细胞培养准备
细胞生物学实验教学备课教案细胞实验的操作与观察
细胞生物学实验教学备课教案细胞实验的操作与观察细胞生物学实验教学备课教案前言：本教案旨在为细胞生物学实验的准备工作提供指导，包括实验的操作步骤和观察要点。
实验内容涵盖细胞培养、染色和观察等方面，旨在帮助学生了解细胞结构和功能，培养他们的实验技能和科学思维。
实验目的：通过本实验，使学生了解细胞的基本结构和功能，培养他们的实验能力和观察分析能力。
实验材料和仪器：1. 细胞培养物：如细菌培养物、动物细胞培养物等。
2. 细胞培养器具：如培养皿、离心管、移液器等。
3. 染色剂：如荧光染料、溴酶、乙酰酚染料等。
4. 显微镜和载玻片。
实验步骤：步骤一：准备工作1. 检查实验材料和仪器是否齐全。
2. 清洗工作台和实验器具，保持清洁。
步骤二：细胞培养1. 取出细胞培养物，根据需要进行适当的稀释。
2. 将细胞培养物分装到培养皿中，每个培养皿的细胞密度控制在适当水平。
3. 采用无菌操作，将培养皿放入恒温培养箱中，设定适当的温度和培养时间。
步骤三：细胞染色1. 取出培养皿中的细胞，使用适当的方法将细胞附着在载玻片上。
2. 准备染色溶液，根据实验需要选择合适的染色剂。
3. 将染色溶液滴在载玻片上，与细胞接触一定时间。
4. 用适当的方法将载玻片洗净，准备观察。
步骤四：观察和记录1. 将载玻片放置在显微镜上，调整镜头和光源，观察细胞的形态和染色效果。
2. 用目镜和物镜逐步调整焦距，获得清晰的细胞图像。
3. 用规定的倍率进行观察，并记录细胞的结构特征和染色的结果。
步骤五：数据分析与讨论1. 根据观察结果，总结细胞结构和功能的特点，并进行分析讨论。
2. 分析不同染色方式对细胞观察结果的影响。
3. 理解实验中可能出现的误差，并提出改进的方法。
步骤六：实验总结1. 总结实验的目的、步骤和观察结果，梳理实验过程中的关键点和问题。
2. 分析实验结果的意义和应用价值，并展望进一步的研究方向。
3. 总结实验中的收获和不足之处，提出改进的建议。
贴壁细胞传代培养步骤
贴壁细胞传代培养步骤
一、必要预备材料：
1.黏贴培养基；
2.细胞品系；
3.无菌棉签；
4.注射器；
5.脱硫酸盐卤素灯；
6.无菌细胞刀；
7.培养皿；
二、准备培养基:
1. 将黏贴培养基进行解冻，准备好用于细胞传代培养；
2. 用无菌棉签从瓶口处取出50 µl 培养基，用注射器注入培养皿中；
3. 使用脱硫酸盐卤素灯查看培养皿内的培养基，待培养基稳定后，将其置入培养箱中培养。
三、传代培养：
1. 进行一代细胞培养：将100 μl 细胞品系加入培养基，置入培养箱中培养；
2. 收集细胞：在品系培养至90%~100%阶段时，用无菌细胞刀将培养基连同其中的细胞一起取出；
3. 再生细胞：将细胞回收液均匀分散于新培养皿中，培养至细胞分裂
成熟；
4. 用冷冻融解法进行传代：将细胞悬液的容量加入超净水稀释，冷冻至-80℃后融解，充分混匀均匀后加入培养基中，开始进行传代培养。
四、最终传代注意事项：
1. 使用消毒过的相关器具，保证细胞不受污染；
2. 使用玻璃制品，避免细胞停滞或污染；
3. 确保培养箱的清洁，以免细胞污染；
4. 要保证培养条件的稳定,合理检查、温度、湿度及其他有效细胞培养条件；
5. 按时调整培养液、细胞活力，确保细胞传代培养质量。
细胞培养-实验前准备
放射灭菌
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紫外光射线 适用范围：控制空气污染，消毒物品表面 。 限制：对皮肤及眼有害，穿透力小，不能透 过玻璃。 电离辐射 适用范围：消毒对热敏感的外科器械等 。 限制：昂贵、需特殊装置。
0.22 ~0.45 µ m
过滤
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膜滤器
适用范围：对热敏感的液体，如血清和动物培养基。 限制：需先清除悬浮物质，一些有用的活性物质可能被 吸附掉。
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单独使用时，一般只用于空气和台面的消毒。如仅用 紫外线照射带菌的器皿，则无法彻底灭菌，所以应与 其他消毒方法结合使用，如先用75％的酒精浸泡，再 照紫外线消毒灭菌等。 ②检查消毒灭菌效果照射后为检查超净台是否达到无 菌效果，可在已照射的洁净台四角和酒精灯旁分别放 置5个含琼脂糖半固体培养基的直径90 mm培养皿， 20 min后再转入37℃培养箱中培养72 h，观察细菌生 长情况。如果每块平皿上无菌落生长，说明洁净台符 合无菌标准。
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玻璃器皿的灭菌包装 � 1 局部包装：较大器皿如培养瓶，烧杯，容量 瓶，三角瓶等以及体积较小瓶口包装方便的容 器如青霉素瓶等，采用局部包装。
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2 全包装：体积较小的培养皿、注射器、胶塞、 尽速器械（剪刀、镊子）等采用全包装。 1 直接装入率饭盒，再用细胞培养灭菌袋灭菌。 缺点：密封不严，不宜长时间使用。 2 纸包装， 要掌握正确包装方法，不要是锐器 扎破包装纸。
常用灭菌方法
物理灭菌法
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湿热灭菌:高温高压法、流动蒸汽或沸水 干热灭菌：烤箱、焚烧、酒精灯 射线照射灭菌：紫外线、电离辐射 过滤灭菌：微孔滤膜、玻璃丝滤器 超声射线消毒灭菌 主要使用6OCo、X射线进行消毒灭菌，可用于 牛血清和塑料制品的灭菌。 (2)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热 灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒 方法之一。 ①消毒方法 现在一般用无臭氧型紫外灯。消毒的效能与距离成反 比，：进行空气消毒时灯管应距地面2.5 m以内；台面的消毒应在 80 cm以内；培养器皿的消毒在30 cm以内。 消毒的时间与效能存 在一定关系，但不是绝对的：照射20 min后，有71％的细菌被消 灭；40 min后79％的细菌被消灭；60 min后86％的细菌被消灭。 紫外线照射时间再长也不是100％的灭菌，最多只能把90％的细菌 消灭，过长的照射是没有意义的。
细胞培养步骤
花鲈肌肉和肝脏组织细胞原代培养1.细胞培养准备工作准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。
具体工作如下：一、清洗（1）常用器具：细胞培养瓶、细胞培养板、培养皿、广口瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、电子天平、纱布、脱脂棉、止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀、解剖针、注射器、注射器过滤器、移液枪、枪头、离心管、细胞冻存管、酒精灯、试管架、超净工作台、倒置显微镜、生化培养箱、烘箱、液氮罐、封口膜、喷壶、以及洗刷用品等。
（2）玻璃器皿清洗：烧杯、量筒、玻璃棒、广口瓶（瓶盖不泡盐酸，清洗赶紧后直接高压灭菌）等玻璃器皿自来水刷洗，除去灰尘，烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净，然后用蒸馏水冲洗干净后用烤箱烘干，高压灭菌，烘干备用。
（3）塑料器皿的清洗：细胞培养皿、培养板、培养瓶可以直接使用，进口枪头、进口离心管高压灭菌。
（4）金属制品的清洗：止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀等先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。
放入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用。
（5）棉织品：纱布和脱脂棉，高压灭菌，再烘干备用。
二、溶液配制（1）PBS：用电子天平准确称取NaCl /8.0 g，KCl /0.2 g，KH2P04/0.29 g，Na2HP04-12H20/ 1.42 g溶于800 mL的超纯水中，用玻璃棒搅拌至溶解后调节pH值为7.2～7.4，然后定容至1L。
置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4℃冰箱冷藏备用。
等渗0.01MPBS（1X PBS）细胞培养用，用电子天平准NaCl/8.00g浓度为8/58.5=0.13675M，本配方主要靠NaCl，KCl/0.20g浓度为0.2/74.5=0.00268M，Na2HPO4·12H2O/2.90g浓度为 2.90/358= 0.0081M Na2HPO4·2H2O/1.44g浓度为 2.90/358=0.0081M，KH2PO4/0.24g浓度为0.25/136= 0.0019M，溶于800 mL的dddH2O，用玻璃棒搅拌至溶解，dddH2O定容至1000ml。
细胞工程实验总结
实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
①材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。
②仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。
理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。
2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4℃保存。
（准备试剂瓶）灭菌方法：高压灭菌。
2）干粉培养基过滤除菌（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）认真阅读说明书。
说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。
这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。
配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。
2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基。
3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。
4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。
5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。
注意不要过分搅拌。
6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。
143b细胞培养方法
143b细胞培养方法143B细胞是一种常用的人源肿瘤细胞株，常用于细胞生物学和癌症研究。
以下是一种常用的143B细胞培养方法：1. 培养基的准备- 将DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基加热到37°C。
- 向DMEM中添加10%胎牛血清（FBS）。
- 加入1%抗生素（如青霉素/链霉素）以防止细菌感染。
- 搅拌混合并通过0.2微米滤膜过滤以去除细菌。
2. 细胞的准备- 从冻存细胞库中取出143B细胞株，并迅速将细胞解冻。
- 将细胞转移至15毫升离心管中，并用DMEM培养基轻轻混合。
- 离心管在37°C下离心，速度为200×g，离心时间为5分钟。
- 倒掉上清液，用DMEM培养基重新悬浮细胞。
- 计数细胞数目（使用显微镜和血液计数板）并根据需要调整细胞浓度。
3. 细胞的培养- 在细胞培养皿中孵育143B细胞。
- 将细胞悬浮在DMEM培养基中，添加到培养皿中。
- 放置培养皿在37°C的细胞培养箱中，含有5% CO2。
- 每2-3天更换培养基，以提供足够的营养物质和生长因子。
- 细胞达到80-90%的密度时，可以进行下一步的实验或传代。
4. 细胞传代- 当细胞达到80-90%的密度时，用PBS洗涤细胞，以去除培养基中的残留杂质。
- 使用胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻处理细胞，以剥离细胞层。
- 加入足够的新鲜DMEM培养基以停止胰蛋白酶的作用。
- 将细胞悬浮在新的培养皿或板中，并进行适当的稀释，以达到所需的细胞密度。
这是一种基本的143B细胞培养方法，实验室可能会根据具体实验要求进行微调和优化。
在进行细胞培养时，注意保持无菌条件，定期观察细胞形态和生长状态，并遵循实验室的操作规范和安全指南。
悬浮细胞培养步骤
悬浮细胞培养步骤1.概述2.准备培养物料准备所需的培养物料，包括细胞培养基、生长因子、抗生素、试剂等。
3.细胞的分离将已经培养到对数生长期的细胞通过离心等手段分离出来。
将离心得到的胞液中的细胞沉淀，投放到新的培养基中。
4.细胞的计数与调整使用显微镜和细胞计数板，计算细胞密度。
根据实验需要，调整细胞密度，以确保培养物中含有适当数量的细胞。
5.建立悬浮培养体系将调整后的细胞投放到预先消毒的试管、培养瓶或培养皿中。
根据细胞类型和实验需求，选择合适的培养基，并添加所需的生长因子、抗生素等。
确保培养器具和培养基无菌。
6.细胞培养条件的调整调整培养器中的温度、正常气体流量和湿度等参数，以提供细胞正常的生长环境。
通常，悬浮细胞培养中使用37℃的恒温培养箱来维持细胞的正常生长。
7.培养液的补充定期检查培养物的状态，并根据需要添加新鲜的培养液。
培养液的补充应根据细胞增殖速度和细胞密度进行调整。
8.细胞的观察与维护使用显微镜定期观察细胞的形态、细胞密度、细胞内包涵物的存在和其他特征。
根据观察结果，及时进行维护操作，如，在细胞寿命结束后进行细胞分给等。
9.细胞的分离与收获当细胞达到所需的数量或实验结束时，使用离心等方法分离细胞。
根据实验要求，可以通过离心沉淀细胞以获得细胞输植物料，或通过胶体沉淀等方法收集细胞上清液进行后续实验。
10.培养器具和废弃物的处理培养器具应进行彻底的清洗和消毒。
废弃物应根据相关规定进行处置。
总结：悬浮细胞培养是一种重要的细胞培养方法，通过合适的培养条件、定期观察和维护，可以获取到大量的细胞，并用于进一步的实验。
悬浮细胞培养的基本步骤包括细胞的分离、计数与调整、悬浮培养体系的建立、环境条件的调整、培养液的补充、细胞的观察与维护、细胞的分离与收获等。
熟悉这些步骤，并正确操作，能够保证悬浮细胞的正常生长和充分利用。
细胞培养的准备工作
细胞培养的准备工作细胞培养是生物医学研究中常见的实验技术，它是通过在培养基中提供适当的营养物质和环境条件，使体外培养的细胞可以持续生长和繁殖。
为了保证细胞培养实验的成功进行，准备工作是至关重要的。
在这篇文章中，我们将详细介绍细胞培养的准备工作，包括实验室设备准备、培养基配制以及无菌操作等关键步骤。
希望本文能够对你有所帮助。
一、实验室设备准备在进行细胞培养实验之前，首先需要准备实验室必备的设备，包括无菌工作台、培养箱、显微镜、培养皿、移液器、离心机等。
这些设备能够提供无菌、恒温、湿度适宜的环境，为细胞的生长提供良好的条件。
1. 无菌工作台：无菌工作台是进行细胞培养实验的重要设备之一，它能够为实验人员提供洁净的操作环境，防止外源微生物对培养细胞的污染。
2. 培养箱：培养箱提供了恒温和适宜的CO2浓度环境，使细胞在体外也能够保持正常的生长状态。
3. 显微镜：显微镜用于观察培养的细胞形态和数量，帮助实验人员了解细胞培养的情况。
4. 移液器：移液器用于在无菌条件下向培养皿中加入培养基、溶液和细胞悬液，是进行细胞培养实验中必备的工具。
5. 离心机：离心机用于离心培养皿中的细胞悬液，帮助实验人员收集和分离细胞。
以上设备的准备是细胞培养实验进行的基础，它们能够帮助实验人员进行规范的细胞培养操作，保证实验结果的准确性和可靠性。
二、培养基配制培养基是支持细胞生长和增殖所必需的营养物质和生长因子的混合物，其配制的质量和无菌性直接影响着细胞培养实验的成败。
通常来说，培养基包括基本培养基和添加剂两部分。
1. 基本培养基：基本培养基是细胞培养实验中不可或缺的组成部分，它提供了细胞生长所需的营养物质和生长因子，如含有丰富氧气和CO2的DMEM培养基、含有丰富营养物质的RPMI-1640培养基等。
在配制基本培养基时，需要严格按照配方比例将粉末溶解于无菌水中，再经过滤灭菌或高压灭菌处理，最终得到无菌的培养基液体。
2. 添加剂：培养基中常加入的添加剂包括胎牛血清、青霉素/链霉素、L-谷氨酸、非必需氨基酸等，这些添加剂可以增进细胞的生长和增殖，提高细胞培养的成功率。