土壤总DNA的几种提取方法
土壤DNA提取
1 试验材料吉林省松江河镇人参栽培土壤。
每份土壤样品经多点取样后充分混匀，用前过10 目筛，去除土壤中的须根、枯枝等杂物[2]。
1 .2 仪器设备及药品电子分析天平、恒温水浴锅、紫外凝胶成像系统、电泳槽、电泳仪、高速冷冻离心机、微量加样器、PCR 仪等。
TENP 缓冲液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100mmol/L Na Cl，1% PVP，pH 10.0）、CTAB 提取缓冲液（100mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5mol/L Na Cl，1%CTAB，pH 8.0）、SDS 提取缓冲液（100 mmol/LTris，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L Na Cl，pH8.0，灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L）、异丙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、EB、Taq DNA 聚合酶、d NTP、6×凝胶上样缓冲液、DNAMarker 等。
主要试剂有十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、异硫氰酸胍，均为分析纯级。
1 .3 试验方法1.3.1 土壤微生物的洗涤取土壤样品2g，置于50m L 灭菌的离心管中；加入10m L TENP 缓冲液[3]悬浮土样，磁力搅拌器搅拌15 min；10000r/min 离心5min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本无色；最后将沉淀收集至1.5ml 离心管中。
1.3.2 DNA 的提取1.3.2.1 CTAB 法按照李钧敏[4]的方法略作改动。
将沉淀重悬于500μl CTAB 提取缓冲液→65℃水浴2h→8000r/min，室温离心15 min，取上清→加入等体积氯仿：异戊醇（24∶1），12,000r/min 离心10 min，取上清→加入0.6 倍体积的异丙醇，4℃淀过夜→12000 r/min 4℃离心20min 收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100 μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。
土壤dna提取方法
土壤dna提取方法土壤DNA提取是指从土壤样本中获取土壤微生物DNA的过程。
它是研究土壤微生物群落结构和功能的关键步骤之一。
土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，对土壤养分循环、生物地球化学循环和土壤质量具有重要影响。
因此，研究土壤微生物DNA有助于深入了解土壤生态系统的功能和稳定性。
土壤DNA提取方法可以根据不同的研究目的选择不同的方法。
下面我将介绍几种常用的土壤DNA提取方法。
1. CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法是最经典的土壤DNA提取方法之一。
它的原理是利用CTAB与DNA形成离子对，离子对会与蛋白质、多糖等溶于水的杂质结合，然后通过离心去除杂质，最后用溶剂将DNA沉淀下来。
这种方法的优点是提取得到的DNA质量较高，适用于较小的土壤样本。
但是，它的缺点是操作步骤繁琐，耗时长。
2. 磁珠法：磁珠法是一种常用的高通量土壤DNA提取方法。
它利用表面带电的磁珠与DNA结合，通过磁场将DNA捕获在磁珠上，然后用洗涤缓冲液去除杂质，最后用洗脱缓冲液将DNA从磁珠上溶解下来。
这种方法的优点是操作简单、快速，适用于大规模样本处理。
然而，提取得到的DNA质量可能较低，因为磁珠结合的特异性可能不如其他方法。
3. 快速法：快速法是一种在提取过程中省去DNA纯化步骤的方法。
其中，一种常用的快速法是表面粘贴法。
该方法通过在提取缓冲液中添加琼脂糖，并将土壤样本与缓冲液充分混合，将DNA留在微粒的表面上，然后通过离心将DNA粘在微粒上，最后用洗涤缓冲液去除杂质。
快速法的优点是操作简单、快速，适用于大规模样本处理。
但是，提取得到的DNA可能带有较多的杂质，对后续分析可能产生影响。
除了上述介绍的几种常用的土壤DNA提取方法外，还有其他一些特殊情况下使用的方法。
例如，对于硅酸盐土壤样品，可以使用硅酸盐法提取DNA；对于高含沙量的土壤样品，可以使用聚乙二醇（PEG）沉淀法提取DNA。
这些方法在不同的研究条件和样品类型下都有着特定的优势。
实验室土壤DNA提取方法
改良CTAB-SDS法1、称取1 g土壤样品，加1ml DNA提取液（0.1 mol/L Tris-Hcl；0.1 mol/L EDTA；0.1 mol/L 磷酸钠；1.5 mol/L Nacl；1％CTAB；pH 8.0,将各种试剂按配置的体积数称量混合即可。
），在漩涡震荡仪上混匀。
2、加入100ul溶菌酶温和37℃裂解30min,液氮冷冻10 min，65℃水浴10 min，反复冻融3次。
3、加入20％ SDS缓冲液溶液100µl，65℃水浴2h，每20 min轻轻颠倒几次。
8000 r/min离心10 min，取上清。
4、剩余残渣中再加500µl DNA提取液和100µl SDS 缓冲液，65℃水浴30 min，8000 r/min室温离心10 min，取上清，合并两次的上清液。
5、等体积的氛-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提2至3次(氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次)，静置10min，12000rpm，10min取上清。
6、加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的无水乙醇混匀，4℃沉淀过夜。
7、13000 r/min离心5 min，70%乙醇清洗2次，30µl ddH2O溶解。
8、提取粗DNA在0.6%（1%）的Agrose，70 V（100V）电压下电泳1.5 h（40min）。
注意事项：这个千万不要4℃过夜啊，4℃过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。
室温放置1－2h就好。
提取土壤微生物总DNA的纯度和浓度检测对提取的土壤微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,同时采用紫外分光光度计分别测定提取土壤微生物总DNA稀释液在230 nm，260 nm，280 nm处的光密度值。
以OD260/OD280（DNA/蛋白质），OD260/OD230（DNA/腐植酸）比值检测DNA纯度。
DNA浓度=OD260值×50µg／ml×80×DNA 溶液体积／干土质量[68]试剂的配置：1、0.1 mol/L Tris-HclTris（三羟甲基氨基甲烷），Mr = 121.14，称取12.114g Tris溶解900ml的蒸馏水中，加水定容至1000ml。
实验室土壤DNA提取方法
实验室土壤DNA提取方法1.样品收集和处理：首先，选择代表性的土壤样品进行采集。
可以使用一支消毒过的勺子或铲子，在表层土壤（0-10厘米深度）从多个点上采集土壤样品。
将采集的土壤样品放入带有滴涤酒精的消毒塑料袋中，密封并标记。
2.去除有机污染物：将收集的土壤样品放在室温下放置48小时，以除去土壤中的有机污染物。
然后，使用筛网（孔径为2毫米）将土壤样品筛选，以去除大颗粒物。
3.细胞破碎：将筛好的土壤样品放入5毫升的离心管中，加入细胞破碎缓冲液（含有Tris-HCl缓冲液、EDTA、蛋白酶K和SDS），并加入玻璃珠。
用震荡器将土壤样品在高速震荡下破碎数分钟，直至土壤样品完全均质。
4.DNA提取：将土壤样品离心10分钟，以除去残余的土壤颗粒物。
将上清转移到新的离心管中。
加入NaCl和CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）缓冲液，并轻轻倒置混匀。
将样品在65摄氏度的水浴中孵育30分钟。
加入异丙醇并轻轻倒置混匀，然后继续孵育5分钟。
用塑料吸管吸取上层的异丙醇溶液，避免吸取到DNA混淆物。
将异丙醇溶液转移至新的离心管中，并加入冷异丙醇，使DNA沉淀。
将离心管放置在-20摄氏度的冰箱中，孵育至少2小时，以沉淀DNA。
使用离心机将混悬液离心10分钟，以将沉淀的DNA分离出来。
去除上清液，并用70%乙醇洗涤DNA沉淀，以去除异丙醇和其他杂质。
将洗涤后的DNA沉淀风干，然后加入含有TE缓冲液（含有Tris-HCl和EDTA）的管中重溶。
对DNA溶液进行浓度和纯度检测，可以使用比色法或分光光度计来确定DNA的浓度和 A260/A280比值。
将DNA溶液储存在-20摄氏度的冰箱中，以便后续分析。
土壤DNA提取具有许多优点，如操作简单、成本低廉，并且可以获得大量的DNA，适用于各种微生物的遗传分析。
然而需要注意的是，土壤样品中存在有机物和多种离子，可能会对DNA提取的效果产生影响，因此在提取过程中需要仔细操作，以确保提取到高质量的DNA。
土壤微生物总DNA提取及其PCR优化
土壤微生物总DNA提取及其PCR优化土壤中的微生物是土壤生态系统中非常重要的组成部分，对于土壤的生物地球化学循环和植物生长起着至关重要的作用。
因此，了解土壤中的微生物群落结构和功能对于研究土壤生态系统和提高农田肥力具有重要意义。
土壤微生物群落分析通常需要进行土壤微生物总DNA的提取，并利用PCR技术对其进行检测和分析。
本文章将介绍土壤微生物总DNA提取的步骤，并对PCR反应进行优化。
1.土壤样品采集：将土壤样品收集到干净的塑料袋中，并尽快将其带回实验室进行处理。
2.土壤样品处理：将土壤样品通过筛网过滤，去除大颗粒物质。
然后，将土壤样品进行均匀混合，以保证提取的土壤微生物样品的代表性。
可以根据具体的研究目的和需求，选择不同的土壤样品处理方法，例如：酶处理、分离培养等。
3.DNA提取：根据所选用的DNA提取试剂盒的说明书，按照其提取方案进行操作。
一般而言，土壤微生物总DNA提取的步骤包括：细胞破碎、蛋白质沉淀、DNA溶解和纯化等步骤。
4. DNA质量检测：提取的土壤微生物总DNA可以通过紫外分光光度计或凝胶电泳等方法进行检测。
常用的DNA浓度检测方法为：通过分光光度计检测DNA的吸光度260 nm/280 nm比值，一般DNA的260 nm/280 nm比值在1.7-1.9之间为纯净的DNA样品。
PCR是一种被广泛应用于土壤微生物群落分析的技术，可以检测和分析微生物群落结构和功能。
下面是PCR反应优化的几个关键步骤：1.引物设计：选择适当的引物对于PCR反应的成功至关重要，引物应能够特异性地扩增所需的目标基因片段。
引物的设计可以根据所研究的微生物基因组序列进行，也可以利用已有的引物库进行。
2.酶和缓冲液优化：PCR反应中酶的选择和相应的缓冲液对于PCR反应的效果有着重要的影响。
可尝试不同品牌和类型的聚合酶和缓冲液，根据实验结果选择最适合的组合。
3.PCR温度参数优化：PCR反应的温度参数也会对PCR反应的效果产生重要影响。
茶园土壤微生物总DNA不同提取方法的比较
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实验室土壤DNA提取方法
实验室土壤DNA提取方法实验室土壤DNA提取方法是一种用于从土壤中提取DNA样品的技术。
这是一项重要的技术，因为土壤中的DNA可以提供有关土壤生物多样性、微生物群落结构和功能以及植物和动物遗传信息的重要信息。
下面将介绍一种常见的实验室土壤DNA提取方法。
1.样品预处理：-收集土壤样品，并尽可能在采样后尽快进行处理，以防止DNA的降解。
-选择一个代表性的土壤样品，并将其通过筛网去除大颗粒物质。
-将筛选后的土壤样品以适当的方式保存，通常可以在低温下冷冻保存。
2.细胞破碎：- 将约10克的土壤样品加入到一根离心管中，加入适量的细胞破碎缓冲液，如Tris-EDTA缓冲液。
-使用搅拌器或振荡器将样品彻底混合，以确保土壤颗粒和细胞完全被破碎。
-将混合后的样品通过离心将颗粒物质沉淀在底部，上清液转移到新的离心管中。
3.DNA纯化：-使用商业化的DNA提取试剂盒，按照厂家说明书的指导进行操作。
这些试剂盒通常包含各种缓冲液、酶和柱子等，可以高效地提取DNA。
-将上清液转移到新的离心管中，并加入适量的蛋白酶和蛋白酶K，以去除样品中的蛋白质。
-加入适量的盐溶液，以沉淀DNA。
沉淀后，使用吸管将上清液抽走。
- 将DNA沉淀物重新悬浮在适量的缓冲液中，如TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）。
4.DNA质量和浓度检测：-使用紫外-可见分光光度计测量DNA的浓度和纯度。
纯度可以通过A260/A280比值来评估，纯度范围在1.8-2.0之间较为理想。
-可以使用琼脂糖凝胶电泳等方法来检测DNA的大小和完整性。
需要注意的是，不同类型的土壤样品可能需要稍微不同的处理方法。
例如，含有高浓度有机物的土壤可能需要额外的酶处理步骤，以去除有机物的干扰。
此外，一些土壤样品可能需要通过使用特殊试剂或方法来克服DNA提取中的抑制剂。
总的来说，实验室土壤DNA提取方法是一项复杂的技术，需要仔细操作和优化。
通过正确地执行这些步骤，可以成功地从土壤样品中提取高质量的DNA，并为后续的分子生物学研究提供可靠的样品。
总DNA提取(蛋白酶K法)
改进蛋白酶K法提取环境微生物样品总DNA（Zhu S）
所需试剂:
0.15M NaCl
0.1M EDTA
1% SDS
NaAc (3M, pH 5.2)
蛋白酶K溶液20mg/ml (用无菌水配制)
溶菌酶溶液50mg/ml (用无菌水配制)
液氮
实验步骤：
(1)将适量环境样品（如土壤或污泥）装入1.5 ml Eppendorf管；
(2)加入1 ml 0.15M NaCl-0.1M EDTA；
(3)加入溶菌酶（sigma）至终浓度为2mg/ml并置于37℃水浴中温育1h；
(4)冻融三个循环（液氮3 min-65℃干热器3min）；
(5)分别加入蛋白酶K溶液和SDS至终浓度为0.02和0.5%（wt / vol每一百ml 溶
液中溶质克数），65℃温育1h；
(6)裂解液依次用等体积的酚、酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）、氯仿抽提；
(7)加入1/4体积的NaAc (3M, pH 5.2)和2体积冷的纯乙醇沉淀核酸；－20℃放
置1h；
(8)离心收集12000prm，10min，回收DNA沉淀；
(9)DNA沉淀用70%乙醇和无水乙醇洗涤后风干；
(10)每管加入30-50ulTE(Tris-HCl缓冲液)回溶及电泳检测，－20℃保存。
注：这种方法比较适合提取土壤环境微生物样品的总DNA。
因为本法没有利用机械力量破碎细胞，因而所提取到的总DNA受机械剪切的程度较少，故用这种方法提出的DNA进行PCR扩增，其产物通常含有较少的嵌合体（chimera）。
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土壤总DNA的几种提取方法
SDS 高盐法(方案1)
具体步骤:
称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末;
将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl 蛋白酶K(10 g/L ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r·min - 1振荡30 min ;
加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15～30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r·min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次;
用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r·min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中.
变性剂加SDS 高盐法(方案2)
具体步骤：
取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巯基乙醇) ;液氮冰冻,研磨至溶解,重复3 次;
转入50 ml 离心管中,加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 轻轻混匀1 次;5 000 r·min - 1 离心10 min ,取上清;
在原管中加入5 ml 提取缓冲液,混合后,65 ℃水浴10min ,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5 000 r·min - 1离心20 min ,取上清;加入0.6 倍体积的异丙醇,室温沉淀1 h ;20～25 ℃,12 000 r·min - 1离心20 min ,TE 溶解沉淀.
SDS-酚氯仿抽提法（方案3）
称取1g土壤样品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。
溶菌酶5mg，使终浓度为 2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min，加125ul 20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200Ul TE 溶解。
冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4）
取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0）, 加玻
璃珠旋涡5~10 min，在液氮中冷却1 min后迅速在沸水中煮2 min，如此重复3次，13 000r/min离心10 min。
上清夜快速置于冰上备用，沉淀用于进一步裂解。
将上述沉淀悬浮于0.2ml提取缓冲液中，旋涡10min，加入溶菌酶（100ml/l）50ul,轻轻混匀后，37C温浴30min，再加入250ul SDS 缓冲液（100 mmol/l Tris-HCl, 200 mmol/l NaCl,2.0% SDS, PH8.0）,上下颠倒10min，13000 r/min离心10min,收集上清夜。
二、DNA纯化
葡聚糖-200凝胶G离心层析纯化
取2ml灭过菌的一次性塑料注射器，用注射器推杆将灭过菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度约为0.5cm，然后向注射器筒中加入TE缓冲液浸透的葡聚糖凝胶G-200，制成简式离心层析柱，再置于10ml的离心管中，于高速冷冻离心机上以3000r/min离心20min，去除葡聚糖凝胶G-200中的TE缓冲液，将离心层析柱再置于另一10ml 的离心管中，在离心层析柱顶部加入50ul粗土壤DNA，以10 min为周期于3000r/min离心，分别收集层析液。
层析液浓缩至50ul
三、DNA的琼脂糖凝胶电泳
证明存在DNA。
四、DNA 的纯度和定量检测
用紫外分光光度计测量纯化后的DNA 溶液在波长为230 nm、260 nm、280 nm 下的OD 值，分别算出A260/A230及A260/A280值。
来估计DNA的纯度。
五、纯化后土壤DNA 的PCR扩增
PCR 反应体系为50μL ,模板为1μL 。
PCR反应引物（放线菌通用引物）:
反应条件: 94 ℃ 3 min 预变性; 94 ℃ 1 min , 56 ℃1 min ,72 ℃1 min ,30 个循环;72 ℃补平5 min。
PCR 产物用2 %的琼脂糖凝胶电泳检测。
六、检测扩增结果
凝胶电泳，用溴乙锭染色，在紫外光下检查结果。