第二章 PCR的原理与应用

第二章PCR技术的原理及应用故事发生在1983年的春夏之交很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus 公司工作期间，发明了PCR。

他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。

1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...Mullis 开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA 的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA 聚合酶，面对面地合成着DNA ，……Mullis的第一个PCR实验•1983年9月中旬。

Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。

结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。

于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。

1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。

第一种高温菌DNA聚合酶的分离美国黄石国家公园Thermus aquaticus•Taq•Not permanently destroyed at 94ºC •Optimaltemperature is 72ºC耐高温DNA聚合酶的种类•Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticus，Cetus/Roche)•Tth DNA聚合酶(Thermus thermophilus，Toyobo)•Pfu DNA聚合酶（Pyrococcus furiosus，Stratagene）Deep Vent DNA聚合酶(Bio-labs）•Tfl DNA聚合酶（Thermus flavus，Promega)•Tli DNA聚合酶(Thermococcus litoralis，Promega) Vent DNA聚合酶(Bio-labs）•Pwo DNA聚合酶( Pyrococcus woesei，Roche)•Pfx DNA聚合酶(Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen)•Dyna zyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme）•FD DNA聚合酶(Thermus sterophilus？，复旦大学)•Tma, Tne, KOD, ……PCR仪器的变迁•三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）•电加热块＋自来水冷却（PE，1988）•电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）•三个加热块＋机械手（Stratagene，1994）•半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendrof）•温度梯度, 荧光检测(如Roche的Lightcycler)•风加热•Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况•1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）•现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等）PCR的发展史•1983年春，Mullis发展出PCR的概念；•1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；•1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断；•1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；•1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。

•1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；•1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的；•1988年，第一台PCR仪问世；•1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。

PCR不只是一个方法改进•Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；•到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；•Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。

PCR相关的术语和产品层出不穷•T-vector •HotStart Taq •RT-PCR •RAPD-PCR •DDRT-PCR •LM-PCR •Inverse PCR •Nested PCR •Real-time PCR •RACE•Flow chip PCR •TAS•Multiplex PCR •Immuno PCR •Asymmetric PCR •LP-PCR•NASBA •Recombinant PCR •AFLP•SSCP•In situ PCR •TaqMan/SYBR green1st cycle2nd cycle3rd cycle过程变性引物退火DNA 复制（一）PCR的基本原理（二）PCR的种类1.普通PCRPCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4 小时PCR 具有极高的灵敏度污染是PCR实验的常见问题。

只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。

样品正对照负对照标准分子量因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。

用紫外灯破坏污染物也是一个办法（二）PCR的种类2.RT-PCR：反转录PCR(reverse transcriptase-PCR)•原理：RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

•特点：作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。

无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物(GSP)中的一种。

对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

•应用：RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，分析基因的转录水平，细胞中RNA病毒的含量，直接克隆特定基因的cDNA序列。

两步法RT-PCR示意图一步法RT-PCR示意图一步法和两步法RT-PCR的比较两步法RT-PCR一步法RT-PCR起始第一链cDNA合成使用：起始第一链合成使用Oligo(dT)，随机六聚体，GSP引物GSP引物优点优点•灵活•方便引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性•困难RT-PCR的优化能力•高灵敏度•适用于在单个样品中检测几个mRNA•适用于大量样品分析Eco RI寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6mRNA(A)n (T)12-18(A)n(A)n (T)12-18R 6R 6R 6R 6R 6R 6第二链合成(A)n (T)12-18(A)nR 6R 6R 6R 6R 6R 6(A)n (T)12-18Eco RI加上EcoRI 接头，磷酸化，cDNA 分级cDNA 合成完毕，准备连接第一链合成cDNA 合成过程示意图cDNA序列的克隆（二）PCR的种类2.Nested PCR：巢式PCR•原理：利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。

在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。

•优点：由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR （如5'RACE）的特异性。

•应用：一般应用于动物方面。

如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。

First PCRSecond PCR Nested PCR原理示意图（二）PCR的种类3.Inverse PCR：反向PCR•原理：用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。

PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。

这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。

•优点：可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。

•应用：一般应用于未知序列的扩增，有时也用于定点突变。

Inverse PCR原理示意图（二）PCR的种类4.PCR-RFLP:多聚酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(restriction fragment length Polymorphism，RFLP)•原理：PCR产物－限制性内切酶切－多态性分析，DNA发生重排后，酶切位点发生改变。

•优点：具有分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观等。

主要用于核酸变异性分析与比较, 微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断等。

•局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变的情况下，一次只能完成一个特定位点突变筛选，检测效率低。

PCR-RFLP原理示意图（一）PCR的种类5.PCR-SSCP：聚合酶链反应一单链构象多态性(single strand conformation polymorphism)•原理：是将经扩增的DNA片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。

•特点：刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。

后用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。

1993年起用EB染色法显示DNA带型。

优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、不需特殊设备，适用于大样本筛选。

己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。

PCR-SSCP示意图从定性到定量的革命普通PCR定量分析的困惑聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。

在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。

无论定性还是定量分析，分析的都是PCR 终产物。

但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR 信号放大之前的起始模板量。