人脐带间充质干细胞3种分离制备方法的比较

4 参考文献
［1］侯克东，卢世壁，张莉，等． 人脐带 Wharton 胶中间充质干细胞的 分离、培养与鉴定［J］． 解放军医学杂志，2008，4（ 33） ： 375-378．
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（ 收稿日期： 2009-11-17，修回日期： 2010-06-03） （ 本文编辑： 陈维忠）
摘要： 目的 比较组织块贴壁培养法、脐带匀浆胶原酶消化法与改良胶原酶消化法制备脐带间充质干细胞（ CMSCs） ，探讨一
种简便、快速、高质量的 CMSCs 制备方法。方法 无菌条件下留取健康孕妇剖宫产的新生儿脐带，采用上述三种方法获取
CMSCs，经传代培养、倒置显微镜形态观察、细胞增殖能力观察及流式细胞仪检测 CMSCs 免疫表型。结果 三种方法均制备
统计学意义（ P ＞ 0． 05） 。 2． 3 体外诱导分化结果 成骨分化： 第 2 代脐带源 贴壁细胞成骨定向诱导 14 d，对照组细胞 von Kossa 染色未见黑色矿化物沉积，而诱导组则见细胞间布 满黑色颗粒，大小不均一，提示有矿化基质沉积。脂 肪分化： 第 2 代脐带源贴壁细胞脂肪定向诱导 14 d 后，对照组细胞油红 O 染色阴性，诱导组细胞可见 油红 O 染色呈强阳性，倒置显微镜下可见细胞浆中 含有脂肪空泡。
作者简介： 尹富华，1954 年生，女，副主任技师，主要从事骨髓干细胞、脐带 MSC、CIK-DC 细胞的实验室研究。 通讯作者： 杨晓凤，女，主任医师，硕士研究生导师，E-mail： yxf463@ 126． com。
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临床检验杂志 2010 年 11 月第 28 卷第 6 期 Chin J Clin Lab Sci，Nov． 2010，Vol． 28，No． 6
1 材料与方法
1． 1 主要试剂、仪器 UItraCULTURE 无血清培养 液（ Lonza 公司，USA） ，Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶（ Gibco BRL 公司） ，CO2 培养箱（ 日本三洋公司） ，倒置显微 镜（ Leica 公司，German） ，立式恒温振荡培养箱（ 哈 尔滨 东 联 公 司 ） ，流 式 细 胞 仪 （ BD FACSCalibur FACS101） ，流式细胞术抗体（ Pharmingen 公司） 。 1． 2 脐带的前期准备 经我院伦理委员会批准，脐 带取自足月剖宫产健康孕妇，并且孕妇 HBV 抗原、 抗 HCV 抗 体、抗 HIV 抗 体、抗 梅 毒 螺 旋 体 抗 体、 ALT、支原体、抗巨细胞病毒抗体等检测均阴性。无 菌条件下采集脐带后送往实验室，如不能立即制备 应将脐带置保存液内于 4 ℃ 冰箱存放，且不得超过 6 h。 1． 3 CMSCs 的制备方法 （ 1） 组织块贴壁培养法 见参考文献［1］。（ 2） 脐带匀浆胶原酶消化法见参
关键词： 脐带； 间充质干细胞； 细胞培养； 制备方法
中图分类号： R394． 26
文献标识码： A
间充质干细胞（ mesenchymal stem cells，MSCs） 是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干 细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、羊膜液、胎盘、脐带血 及脐带组织中。脐带间充质干细胞 （ CMSCs） 是存 在于脐带华尔通胶（ Wharton' s jelly） 和血管周围组 织中的一种干细胞，来源广泛，便于取材，在体外易 于分离扩增。我们应用组织块贴壁培养法、脐带匀 浆胶原酶消化法与改良胶原酶消化法 3 种方法制备 人 CMSCs 并进行比较，旨在探讨一种简便快速高质 量的 CMSCs 制备方法。
出 CMSCs，但改良胶原酶消化法贴壁迅速，短时间内即可获得大量的 CMSCs。细胞免疫表型： 高表达 CD90、CD105、CD73、
CD29、CD44； 极低表达 CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR。结论 改良胶原酶消化法可以快速分离脐带华尔通胶（ Wharton' s
jelly） 中 CMSCs，且细胞迅速贴壁生长 3 ～ 5 d 即可传代，是一种简便快速易行的 CMSCs 制备方法。
2 结果
2． 1 CMSCs 的培养及形态学观察 2． 1． 1 组织块贴壁培养法 原代培养 7 ～ 15 d，组 织块间隙可见散在分布的长条梭状细胞。经去组织 块换液后，倒置显微镜下可见几个或几十个贴壁生 长的 细 胞，呈 长 梭 形 或 扁 平 状，细 胞 形 态 与 骨 髓 MSC 相似。继续培养 10 ～ 15 d，可达到 80% 融合， 从组织块接种到 80% 融合，约需 4 ～ 5 周。 2． 1． 2 脐带匀浆胶原酶消化法 原代培养 3 d 左 右时，贴壁细胞形成集落，多数为长梭形或扁平形的 成纤维样细胞，少数为多突起的星形细胞，细胞有折 光性，核仁明显； 细胞增殖能力旺盛，经 7 ～ 10 d 即可 达到 80% ～ 90% 融合。 2． 1． 3 改良胶原酶消化法 原代培养 1 ～ 2 d，倒置显 微镜下即可看到贴壁细胞呈散在分布，为长梭状或扁 平形细胞，少数为多突起的星形细胞，细胞有折光性， 核仁明显； 3 ～ 5 d 即可达到 80% ～ 90% 融合。用 2． 5 g / L 胰蛋白酶消化、传代，多数呈旋涡状生长。从原代 种植到 80% ～ 90% 融合需 3 ～ 5 d。 2． 2 免疫表型检测 流式细胞术检测结果表明，MSCs 相关的细胞表面标志呈高表达； 而造血干细胞相关的 细胞 表 面 标 志 极 低 表 达。高 表 达 的 表 面 标 志 为 CD105 （ 99． 7% ） ，CD90 （ 99． 5% ） ，CD73 （ 99． 9% ） ， CD29（ 99． 8% ） ，CD44（ 94． 2% ） ； 极低表达的表面标 志为 CD34（ 0． 4% ） ，CD45 （ 0． 6% ） ，CD19 （ 0． 5% ） ， CD14（ 0． 6% ） ，CD19 （ 0． 5% ） ，HLA-DR（ 0． 6% ） 。3 种试验方法培养的 MSCs 表面标志检测结果未见明 显差别。 2． 3 细胞增殖能力 选择原代培养及第 2、4、6 代 的生长曲线进行观察。传代后静止期约 24 h，至 16 代细胞仍保持相似的细胞倍增时间。2 ～ 3 d 进入 对数生长期，持续 3 ～ 4 d 后逐渐进入平台期，7 ～ 8 d 后生长缓慢。原代、2、4、6 代间细胞数间的差异无
次。第 14 d 用油红 O 染色，于倒置显微镜下观察脂 肪滴的形成。向成骨细胞诱导分化： 细胞以每孔 2 × 104 接种于 T-25 cm2 塑料培养瓶和 6 孔板，诱导 分化体系为含 1． 0 × 10 － 8 mol / L 地 塞 米 松、2． 0 × 10 － 4 mol / L 抗坏血酸、7． 0 × 10 － 3 mol / L β-磷酸甘油 的 IMDM 培养基，每 3 d 半量换液 1 次。第 14 d 用 von Kossa 染色检测钙化基质沉淀。
3 讨论
脐带属于胎儿分娩后的废弃物，组织来源广泛， 无伦理学限制［3］，其中的 MSCs 较原始且分化能力 强，也降低了移植后受体的排斥反应。脐带经制备 处理后可获得大量的 MSCs，其具有与骨髓 MSCs 极 为相似的细胞形态和免疫特性。近来资料显示，从 脐带不同组织（ 包括脐带静脉内皮和内皮下层，华 尔通胶及血管及其周围组织） 中可分离得到 MSCs。 有研究者［4］ 曾 采 用 内 皮 消 化 的 方 法 从 脐 带 中 分 离 MSCs，70% 标本不能得到可多次传代的 MSCs，原因 可能是内皮消化法只能得到脐带内皮和内皮下的 MSCs，细胞数量较少。本组实验对脐带制备方法进 行了改进： 将华尔通胶剪碎直接贴壁； 将脐带全部组 织匀浆处理后进行胶原酶消化改为将剪碎的华尔通 胶置于Ⅳ型胶原酶中振荡消化，取消胰蛋白酶消化 步骤，过 滤 后 将 收 集 的 MSCs 单 个 细 胞 直 接 加 入 UItraCULTURE 无血清培养液中培养。改良胶原酶 消化改进了获取 MSCs 的方式，是一种增殖能力强、 简便易行、可快速获得大量 CMSCs 的制备方法。
考文献［2］。（ 3） 改良胶原酶消化法： 去羊膜，取华 尔通胶，剪碎成 0． 5 ～ 1． 5 mm3 的组织块，加入Ⅳ型 胶原酶（ 1． 0 g / L） ，置 37 ℃ 恒温振荡培养箱振荡消 化 3 h 后，用 80 目滤网过滤，将滤过的细胞悬液离 心洗涤。用 UItraCULTURE 无 血 清 培 养 液 混 匀 细 胞，以 1． 0 × 105 / cm2 接种于 T-75 cm2 培养瓶中，置 37 ℃ 、饱和湿度、5% CO2 培养箱中培养。3 种方法 制备的细胞贴壁后，每隔 3 ～ 4 d 换液。融合至 80% ～ 90% 传代培养，加入 2． 5 g / L 胰酶（ 含 EDTA） 消 化，按 1∶ 2 或 1∶ 3 传代至 T 175 cm2 培养瓶中。 1． 4 细胞表面分子标志检测 收集 107 个培养 3 ～ 4 d 的第 3、4 代成纤维样细胞制成细胞悬液，分别加 入 抗 人 CD34-PE、CD45-FITC、CD105-PE、CD90FITC、CD73-PE、CD29-PE、CD44-FITC、CD14-PE、 CD19-FITC、HLA-Drpercp-A 等各 5 μl，鼠 IgG1 为阴 性对照。4 ℃ 反应 30 min，流式细胞仪检测。 1． 5 细胞增殖能力的检测 分别取原代、2、4、6 代 成纤维样细胞，加入 UItraCULTURE 无血清培养液 制成细胞悬液，以 1 × 105 / ml 的密度接种于 6 孔板 内。第 3 d 起，每隔 1 d 消化并细胞计数，根据细胞 数量绘制曲线。 1． 6 体外诱导分化 以不加诱导剂的培养液培养 的细胞为阴性对照。向脂肪细胞诱导分化： 细胞以 每孔 2 × 104 接种 T-25 cm2 塑料培养瓶和 6 孔板，诱 导分化体系为含 10% FCS、10 － 6 mol / L 地塞米松、 100 μg / ml 1-甲 基-3-异 丁 基-黄 嘌 呤 （ IBMX ） 、50 μg / ml抗坏血酸的IMDM培养基。每 3 d 半量换液 1