ５６２细胞是从慢性粒细胞白血病患者中提取的细胞系ꎬ它是研究谱系定向分化的细胞模型ꎬ与未分化的早期多潜能的造血祖细胞相近ꎬ具有多向分化的潜能ꎬ可由血红素氧化后的产物Ｈｅｍｉｎ诱导红系分化[５￣８]ꎮ本研究首先利用ＢｒｄＵ与７￣ＡＡＤ双染的方法检测了Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞对其细胞周期相对值的影响ꎬ结果发现诱导红系分化的Ｋ５６２细胞并未改变细胞周期的相对值ꎮ因此ꎬ利用ＢｒｄＵ间隔染色结合流式细胞术的方法ꎬ通过分析ＢｒｄＵ阳性(标记ＢｒｄＵ染料)的细胞随着时间间隔增加(０㊁１㊁２㊁㊁１２ｈ)的变化情况ꎬ检测Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２红系分化细胞对其细胞倍增时间及各期时长的影响ꎬ从而在细胞周期变化的相对值和绝对值两方面ꎬ研究Ｋ５６２细胞红系分化后对细胞周期的影响ꎮ１㊀材料和方法１.１㊀仪器与试剂流式细胞仪ＬＳＲ￣ＩＩ(ＢＤ)ꎻＳｈａｎｄｏｎＣｙｔｏｓｐｉｎ４细胞离心涂片机(ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)ꎻＫ５６２细胞株购自美国ＡＴＣＣ细胞库ꎻＨｅｍｉｎ粉末㊁ｏ￣Ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ粉末购自Ｓｉｇｍａ公司ꎻ甲醇㊁无水乙醇购自天津市船化学试剂科技有限公司ꎻＰＢＳ缓冲液购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司ꎻＢｒｄＵ￣ＦＩＴＣ检测试剂盒购自ＢＤ公司ꎻ细胞培养及冻存试剂:胎牛血清㊁Ｌ￣谷氨酰胺㊁ＲＰＭＩ１６４０基础培养基㊁青霉素－链霉素抗生素等细胞培养试剂购自Ｇｉｂｃｏ公司ꎻ二甲基亚砜(ＤＭ￣ＳＯ)购自Ｓｉｇｍａ公司ꎮ１.２㊀细胞培养Ｋ５６２细胞培养使用ＲＰＭＩ１６４０基础培养基ꎬ配方为:１０％胎牛血清㊁青霉素(１００ＵｍＬ－１)￣链霉素抗生素(１００μｇｍＬ－１)㊁Ｌ￣谷氨酰胺(２ｍｍｏｌＬ－１)ꎮＫ５６２细胞红系分化由３０μｍｍｏｌＬ－１Ｈｅｍｉｎ诱导ꎻＫ５６２细胞及诱导红系分化的Ｋ５６２细胞置于恒温３７ħ５％ＣＯ２培养箱ꎻＫ５６２细胞培养密度为２ˑ１０５个ｍＬ－１ꎮ１.３㊀计数法统计细胞存活率１０μＬ细胞与１０μＬ台盼蓝于ＥＰ管中混匀ꎬ显微镜下记录活细胞数(台盼蓝未染色细胞)ꎮ细胞存活率＝活细胞数/细胞总数ˑ１００％ꎮ１.４㊀联苯胺染色及观察细胞甩片:收集４ˑ１０４个细胞ꎬ７０μＬＰＢＳ缓冲液重悬细胞ꎬ细胞离心涂片机甩片ꎻ联苯胺染色:玻片浸入甲醇染缸固定４ｍｉｎꎬ转移至联苯胺染液避光染色２ｍｉｎ(联苯胺染液:５０ｍＬ甲醇＋０５ｇｏ￣Ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ粉末ꎻ４ħ避光保存)ꎬ转移至过氧化氢溶液避光染色１.５ｍｉｎ(过氧化氢溶液:２５ｍＬ无水乙醇＋２５ｍＬ去离子水＋１.５ｍＬ过氧化氢ꎻ现用现配)ꎬ转移至去离子水ꎬ洗涤３０ｓꎮ利用显微镜观察ꎬ对照组Ｋ５６２细胞与３０μｍｏｌＬ－１Ｈｅｍｉｎ诱导第３天的Ｋ５６２细胞联苯胺染色后的形态及颜色ꎮ１.５㊀ＢｒｄＵ间隔染色方法试剂准备及稀释:ＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒ由无菌ＰＢＳ０１４生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.缓冲液㊁０.２％牛血清白蛋白㊁０.０８％葡萄糖配制ꎮ无菌ＰＢＳ缓冲液将ＢｒｄＵ￣ＦＩＴＣ试剂盒中１０ˑＰｅｒｍＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ稀释至１ˑ工作液ꎮ标记染料及冻存:将１份Ｋ５６２细胞分成１３组ꎬ分别加入７５μｍｏｌＬ－１ＢｒｄＵ染料ꎬ３７ħ培养箱孵育１ｈꎬ收集细胞ꎬ离心ꎬ弃上清ꎬ并用无菌ＰＢＳ缓冲液洗涤染料ꎬ更换新鲜培养基ꎬ置于培养箱中ꎬ分别间隔０㊁１㊁２㊁３㊁４㊁５㊁６㊁７㊁８㊁９㊁１０㊁１１㊁１２ｈꎬ收集各组时间间隔细胞ꎬ离心ꎬ弃上清并用无菌ＰＢＳ缓冲液洗涤细胞ꎬ２００μＬＣｙｔｏｆｉｘ/ＣｙｔｏｐｅｒｍＢｕｆｆｅｒ(ＢｒｄＵ￣ＦＩＴＣ试剂盒)固定细胞ꎬ避光置于冰上孵育１５ｍｉｎꎬ１ˑＰｅｒｍＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ洗ꎬ９０％胎牛血清＋１０％ＤＭＳＯ制成冻存液ꎬ将细胞冻存于－８０ħꎮ复苏及标记抗体:复苏细胞ꎬ１ｍＬＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒ洗涤细胞ꎬ离心ꎬ弃上清ꎬ１００μＬＣｙｔｏｆｉｘ/ＣｙｔｏｐｅｒｍＢｕｆｆｅｒ固定细胞ꎬ避光置于冰上孵育１０ｍｉｎꎬ１ˑＰｅｒｍＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ和ＰＢＳ缓冲液依次洗涤细胞ꎬ加入１００μＬ由３００μｇｍＬ－１ＤＮａｓｅＩ㊁１μｍｏｌＬ－１ＣａＣｌ２和５μｍｏｌＬ－１ＭｇＣｌ２制成的混合液ꎬ３７ħ孵育１ｈꎬＰＢＳ缓冲液洗涤３遍ꎬ室温避光标记ＢｒｄＵ￣ＦＩＴＣ抗体３０ｍｉｎꎬ１ｍＬＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒ洗涤抗体ꎬ标记７￣ＡＡＤꎬ室温避光１０ｍｉｎꎬＬＳＲ￣ＩＩ流式细胞仪检测ꎬＦｌｏｗｊｏ７.６.１软件分析ꎮ１.６㊀ＢｒｄＵ间隔染色的分析方法通过分析细胞于各组不同时间间隔的流式结果ꎬ可见随着时间增加ꎬＢｒｄＵ＋与７￣ＡＡＤ＋细胞群呈动态变化ꎬ从而依次判断Ｇ２/Ｍ㊁Ｓ㊁Ｇ０/Ｇ１期时长ꎮＤＮＡ含量由７￣ＡＡＤ分成２Ｎ㊁２Ｎ￣４Ｎ及４Ｎ三部分ꎬＤＮＡ含量为２Ｎ的细胞属于Ｇ０/Ｇ１期ꎬ２Ｎ￣４Ｎ的细胞属于Ｓ期ꎬ４Ｎ的细胞属于Ｇ２/Ｍ期ꎮＢｒｄＵ染料孵育１ｈꎬＢｒｄＵ染料掺入细胞周期Ｓ期ꎬ此时直接收集细胞进行后续操作ꎬ即为间隔０ｈꎮ若更换培养基并放入孵箱培养ꎬ间隔数小时后收集细胞ꎮ间隔时间段内ꎬ此群ＢｒｄＵ＋细胞继续参与细胞周期ꎮ随间隔时间的延长ꎬ依次进入Ｇ２/Ｍ期㊁分裂后的子代细胞Ｇ０/Ｇ１期及子代细胞Ｓ期ꎮ间隔Ｘｈ后ꎬ流式图中出现子代细胞Ｇ０/Ｇ１期细胞ꎬ即表示ＢｒｄＵ染料孵育结束时ꎬ有部分细胞即将结束Ｓ期并随即进入Ｇ２/Ｍ期ꎬ经过Ｘｈ间隔ꎬ这部分细胞完成了Ｇ２/Ｍ期ꎬ开始进入子代Ｇ０/Ｇ１期ꎬ那么Ｘｈ即为细胞经历Ｇ２/Ｍ期所用时间长度ꎮ间隔Ｙｈ后ꎬ流式图中２Ｎ￣４Ｎ细胞完全消失ꎬ只剩２Ｎ和４Ｎ的细胞ꎬ即表示ＢｒｄＵ染料孵育结束时ꎬ有部分细胞即将进入Ｓ期ꎮ经过Ｙｈ间隔后ꎬ这部分细胞完成了Ｓ期ꎬ开始全部进入Ｇ２/Ｍ期甚至子代Ｇ０/Ｇ１期ꎬ那么Ｙｈ即为细胞经历Ｓ期所用时间长度ꎮ间隔Ｚｈ后ꎬ子代Ｇ０/Ｇ１期细胞从２Ｎ向２Ｎ￣４Ｎ迁移ꎬ即表示子代细胞完成Ｇ０/Ｇ１期ꎬ开始进入Ｓ期ꎮ因已知细胞进入子代Ｇ０/Ｇ１期的时间间隔约为Ｘｈꎬ那么(Ｚ￣Ｘ)即为细胞经历Ｇ０/Ｇ１期所用时间长度ꎮ由此ꎬ根据间隔０~１２ｈ的流式图ꎬ可计算出Ｇ０/Ｇ１㊁Ｓ㊁Ｇ２/Ｍ期及细胞周期倍增时长[９￣１１]ꎮ１.７㊀ＢｒｄＵ与７￣ＡＡＤ双染检测细胞将通过无菌的ＰＢＳ缓冲液稀释的ＢｒｄＵ稀释液加入细胞ꎬ于培养箱内孵育４~６ｈꎮＰＢＳ洗涤细胞后ꎬ１００μＬＣｙｔｏｆｉｘ/ＣｙｔｏｐｅｒｍＢｕｆｆｅｒ重悬细胞ꎬ室温放置１５ｍｉｎꎮ１ˑＰｅｒｍＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ洗涤细胞后ꎬ１００μＬＣｙｔｏｐｅｒｍ/ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ(ＢｒｄＵ￣ＦＩＴＣ试剂盒)重悬细胞ꎬ置于冰上１０ｍｉｎꎮ１ˑＰｅｒｍＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ洗涤细胞ꎬ１００μＬＣｙｔｏｆｉｘ/Ｃｙ￣ｔｏｐｅｒｍＢｕｆｆｅｒ重悬细胞ꎬ置于冰上５ｍｉｎꎮ１ˑＰｅｒｍＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ洗涤细胞ꎬ弃上清ꎬ加入１００μＬ３００μｇｍＬ－１ＤＮａｓｅＩ重悬细胞ꎬ３７ħ孵育１ｈꎮ１ˑＰｅｒｍＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ洗涤细胞ꎬ弃上清加入２μＬＢｒｄＵ抗体ꎬ室温孵育４０ｍｉｎꎮ１ˑＰｅｒｍＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ洗涤细胞ꎬ弃上清加入１０μＬ７￣ＡＡＤ染料ꎬ室温放置１０ｍｉｎꎮＬＳＲ￣ＩＩ流式细胞仪检测ꎬＦｌｏｗｊｏ７.６.１软件分析ꎮ１.８㊀生长曲线法计算倍增时间利用生长曲线公式法推测Ｋ５６２细胞倍增时间ꎬ公式为Ｔｄ＝Ｔ０ˑｌｇ２/(ｌｇＮｔ－ｌｇＮ０)ꎮ其中Ｔｄ为倍增时间ꎬＴ０为间隔时间ꎬＮｔ为对数生长期任意时间点的观察值ꎬＮ０为对数生长期任意时间点的初始值[１２]ꎮ１.９㊀统计学分析方法本实验数据采用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６制作图表和统计学分析ꎬ每组实验均重复大于３次ꎮ配对ｔ检验进行统计学分析ꎬＰ<０.０５具有统计学意义ꎮ１１４马艺戈ꎬ等:氯化高铁血红素诱导Ｋ５６２细胞红系分化对其细胞周期的影响. All Rights Reserved.２㊀结果与分析２.１㊀Ｈｅｍｉｎ诱导Ｋ５６２细胞红系分化利用３０μｍｏｌＬ－１Ｈｅｍｉｎ诱导Ｋ５６２细胞红系分化７２ｈ后ꎬ在显微镜下可见联苯胺染色结果(图１Ａ￣Ｂ)ꎬ联苯胺染色阳性的细胞比例约为３０％(图１Ｃ)ꎮＨｅｍｉｎ是血红素氧化产物ꎬ其分子结构与血红素相似ꎬ含有高价铁卟啉能够诱导血红蛋白表达ꎬ因此联苯胺染色为阳性[１３]ꎮ由此ꎬＨｅｍｉｎ成功诱导Ｋ５６２细胞向红系分化ꎮＡ:对照组(ˑ４０)ꎻＢ:Ｈｅｍｉｎ处理组(ˑ４０)ꎻＣ:Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２红系分化的细胞联苯胺染色阳性比例ꎮ∗∗表示数据与对照相比在Ｐ<０.０１差异具有统计学意义ꎮ图１㊀Ｈｅｍｉｎ诱导Ｋ５６２细胞红系分化Ｆｉｇ.１㊀ＨｅｍｉｎｉｎｄｕｃｅｄｅｒｙｔｈｒｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓ２.２㊀ＢｒｄＵ￣７ＡＡＤ双染检测Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞周期相对值变化通过ＢｒｄＵ￣７ＡＡＤ双染色法检测细胞周期各时期比例ꎬ判断其相对值的变化情况ꎮ如图２所示ꎬＫ５６２细胞周期中Ｓ期占细胞周期的比例约为４９.７％ꎬＧ０/Ｇ１期占细胞周期的比例约为４５.６％ꎬＧ２/Ｍ期占细胞周期的比例约为４.６％(图２Ａ)ꎮＨｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２红系分化细胞的细胞周期中Ｓ期占细胞周期的比例约为５３.９％ꎬＧ０/Ｇ１期占细胞周期的比例约为４０.６％ꎬＧ２/Ｍ期占细胞周期的比例约为４.６２％(图２Ｂ)ꎮＨｅｍｉｎ诱导Ｋ５６２红系分化的细胞周期不具有统计学意义(Ｐ>００５)(图２Ｃ)ꎮ由此ꎬＨｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞未改变其细胞周期相对值ꎮ２.３㊀利用生长曲线法推测Ｋ５６２细胞倍增时间Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞对细胞周期各期比例变化没有明显的影响ꎮ因此ꎬ根据细胞计数统计活细胞数目ꎬ绘制Ｋ５６２细胞对数期生长曲线(图３)ꎬ发现Ｋ５６２细胞呈对数增长ꎮＫ５６２细胞对数生长期中ꎬ利用台盼蓝染色计算细胞存活率约为９９％(图４)ꎮ连续５ｄ在Ｋ５６２的新鲜培养基中种２ˑ１０５个细胞ꎬ观察其经过２４ｈ增殖后的细胞数目ꎬ并利用生长曲线公式法Ｔｄ＝Ｔ０ｌｇ２/ (ｌｇＮｔ－ｌｇＮ０)ꎬ推测出Ｋ５６２细胞倍增时间约为２０２２９ｈ(表１)ꎮ由于Ｋ５６２细胞是永生化细胞系ꎬ存活率较高ꎬ通过多时间点细胞计数绘制生长曲线ꎬ计算细胞周期的倍增时间的方法可以降低细胞计数法误差带来的干扰ꎬ结果可信度较高ꎮ２.４㊀间隔染色检测Ｋ５６２细胞倍增时间及细胞各期时长利用ＢｒｄＵ间隔染色结合流式分析的方法ꎬ检测Ｋ５６２红系分化细胞周期绝对值的变化情况ꎮ可见随着间隔时间的增加ꎬ未诱导的Ｋ５６２细胞呈阶段式变化ꎮ０ｈＢｒｄＵ与７￣ＡＡＤ双染的２１４生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.Ａ:未诱导的Ｋ５６２细胞周期各期比例ꎻＢ:Ｈｅｍｉｎ处理组细胞周期各期比例ꎻＣ:Ｈｅｍｉｎ诱导Ｋ５６２红系分化对细胞周期各期比例的影响ꎮＮＳ表示差异无统计学意义ꎮ图２㊀Ｈｅｍｉｎ诱导Ｋ５６２红系分化对细胞周期相对值的变化Ｆｉｇ.２㊀ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｎｃｅｌｌｃｙｃｌｅｒｅｌａｔｉｖｅｖａｌｕｅｏｆＨｅｍｉｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄＫ５６２ｃｅｌｌｓ图３㊀Ｋ５６２细胞生长曲线Ｆｉｇ.３㊀Ｋ５６２ｃｅｌｌｓｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅ图４㊀Ｋ５６２细胞存活率Ｆｉｇ.４㊀Ｋ５６２ｃｅｌｌｓｖｉａｂｉｌｉｔｙ流式图Ｓ期㊁Ｇ０/Ｇ１期和Ｇ２/Ｍ期呈明显的３群ꎮ间隔时间增加ꎬＢｒｄＵ＋的细胞群２Ｎ处的细胞逐渐向４Ｎ处偏移ꎮ４ｈ时ꎬＢｒｄＵ＋细胞群在２Ｎ处出现一小群细胞ꎬ代表ＢｒｄＵ＋进入了子代细胞ꎮ由此ꎬ推算出Ｇ２/Ｍ期的时长为４ｈꎮ接下来ꎬ可见ＢｒｄＵ＋细胞在２Ｎ处的细胞群逐渐积累ꎬ直至间隔时间为９ｈꎬ２Ｎ与４Ｎ之间的细胞群消失ꎬ此时代表Ｓ期结束ꎬ即Ｓ期的时长为９ｈꎮ在１１ｈ时ꎬＢｒｄＵ＋细胞在２Ｎ处的细胞群开始从２Ｎ向２Ｎ￣４Ｎ迁移ꎬ即代表进入到新的Ｓ期ꎬＧ０/Ｇ１期的结束ꎬ那么Ｇ０/Ｇ１期的时长为１１ｈ减去４ｈꎬ即为７ｈꎮ综上所述ꎬ通过流式图中ꎬＢｒｄＵ＋细胞的动态变化过程ꎬ我们推算出了Ｇ２/Ｍ期约为４ｈꎬＳ期约为９ｈꎬＧ０/Ｇ１期约为７ｈꎬ故倍增时间约为２０ｈ(图５)ꎮＢｒｄＵ间隔染色测定分析Ｋ５６２倍增时间的方法与利用生长曲线公式法推测倍增时间相符ꎬ证明了ＢｒｄＵ间隔染色技术方法的准确性ꎮ２.５㊀Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞的倍增时间及各期时长利用ＢｒｄＵ间隔染色ꎬ对Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞的倍增时间和各期时长进行了流式分析ꎬ可３１４马艺戈ꎬ等:氯化高铁血红素诱导Ｋ５６２细胞红系分化对其细胞周期的影响. All Rights Reserved.表１㊀生长曲线公式法推测Ｋ５６２倍增时间Ｔａｂｌｅ１㊀Ｋ５６２ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅｂｙｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｆｏｒｍｕｌａｍｅｔｈｏｄ对数生长期初始值/个对数生长期观察值/个间隔时间/ｈ倍增时间/ｈＮ０ＮｔＴ０Ｎ０２ˑ１０５４.７４６ˑ１０５２４１９.２５１２ˑ１０５４.１００ˑ１０５２４２３.１７４２ˑ１０５４.４００ˑ１０５２４２１.０９９２ˑ１０５４.８４０ˑ１０５２４１８.８２０２ˑ１０５５.０４０ˑ１０５２４１８.８２３Ａ:Ｋ５６２细胞ＢｒｄＵ间隔染色流式图ꎻＢ:Ｋ５６２细胞倍增时间及各期时长图５㊀间隔染色结合流式分析Ｋ５６２细胞倍增时间及各期时长Ｆｉｇ.５㊀ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅａｎｄｄｕｒａｔｉｏｎｂｙｉｎｔｅｒｖａｌｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓ见Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞随着时间间隔的增加ꎬＢｒｄＵ＋细胞也具有动态的变化规律ꎮ当间隔时间为０ｈꎬＢｒｄＵ与７￣ＡＡＤ双染的流式图呈明显的３群ꎮ随着间隔时间增加至５ｈꎬＢｒｄＵ＋细胞群在２Ｎ处出现一小群细胞ꎬ推算出Ｇ２/Ｍ期的时长为５ｈꎮ当间隔时间为１１ｈ时ꎬＢｒｄＵ＋细胞群２Ｎ与４Ｎ之间的细胞完全消失ꎬ推算出Ｓ期的时长为１１ｈꎮ当间隔时间为１２ｈ时ꎬＢｒｄＵ＋细胞在２Ｎ处的细胞群开始从２Ｎ向２Ｎ￣４Ｎ迁移ꎬ那么Ｇ０/Ｇ１期的时长为１２ｈ减去５ｈꎬ即为７ｈ(图６)ꎮ由此ꎬ通过流式图中ꎬ我们推算出了Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２红系分化细胞Ｇ２/Ｍ期约为５ｈꎬＳ期约为１１ｈꎬＧ０/Ｇ１期约为７ｈꎬ故倍增时间约为２３ｈꎮ未诱导的Ｋ５６２细胞总倍增时间约为２０ｈꎬＳ期的时长约为９ｈꎻ由Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞总倍增时间约为２３ｈꎬＳ期约为１１ｈꎮＨｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞倍增时间和各期时长与未诱导的Ｋ５６２细胞周期时长的差异不具有统计学意义(Ｐ>０.０５)(图６Ｃ)ꎮ因此ꎬＫ５６２细胞诱导红系分化进程不影响其细胞周期总倍增时间和各期时间长短ꎬ即不影响细胞周期的绝对值ꎮ４１４生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.Ａ:Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２分化细胞ＢｒｄＵ间隔染色流式图ꎻＢ:Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２分化细胞倍增时间及各期时长ꎻＣ:Ｈｅｍｉｎ诱导Ｋ５６２分化细胞对细胞周期时间长度的影响(Ｐ>０.０５)ꎮ图６㊀间隔染色结合流式分析Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２红系分化细胞倍增时间及各期时长Ｆｉｇ.６㊀Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｈｅｍｉｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄＫ５６２ｃｅｌｌｓｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅａｎｄｄｕｒａｔｉｏｎｂｙｉｎｔｅｒｖａｌｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓ３㊀讨论利用体外培养的细胞系作为细胞模型ꎬ是研究体内生物学发生过程的重要研究手段ꎮ人慢性髓系白血病Ｋ５６２细胞是研究红细胞㊁粒细胞㊁单核细胞相关疾病和治疗机理的重要体外细胞系模型ꎬ可通过特定条件诱导体外分化[１４]ꎮＨｅｍｉｎ是血红素氧化产物ꎬ诱导Ｋ５６２细胞红系分化进程ꎬ促进了红系转录因子ＧＡＴＡ￣１和ＮＦ￣Ｅ２的表达ꎬ并且能够诱导Ｋ５６２细胞中血红蛋白表达[１５]ꎮ本研究利用联苯胺染色确定Ｈｅｍｉｎ成功诱导了Ｋ５６２细胞红系分化ꎮ在Ｈｅｍｉｎ诱导的Ｋ５６２细胞中ꎬ发现红系分化的Ｋ５６２细胞并未改变细胞周期Ｇ０/Ｇ１期㊁Ｓ期和Ｇ２/Ｍ期三期的比例ꎬ即细胞周期相对值无明显变化ꎮ本研究首次将ＢｒｄＵ间隔染色这一技术应用到了Ｋ５６２细胞系的倍增时间和各期时长的测量中ꎬ该技术通过普及性较高且操作人性化的流式细胞术ꎬ分析不同时间间隔ＢｒｄＵ与７￣ＡＡＤ双染的细胞群的动态变化ꎬ从而检测Ｋ５６２细胞的倍增时间和各期时长ꎬ其结果同生长曲线法结果一致ꎮ这一技术准确性较高ꎬ且无需结合其他实验操作即可从图像中直观判断出细胞周期各期时长和细胞周期总倍增时间ꎮ同时ꎬ应用该方法检测了Ｈｅｍｉｎ诱导红系分化的Ｋ５６２细胞对细胞周期的影响ꎬ发现Ｈｅｍｉｎ诱导红系分化的Ｋ５６２细胞对细胞周期倍增时间和各期时长无明显作用ꎮ综上ꎬ结合细胞周期相对值和绝对值的检测结果ꎬＨｅｍｉｎ诱导Ｋ５６２红系分化未对细胞周期造成明显影响ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀詹启敏ꎬ陈杰.细胞周期与肿瘤转化医学[Ｊ].中国肿瘤临床ꎬ２０１４ꎬ４１(１):１－７.[２]㊀ＢＡＬＫＨＩＭＹꎬＦＩＴＺＧＥＲＡＬＤＫＡꎬＰＩＴＨＡＰＭ.ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＭｙＤ８８￣ａｃｔｉｖａｔｅｄｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ５ｂｙＫ６３￣ｌｉｎｋｅｄｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍｏｌ.ＣｅｌｌＢｉｏｌ.ꎬ２００８ꎬ２８(２４):７２９６－７３０８.[３]㊀ＥＣＯＮＯＭＯＰＯＵＬＯＵＣꎬＰＡＰＰＡＶꎬＰＡＰＡＧＥＯＲＧＩＯＵＳꎬｅｔａｌ..Ｃｅｌｌｃｙｃｌｅａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｄｅｎｏｖｏｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｓ(ＭＤＳ)[Ｊ].Ａｎｎ.Ｈｅｍａｔｏｌ.ꎬ２０１０ꎬ８９(４):３４９－３５８.５１４马艺戈ꎬ等:氯化高铁血红素诱导Ｋ５６２细胞红系分化对其细胞周期的影响. All Rights Reserved.[４]㊀ＮＡＳＭＹＴＨＫ.Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ:Ｐｕｔｔｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｉｎｏｒｄｅｒ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ１９９６ꎬ２７４(５２９３):１６４３－１６４５.[５]㊀ＣＬＡＵＤＩＯＭＦꎬＢＥＴＩＡＮＡＮＳꎬＲＢÉＮＡＧꎬｅｔａｌ..Ｈｅｍｉｎｉｎｄｕｃｅｓｍｉｔｏｐｈａｇｙｉｎａｌｅｕｋｅｍｉｃｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅ[Ｊ].Ｂｉｏｌ.Ｃｅｌｌꎬ２０１６ꎬ１０８(４):７７－９５.[６]㊀李慧ꎬ周华友ꎬ代喜平ꎬ等.氯化高铁血红素诱导Ｋ５６２细胞红系定向分化细胞模型的构建[Ｊ].广东医学ꎬ２０１６ꎬ０３７(０１９):２８６３－２８６７.[７]㊀ＦＵＳＡＫＯＮＡꎬＭＩＫＩＫＯＳＨꎬＴＯＭＯＫＯＳＡꎬｅｔａｌ..Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｐ４５０ｇｅｎｅｓｉｎＨｅｍｉｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄ￣ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄＫ５６２ｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｌ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｕｌｌ.ꎬ２００７ꎬ３０(１０):１９５４－１９５７.[８]㊀ＰＡＬＭＡＪＦꎬＧＡＯＸꎬＬＩＮＣＨꎬｅｔａｌ..ＩｒｏｎｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎＩＸ(Ｈｅｍｉｎ)ｂｕｔｎｏｔｔｉｎｏｒｚｉｎｃｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎＩＸｃａｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＫ５６２ｃｅｌｌｓｆｒｏｍｅｎｈａｎｃｅｒｅｌｅｍｅｎｔｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｆｏｒＮＦ￣Ｅ[Ｊ].Ｂｌｏｏｄꎬ１９９４ꎬ８４(４):１２８８－１２９７.[９]㊀ＤＯＬＢＥＡＲＥＦꎬＧＲＡＴＺＮＥＲＨꎬＰＡＬＬＡＶＩＣＩＮＩＭＧꎬｅｔａｌ..ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｔｏｔａｌＤＮＡｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｉｎｃｏｒｐｏ￣ｒａｔｅｄｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ[Ｊ].Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡꎬ１９８３ꎬ８０(１８):５５７３－５５７７.[１０]㊀ＳＴＥＶＥＮＳＯＮＡＰꎬＭＡＲＴＩＮＪＣꎬＳＴＥＷＡＲＴＣＣ.Ｓｉｍｕｌｔａｎｅ￣ｏｕｓｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｏｓｔａｓｉｓａｎｄｃｙｔｏｔ￣ｏｘｏｃｉｔｙｏｆＥＭＴ６ｃｅｌｌｓｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].ＣａｎｃｅｒＲｅｓ.ꎬ１９８６ꎬ４６(１):９９－１０５.[１１]㊀ＬＩＵＬＪꎬＭＩＣＨＯＷＳＫＩＷꎬＩＮＵＺＵＫＡＨꎬｅｔａｌ..Ｇ１ｃｙｃｌｉｎｓｌｉｎｋｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎꎬｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｎａｔ.ＣｅｌｌＢｉｏｌ.ꎬ２０１７ꎬ１９(３):１７７－１８７. [１２]㊀严泉剑ꎬ李六金ꎬ张宇梅ꎬ等.生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算[Ｊ].第四军医大学学报ꎬ２００２ꎬ２３(１０):９２３－９２３.[１３]㊀ＭＡＲＫＴＤꎬＳＥＵＮＧＪＩＮＳꎬＪＩＡＪＷꎬｅｔａｌ..Ｄｙｎａｍｉｃｔｒａｎ￣ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｙｐｒｏｆｉｌｅｓｒｅｖｅａｌｋｅｙｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｄｕｒｉｎｇｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｉｃａｎｄｅｒｙｔｈｒｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１４ꎬ１１１(１０):２０８２－２０９４. [１４]㊀ＴＯＳＣＡＮＯＭＧꎬＮＡＶＡＲＲＯ￣ＭＯＮＴＥＲＯＯꎬＡＹＬＬＯＮＶꎬｅｔａｌ..ＳＣＬ/ＴＡＬ１￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｎｅｔｗｏｒｋｅｎｈａｎｃｅｓｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｉｃｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｔｈｅｒ.ꎬ２０１５ꎬ２３(１):１５８－１５８.[１５]㊀ＮＯＢＵＹＵＫＩＴꎬＥＬＩＭꎬＫＡＺＵＨＩＫＯＩꎬｅｔａｌ..Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｇｏｖ￣ｅｒｎｉｎｇｈｅｍｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒｅｖｅａｌｓａＧＡＴＡｆａｃｔｏｒ/ｈｅｍｅｃｉｒｃｕｉｔｔｈａｔｃｏｎｔｒｏｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ[Ｊ].ＥＭＢＯＲｅｐ.ꎬ２０１６ꎬ１７(２):２４９－２６５.６１４生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。

K562细胞分化过程中基因转录调控的跨组学整合研究开题报告

K562细胞分化过程中基因转录调控的跨组学整合研究开题报告一、研究背景和意义人类K562细胞系是一种可以自发分化为红细胞的慢性髓样白血病细胞系，具有重要的临床应用价值。

通过对K562细胞分化过程中基因转录调控的研究，可以深入了解白血病发病机制、探索新型抗癌药物的研发方向等。

同时，随着跨组学技术的不断发展，研究者们可以使用基因组、转录组、表观组等多种层次的分析方法，从不同角度揭示K562细胞分化过程中的关键基因和信号通路，为疾病诊断和治疗提供新思路。

二、研究内容和方法本研究计划采用跨组学的整合分析方法，结合基因组、转录组、表观组等多个层面对K562细胞分化过程中基因转录调控进行深入探究。

具体研究内容和方法包括：1. 分离K562细胞系并进行分化处理，收集分化不同阶段的细胞样本。

2. 对不同阶段的细胞样本进行基因组学、转录组学测序和表观组学分析。

3. 采用生物信息学方法对多组数据进行整合，构建基因与转录因子以及表观修饰之间的互作网络图。

4. 验证网络图中预测的关键转录因子和核心基因的作用和调控机制，包括基因敲除、RNA干扰、药物干预等方法。

5. 通过介导关键转录因子和核心基因的表达调节，验证研究结果对癌细胞生长和分化的影响，并探究其潜在的治疗效果。

三、研究意义和预期结果本研究通过跨组学的整合分析，将揭示K562细胞分化过程中基因转录调控的关键因素和作用机制，发现新的调控通路和潜在的治疗靶点。

预期结果包括：1. 建立K562细胞分化过程的基因转录调控网络图，明确核心转录因子和基因的作用和调控机制。

2. 发现新的调控通路和信号通路，为疾病诊断和治疗提供新思路。

3. 验证网络图中的核心转录因子和基因的作用和调控机制，提供新的治疗靶点和药物策略。

4. 探究关键转录因子和核心基因在癌细胞生长和分化中的作用，为白血病治疗提供新思路。

总之，本研究的成果将对癌症研究和治疗具有重要的理论与实践意义。

人白血病细胞K562增殖的作用

人白血病细胞K562增殖的作用白血病是造血系统的恶性肿瘤，其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞成分发生恶性增殖，并浸润体内各脏器组织，导致正常造血组织细胞受抑制，产生各种症状。

目前，对于此类疾病的治疗主要采取传统的化疗手段，标准的化疗方案仅能使40%~60%患者获得暂时缓解，中位生存期一般不超过3a。

大剂量化疗联合造血干细胞移植可使缓解率明显提升，但除了极少数患者以外，其余大多数仍难免会复发，其显著的不良反应使得患者的生活质量和治疗信心受到严重影响。

因此，寻找高效低毒的治疗药物，显得尤为重要。

我们以K562细胞作为研究对象，探讨力达霉素（LDM）抗白血病的可能机制。

1材料K562细胞（本室保存）；LDM（由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏院士惠赠）；RPM-1640（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Biological公司）；MTT（噻唑蓝）法检测细胞增殖及细胞毒性试剂盒（南京凯基）；苔盼蓝；兔抗人肿瘤坏死因子（TNF-α）抗体（美国Affinity公司）；Betaactin（β肌动蛋白）抗体（美国Affinity公司）2方法2.1细胞培养K562细胞株从液氮中复苏后，用含10%胎牛血清的RPM-1640培养液在37℃，5%CO2恒温培养箱中培养，所有实验均采用对数生长期细胞。

2.2细胞增殖的检测在96孔板加入细胞100μl/孔（约1×104），置37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h后，加入不同浓度力达霉素（LDM），再于恒温培养箱孵育48h，加入50μlMTT，37℃孵育4h，使MTT还原为甲臜，1000g离心，吸出上清，每孔加入150μl二甲亚砜（DMSO）使甲臜溶解，平板摇床摇匀，于490nm波长处检测每孔的吸光度（A）值，计算细胞成活率。

2.3细胞的计数离心收集K562细胞，制备单细胞悬液并作适当稀释，细胞悬浮液与台盼蓝溶液以9∶1混合混匀，在3min内分别计数活细胞和死细胞，计算活细胞率。

诱导K562细胞向红系分化的中药血清药理学方法探讨

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作者简介：郭志梅（!%)* $ ），女，河北张家口人，硕士研究生，医师。研究方向：小儿血液与遗传学。 W=P：（"&"） ’!’*!%&% 通讯作者：钱新华（!%*% $ ），女，湖北武汉人，博士，博士生导师，教授。主任医师。研究方向：小儿血液与遗传学。 W=P：（"&"） ’!’*!%&%
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K562细胞红系诱导分化方法的实验研究

K562细胞红系诱导分化方法的实验研究傅泳航;郑凤娇;李治华【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2012(18)5【摘要】Objective To establish an efficient induction of K562 cells erythroid differentiation. Methods The effect of different inducing methods of K562 cells erythroid differentiation were compared, the compositions and dose were optimized to establish a highly efficient erythroid induction method, the identification indicators were cell morphology and benzidine staining positive rate count, further exploringof erythroid differentiation was performed by RT-PCR to test the cell membrane marker band3 protein ( band3 ) expression. Results The percentage of benzidine-positive cells induced by the optimized condition was ( 52. 7 ±8. 2 )% at 120 hours; RT-PCR showed the mRNA level ofband3 was significantly higher than the non-induced group( P < 0. 01 ). Conclusion Several synergistic signaling pathways are involved in erythroid differentiation of K562 cells, multi-factors co-induction can significantly enhance K562 cells erythroid differentiation.%目的建立一种高效K562细胞红系诱导分化方法.方法比较不同方法对K562细胞红系诱导分化的效果,优化诱导剂成分组合和剂量组合,建立一种高效的红系诱导,鉴定指标选用细胞形态学、联苯胺染色阳性率计数及RT-PCR测定红系细胞标志物膜带3蛋白(band3)的表达.结果多因素协同诱导K562细胞红系分化120 h后,显微镜下观察细胞形态呈红系中、晚期特征,联苯胺染色阳性率可达(52.7±8.2)%,红系标志物band3在mRNA水平明显高于对照组(P<0.01).结论多条信号途径协同参与K562细胞红系分化的过程,多因素共同诱导可显著提高K562细胞的红系分化.【总页数】3页(P785-787)【作者】傅泳航;郑凤娇;李治华【作者单位】解放军空军458医院检验科,广州,510602;解放军空军458医院检验科,广州,510602;解放军75130部队,广西,贵港,537103【正文语种】中文【中图分类】R733.7【相关文献】1.氨基甾体H42648对K562白血病细胞系的抑制增殖和诱导分化作用 [J], 尹雅玲;何群2.诱导K562细胞向红系分化的中药血清药理学方法探讨 [J], 郭志梅;钱新华3.VP16对人类白血病细胞系K562细胞诱导分化作用的研究 [J], 牟金亭;贾庆瑞;马兰芳;武传涛;张风英;武玉玲4.K562细胞红系诱导分化过程中血红蛋白基因与过氧化氢酶基因的表达变化 [J], 剧锦哲;马强;贾小娥;李冯锐;魏春华;苏燕5.当归多糖对K562细胞增殖抑制及定向红系细胞分化的实验研究 [J], 宋姝丹;王建伟;王亚平;姜蓉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

阳离子脂质体-siRNA复合物对K562细胞凋亡诱导的作用机制

阳离子脂质体-siRNA复合物对K562细胞凋亡诱导的作用机制作者：王保全陈江涛申智慧周黎明李文倩史朝辉翟巧玲张永州来源：《中国现代医生》2022年第25期[摘要] 目的制备新型阳离子脂质体–siRNA复合物，并探讨其对K562细胞凋亡的诱导作用及作用机制。

方法通过逆向蒸发技术制备阳离子脂质体复合物，以K562细胞为模型，使用不同浓度的脂质体–siRNA复合物转染K562细胞，MTT法测定脂质体–siRNA复合物对K562细胞生长的影响，流式细胞术检测脂质体–siRNA复合物对K562细胞周期的影响，反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT–PCR）和蛋白质印迹法检测脂质体–siRNA复合物对K562细胞相关mRNA及蛋白表达的影响。

结果与对照组相比，脂质体–siRNA复合物轉染K562细胞增殖受到明显抑制，流式细胞术检测结果显示，阻滞于G1期细胞明显增多（P＜0.05），而S期和G2/M期细胞显著减少（P＜0.05），RT–PCR和蛋白质印迹法结果显示，随着脂质体–siRNA复合物浓度的增加，K562细胞中bcl–2蛋白及mRNA表达水平均显著降低（P＜0.05），bax、caspase–3蛋白及mRNA表达水平均显著升高（P＜0.05）。

结论新型脂质体–siRNA复合物转染率高，且沉默效果显著，可下调bcl–2基因，上调bax、caspase–3基因，进而促进K562细胞凋亡，有望成为慢性粒细胞白血病基因治疗的高效药物传递系统。

[关键词] 脂质体–siRNA复合物；K562细胞；慢性粒细胞白血病；凋亡诱导[中图分类号] R91 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2022）25-0031-05[Abstract] Objective To prepare a novel cationic liposome–siRNA complex， and to explore the apoptotic induction of K562 cells induced by liposome–siRNA complex and its mechanism. Methods Cationic liposome complex was prepared by reverse evaporation. K562 cells were used as a model and transfected with different concentrations of liposome–siRNA complex， MTT assay was used to detect the effect of liposome–siRNA complex on K562 cell proliferation. Flow cytometry was used to detect the effect of liposome–siRNA complex on K562 cell cycle. The mRNA and protein expression of bcl–2， bax and caspase–3 in K562 cells were detected by reverse transcription polymerase chain reaction （RT–PCR） and Western blotting. Results Compared with control group， the proliferation of K562 cells transfected with liposome–siRNA complex was significantly inhibited， and the flow cytometry results showed that K562 cells in G1 phase were significantly inceased （P<0.05），while cells in S phase and G2/M phase were significantly decreased （P<0.05）. RT–PCR and Western blotting results showed that the expression levels of bcl–2 protein and mRNA were significantly decreased （P<0.05）， the expression levels of bax、caspase–3 protein and mRNA were significantly increased （P<0.05）， with the increase of the concentration of liposome–siRNA complex. Conclusion The novel liposome–siRNA complex has high transfection rate and significant silencing effect， and can down–regulate bcl–2 gene， up–regulate bax and caspase–3 genes， and promote K562 cell apoptosis， which is expected to become an efficient drug delivery system for gene therapy of chronic melogenous leukemia.[Key words] Liposome–siRNA complex; K562 cell; Chronic myelogenous leukemia; Apoptosis inductionRNA干扰（RNA interference，RNAi）是指细胞在发展进程中高度保守的、由双链RNA （double– stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源信使RNA（messenger RNA，mRNA）高效特异性降解的现象[1]。

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结果随着诱导的进行，对照和敲低细胞中的珠蛋白基因ＨＢＥ和ＨＢＧ表达均逐渐升高，但ＣＴＣＦ敲
低细胞中ＨＢＥ和ＨＢＧ基因水平均低于对照细胞，提示ＣＴＣＦ敲低能够抑制Ｋ５６２细胞分化过程中珠蛋白基因的表达。通过检测全基因组范围的基因表达水平，共筛选到１１２８个差异表达基因，其中
ＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０１，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙ
ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４￣Ｃｈｉｎａ；３．Ｓｉｎｏ－ＤａｎｉｓｈＣｏｌｌｅｇｅ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，
敲低ＣＴＣＦ能够降低ＧＡＴＡ１在ＡＬＡＳ２基因区的结合。结论ＣＴＣＦ可能通过影响ＧＡＴＡ１在
基因区的结合来调控Ｋ５６２细胞红系分化。
【关键词】ＣＴＣＦ；
；ＧＡＴＡ１；红系分化
ＣＴＣＦｒｅｇｕｌａｔｅｓｅｒｙｔｈｒｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＫ５６２ｔｈｒｏｕｇｈＡＬＡＳ２
ｄｏｎｇｌ。ｒｌＣＡＳＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｅｎｏｍｅＳｃｉｅｎｃｅｓ＆Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｏｍｉｃｓ，Ｃｈｉｎｅｓ中表达上调，５１２个基因表达下调。利用ＩＰＡ软件进行功能富集分析，
显示主要相关的生理系统发育与功能包括血液系统的发育与功能。公共数据显示存在ＣＴＣＦ－ＧＡＴＡ１．
ＡＬＡＳ２作用关系，ＡＬＡＳ２基因上存在ＧＡＴＡ１结合；对照和ＣＴＣＦ敲低细胞的Ｃｈｉｐ．ｑＰＣＲ结果表明，
【摘要】目的研究ＣＴＣＦ对红系分化的影响及相应调控机制。方法敲低Ｋ５６２细胞中的ＣＴＣＦ，通过Ｈｅｍｉｎ诱导和荧光实时定量聚合酶链反应（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ — ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑＲＴ－ＰＣＲ）
《发育医学电子杂志》２０１７年１月第５卷第１期
ＪＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＭｅｄ，Ｊａｎ２０１７，Ｖｏ１．５，Ｎｏ．１
论著・
ＣＴＣＦ通过
亓合媛，李艳明熊倩
调控Ｋ５６２细胞红系分化
谢兵兵Ｌ张昭军Ｌ方向东（１．中国科学院
北京基因组研究所
院大学
１００１９０）
基因组科学与信息重点实验室，北京１００１０１；２．中国科学
生命科学学院，北京１０００４９；３．中国科学院大学中丹学院，北京
Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９￣ｃｈｉｎａ）
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＦＡＮＧＸｉａｎｇ－ｄｏｎｇ（Ｅｍａｉｈｆａｎｇｘｄ＠ｂｉｇ．ａｃ．ｃ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ｏｂｊｅｅｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＣＴＣＦｄｕｒｉｎｇｅｒｙｔｈｒｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｔ
技术，分析Ｈｅｍｉｎ诱导０到４天的对照和ＣＴＣＦ敲低细胞的珠蛋白基因表达水平，研究ＣＴＣＦ敲低对
红系分化的影响。利用基因表达芯片全基因组范围分析ＣＴＣＦ敲低造成的影响。根据公共数据分析推
测ＣＴＣＦ调控红系分化的潜在机制，通过染色质免疫共沉淀（ｃｈｒｏｍａｔｉｎｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣＨＩＰ）验证。
ＯＩＨｅ－ｙｕａｎＬ２ＬＩＹａｈ — ｍｉｎｇ２。ＸＩＯＮＧＱｉａｎ２ＸＩＥＢｉｎｇ．ｂｉｎｇ２，ＺＨＡＮＧＺｈａｏ－ｊｕｎｉ，ＦＡＮＧＸｉａｎｇ —