管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策.
[技巧]管碟法
![[技巧]管碟法](https://img.taocdn.com/s3/m/de40b3d5d4bbfd0a79563c1ec5da50e2524dd1cd.png)
实验2 管碟法测定土霉素生物效价一、目的要求1、了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。
2、学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。
二、基本原理衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。
抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。
抗生素生物检定法是利用抗生素对细菌（或真菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量维生素中有效成分的效力的一种方法。
此法检测灵敏性高，由微量抗生素即可检出（0.5u/ml）。
因此，微生物检定法被作测定抗生素效价的一种经典方法。
生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
管碟法是扩散法的一种。
本实验采用管碟法测定抗生素的效价。
管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将抗生素溶液装满小杯，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u/ml)等因素有关。
抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。
因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。
将已知效价的土霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。
三、实验材料1、培养基（供摊布平板用）蛋白胨6g 酵母膏6g 牛肉膏1.5g 葡萄糖1g 琼脂15—18g蒸馏水1000ml pH:6.8 1.05kg/cm?/SPAN> 121.3?/SPAN>C灭菌20分钟2、菌种：黄色八叠球菌（Sarcina flava）3、土霉素碱标准品4、仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml,2ml,10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（5 00ml）、量筒（250ml,500ml,1000ml）、玻璃棒、温度计、牛津杯、镊子、培养盘、恒温箱、台秤等管碟法测定抗生素效价一、目的和要求1、了解管碟法的原理。
影响抗生素微生物检定法(管碟法)测定准确性的常见原因分析
８７５ 文章编号 ：１００１．８６８９（２０１８）０７—０８７５—０６
影 响抗生 素微生物检定 法（管碟法）测定 准确性的常见原 因分析
常艳 姚尚辰 胡昌勤
（中国食 品药 品检定研 究院 ，北京 １０２６２９）
摘要： 目的 总 结抗 生素微生 物检 定法（管碟法）中影响测定结果准确性 的常见系统误差并加 以控制 。方法 梳理 ｌ０余 年来 中检 院仲裁复验 的案例 ，对共性 问题进 行整理，找 出可能原 因，并采用单 一变 量实验设计的方式加 以确证 。结果 估计效价和 浓度 比的错误计算 、点样顺序和 点样 时间规 范性和 熟练程度 、试验标准菌株 的变异均会对 管碟法测定结果产生影响 。结论 通 过细化实验操作 规范，可以避免或尽量消除此类系统误差的影响 。
收稿 日期：２０１８．０５．３１ 基金项 目：中国食品药品检定研究院学科带头人培养基金（Ｎｏ．２０１５Ｘ４） 作者简介 ：常艳 ，女，生于１９８１年，硕士，副主任药师，主要从事抗生素活性研究 、统计分析应用 ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｐｌｅｐｌｅ＠１２６．ｔｏｍ 通讯作 者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｕｃｑ＠ｎｉｆｄｃ．ｏｒｇ．ｃａ
ＫｅＶ ｗｏｒｄｓ Ｔｈｅ ｍｉｃｒＯｂｉＯ１Ｏｇｉｃａｌ ａｓｓ；Ｔｈｅ ａｇａｒ ｄｉｆｌｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ａｃｃｕｒａｃｙ；Ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ
抗 生 素 微 生 物 检 定 法 也 称 抗 生 素 效 价 测 定 方 法 ， 是 利 用 抗生 素在 低 微 浓 度 下可 选 择 地 抑 制 或 杀 死 微 生物 的特 点 ， 以抗 生 素 的抗 菌 活 性 为 指 标 ， 来 衡 量 抗 生 素 中有 效 成 分 效力 的方 法 。该 方 法 自２０世 纪４０年 代建 立 至今 ，在 国际药 典 【－】和 各 国药 典 中被 普 遍 收载［２． ］。抗生素微生物检定方法可分为稀释法、 比浊法 和 （琼 脂）扩 散 法 ［７．ｉ０］。中 国药 典２０ １ ５年版 （ＣｈＰ
抗生素效价测定(管碟法)缺项的补救
抗生素效价测定(管碟法)缺项的补救引言:抗生素效价测定是评价抗生素抑制细菌生长能力的方法之一。
管碟法是一种常用的抗生素效价测定方法，但在实施过程中可能会出现缺项的情况。
本文将探讨抗生素效价测定(管碟法)缺项的补救方法。
一、缺项的原因抗生素效价测定(管碟法)中出现缺项的原因可能有多种，如实验操作失误、实验材料不足、数据记录错误等。
缺项会导致测定结果的不准确性，因此需要及时采取补救措施。
二、补救方法1. 重新进行实验如果只是个别的缺项，可以考虑重新进行实验。
在重新实验时，要注意核对试验操作步骤，确保实验的准确性和可靠性。
同时，还要确保实验材料的充足性，避免再次出现缺项的情况。
2. 数据插补如果缺项较多，或者实验条件无法重现，可以考虑进行数据插补。
数据插补是根据已有数据的规律和特点，通过一定的方法估计缺项的数值。
常用的数据插补方法有平均值插补、线性插补、多项式插补等。
选择合适的插补方法需要根据实际情况进行判断。
3. 参考文献补充如果实验中出现的缺项与文献中的数据相符，可以考虑参考文献中的数据进行补充。
在参考文献补充时，需要确保所选文献的可靠性和相关性，避免引入错误数据。
4. 数据分析与推测对于无法进行实验和数据插补的情况，可以通过数据分析和推测来补充缺项。
通过对已有数据的分析，可以获得一些相关规律和趋势，进而推测出缺项的数值。
数据分析与推测需要基于一定的统计方法和模型，确保推测结果的可靠性。
5. 结果说明与限制在补救缺项的过程中，需要对实验结果进行说明和限制。
说明实验中出现缺项的原因，以及所采取的补救方法和补充数据的可靠性。
同时，还要明确补救后结果的可靠程度和适用范围，避免误导他人。
三、注意事项1. 实验操作的准确性和规范性是避免缺项的关键。
在进行抗生素效价测定(管碟法)实验前，需要仔细阅读实验方法和操作要点，确保操作正确无误。
2. 实验材料的充足性和质量是保证实验可靠性的基础。
在进行实验前，需要检查实验材料的存储条件和有效期，确保实验材料的可靠性。
管碟法测定抗生素效价详解
4．放置钢管 用钢管放置器，将干热灭菌的镊子或适宜方法将钢 管装于玻璃管中，放于钢管放置器上，将双碟打开，放入双碟台上， 托起双碟台，使钢管平稳落在培养基上，注意使各个钢管下落的高 度基本一致，钢管放妥后，双碟静置 5 ～10 min, 使钢管在琼脂内稍 下稳定后，再开始加抗生素溶液。 5．滴加抗生素溶液 每批供试品取6~10个双碟，滴加溶液可调式 移液器，在滴加之前须用滴加液洗2~3次。滴加溶液的顺 序:SH→TH→SL→TL。滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不 可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。
• 结果判断 • 1. 可靠性测验结果认为可靠，方可进行效价和可信限率计算。 • 2.可信限率 考核实验的精密度，除药典各论另有规定外，本法的 可信限率不得超过5%。上述各项规定都能符合者，试验结果成立。 • 3. 实验计算 所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的 110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。 • 4. 效价测定 一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符合规 定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。
• 结果的可靠性检验及效价测定： 抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结 果。
记录与计算 1. 试验记录 应包括抗生素的品种、剂型、标示量、 生产厂、批号、检查目的、检验依据、检验日期、温 度、湿度，标准品与供试品的称量、稀释步骤与核对 人，抑菌圈测量结果。当用游标卡尺测量抑菌圈直径 时，应将测试数据以框图方式顺双碟数记录。当用测 量仪测量面积或直径时，应将电脑测试、计算、统计 分析的打印纸贴附于记录中。 2. 计算注意事项：a、浓度比不等于1.000时，如标准 品溶液（S）d的浓度为1005u/ml,而供试品溶液(T)的 浓度995u/ml，D=S/T=1.0101；也可将D值设为1.000， 而估计效价设为101.01% b、所测定的实际效价应在D值与估计效价乘积的90%和 110%范围内，超出就应重新估计效价。如估计效价为 100%，D=1.000，而测得的效价为115%，按110%重估效 价再进行试验。 C、原料及不合格供试品，进行平行试验，配置两份标准 品和两份供试品，一份标准品与一份供试品为一组滴 样
影响抗生素效价的因素
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策摘要：目的提高管碟法测定抗生素效价的准确性。
按操作步骤逐步，并提出合理的解决方案。
结果减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。
结论可以提高测定结果的准确性。
管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。
但是整个试验过程中结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。
根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。
1、实验器材的预备1.1实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。
可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判定双碟底面平整程度。
小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。
假如小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2实验器材的清洗抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。
由于清洗方面的原因，它们还是轻易残留上次试验中的抗生素或者被清洗用的杀菌剂污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。
因此，在清洗时要尤为注重多用流水冲洗。
160℃干热灭菌2h后备用。
2、配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基2.1样品与标准品溶液的配制标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。
供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。
称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。
标准品的称量最好用1/100，000克的分析天平，样品称量不得低于1/10，000克的分析天平。
天平中的干燥剂应保持经常注重更换。
称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。
稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。
管碟法效价测定中实验结果的影响因素及有效控制
参考文献 ：
［］ 王 １ ［］ 姚 ２ ［］ 刘 ３ 萍 甲硝唑治疗 细菌性 阴道病 患 者及其 配偶疗 效分 析． 安 荧， 汪 涛． 复方 甲硝唑 中空栓 的制备及 质量控制 ． 中国药 徽医药 ， ０ ， （ ） １ ． ２ ２６ ２ ： ０ ５
价， 是国内外常用 的方 法 ， 是生 物测定 中最 准确 、 也 最简便 的 方法 。但 是由于其操 作步骤 多 ， 实验过 程长 ， 细节 多， 要求 技
用 的固体 培养基 ， 好后 ｐ 配 Ｈ值 往往 发生 变化 ， 多数 偏低 ， 大 直接影 响细菌生长速度 及抗 生素在 培养基 中的扩散 。因此 ， 建议 配制 成品培养基时 ， 最好 调整 到细菌最 适 ｐ Ｈ值 ， 某些 试 验菌 生长 迅速 ， 如蜡样芽孢杆 菌 ， 可通过 降低 其 ｐ Ｈ值 促其 生
长缓慢 ， 从而使斜率变小， 增加生物反应灵敏度和测量准确
性 。例如 ， 乙酰螺旋 霉 素糖 衣片 效价 测定 Ｊ 将培 养基 的 ｐ ， Ｈ 值调节到 ８０— ． ， ． ８２ 效果 明显 。一 些抗 生素 ， 别是氨 基糖苷 特
术熟 练 ， 操作细致 ， 操作 中影响实验结果 的因素较多 。为 检定
维普资讯
安 徽 医 药
Ａ ｈ ｉ ａ ｄＰ ａｍ ｃｕｉ ｌ ｏ ｒａ ２ ０ ａ ｕｒ ；１ １ ｎ ｕ 胁 ｃ ｎ ｈｒ ａｅｔ ａ Ｊｕｎ ｌ ０ ７Ｊｎ ａｙ １ （ ） ｃ
・ ７・ １
管碟法效价 测定中实验 结果的影响 因素及有效控制
装灭 菌备 用。
１２ 培 养基的 ｐ ． Ｈ值 的 影响 抗 生素微 生 物效价 测 定 中常
关键 词 ： 抗生素 ； 管碟法 ； 圈 ； 抑菌 效价测定
抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析
发布日20070423期栏目化药药物评价>>化药质量控制标题抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析作者审评三部部门正文容审评三部审评五室英摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在方法学验证中的常见问题如线性与围中溶液浓度与直径的关系、精密度的测定方法等进行了分析，归纳其错误的问题，给出了正确的操作方法。
关键词：抗生素微生物检定法多组分抗生素方法学验证抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。
自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。
虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性；②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期化学分析法不可能完全取代微生物检定法。
中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。
一、方法的建立1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。
2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择可参照中国药典建立，在此不再赘述。
3、检定方法的确定可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。
一般确定线性与围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。
4、抗生素溶液的稳定性选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条件。
抗生素的生物效价测定法(管碟法)
抗生素的生物效价测定法(管碟法)work Information Technology Company.2020YEAR抗生素的生物效价测定法测定抗生素效价的方法比较多，一般可以分为物理学方法、化学方法、生物学方法、和两种方法配合等四大类，可根据具体情况选择使用。
生物学方法以抗生素的杀菌力作为衡量效价的标准，其原理恰好和临床应用于的要求一致这是它的优点；又其灵敏度较高，需用检品的量较小，也是其它方法所不及的。
抗生素的生物效价测定法，常用的有稀释法、比浊法和扩散法（或称渗透法）。
稀释法这一方法是用培养基将检品抗生素稀释到各种浓度，并依次分装到一系列的容器内，再加入等量“试验菌种”菌种菌液，并放在37 ℃保温箱内培养一定时间，观察何种稀释度适能抑制细菌的生长，该稀释度即为测定终点（或以细菌生长所引起的PH改变及溶血现象等生化反应作为测定终点），再与同样处理的标准抗生素的终点作比较，即可求得检品的效价。
这种方法可以使用液体培养基，也可以使用固体培养基。
所用的材料及培养基都必须严格无菌，并要注意无菌操作。
由于测定终点是以有无细菌生长来判断的，因此所得结果公是一个范围。
比浊法原理及操作大致与稀释法相同。
比浊法也是将不同量的检品及标准品分别加入培养基中，观察其对“试验菌种”的效应——即细菌生长所引起的混浊。
这一方法和稀释法的区别有二：a.比浊法的稀释间隔的密度比较近，准确度高一些；b.比浊法不以细菌有无生长的区分为终点，而是将标准品浓度和细菌生长所引起的混浊度求得一定的比例，再由检品的细菌生长混浊度推算检品的效价。
这一方法易受杂质的影响，并且不适用于有色或混浊的检品。
扩散法使用固体培养基，在培养基凝固以前将“试验菌种”混合进去，在这样备妥的培养表面，可以用种种设计使检品液或含有抗生素的物质与有菌种的培养基接触。
经过培育后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所能达到之下细菌不能生长因而形成透明的抑菌范围，此种范围一般都呈圆形，称为“抑菌圈”。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
管碟法测定抗生素效价中的影响因素分析及对策关键字:管碟法；抗生素；效价；抑菌圈摘要:目的提高管碟法测定抗生素效价的准确性。
方法按操作步骤逐步分析，并提出合理的解决方案。
结果减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。
结论可以提高测定结果的准确性。
Abstract: OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder-plate method. METHOD According to the process of test, ana lyze the test and offer a proper measure to avoid influenci ng factors. RESULTS Reduce the errors caused by environment al and artificial factors. CONCLUSION This can improve the veracity of test results.Key words: cylinder-plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。
但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。
根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。
1. 实验器材的准备1.1 实验器材的选择试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。
可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。
小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。
如果小钢管两端不够平，就应予剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。
1.2 实验器材的清洗抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。
由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。
因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。
160℃干热灭菌2h后备用。
2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基2.1 样品与标准品溶液的配制标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。
供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。
称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。
标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。
天平中的干燥剂应保持经常注意更换。
称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。
稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。
用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。
把稀释后的抗生素溶液分装至干燥灭菌试管待用。
在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。
所以配制抗生素溶液应单独使用一套工作服。
2.2 培养基与缓冲液的配制配制培养基与缓冲液时要按照文献的配比用量，配制后调节其pH值。
因为在pH值、盐浓度的影响下，即使琼脂培养基上的两个相邻的小管距离足够，还是可能会出现卵圆形抑菌圈。
例如四环素易受pH值影响，链霉素易受盐浓度影响[2]。
培养基可以购买厂家生产的产品，因为大批量产品中的成分配比较稳定，可比性较强。
116℃湿热灭菌20min后备用。
3. 加注培养基3.1 加注底层培养基无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。
菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。
我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证双碟放置区域的平整。
在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。
接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。
这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。
试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。
加注60～80℃的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。
因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。
3.2 加注培养基菌层制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。
当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。
因此，培养基应放在50℃水浴中保温。
当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养基上。
在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培养基，吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。
因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50℃水浴锅内保温。
试验中，再分别加入菌液混匀，配制成带菌琼脂。
震荡混匀后继续保温5min使培养基温度回升，然后直接倒在底层培养基上，转动双碟使培养基均匀铺开。
4. 放置小钢管放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。
管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。
可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记，试验中可以按照双碟底面标记放置小钢管，避免放置位置不恰当产生的问题。
小钢管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。
放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。
5. 滴加抗生素溶液滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二剂量法）或者SH→TH→SM→TM→SL→TL （三剂量法）的顺序滴加[3]。
滴加之前，滴管至少要用被滴液体冲洗3次。
在滴加抗生素到小钢管的时候，由于毛细管内抗生素溶液往往会有气泡或者毛细管开口端有液体残留，继续滴加容易造成气泡膨胀破裂，使溶液溅落在琼脂培养基表面造成破圈。
因此一旦毛细管中出现气泡或者残留，就重新吸取抗生素溶液进行滴加，毛细管口应避免太细，滴加的时候离开小钢管口距离不要太高。
滴加中若有溅出，可用滤纸片轻轻吸去，不致造成破圈。
在滴加中还有可能出现抗生素溶液滴入小钢管后，没有与琼脂培养基菌层接触，有一段空气被压在溶液与培养基之间，这样是不会产生抑菌圈的。
此时可以小心的用滴管吸出小钢管内的抗生素溶液，弃去。
换滴管重新滴加。
抗生素溶液滴加后，液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色。
（抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异。
）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余部分。
6. 双碟中菌株的培养滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。
在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。
双碟在37℃下培养约16h。
时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。
在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。
所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。
培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。
应经常注意温度，防止意外过冷过热。
7. 抑菌圈测量7.1 试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。
批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。
如若菌株不纯，也会造成这样的结果。
因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。
7.2 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。
不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。
不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。
记录测量结果后进行效价计算。
8.讨论试验中，往往会出现异常情况，使得试验结果与预期出现很大差异。
因此抗生素试验的每一步都需要仔细谨慎，严格按照操作规范，才可以得到准确的检测结果。
准确测定抗生素效价，对评价抗生素的治疗效果，指导临床应用都有着重要意义。