过氧化物酶的检测方法
过氧化物酶活性测定
过氧化物酶（POD）活性测定一、原理：过氧化物酶含铁，广泛存在于植物组织中，可催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。
本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，当有H2O2 存在时，过氧化物酶可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其在470nm处有最大吸收峰，故可用分光光度计在470nm处测定其吸光值，即可求出该酶的活性。
二、实验准备：仪器：分光光度计、离心机、秒表、研钵、磁力搅拌器、移液管、电子天平、冰箱、100ml 容量瓶、试管、胶头滴管、试管架、烧杯、吸水纸、比色皿、剪子试剂：0.05 mol/L愈创木酚；2%H2O2； pH 6.0的磷酸缓冲液；75%酒精；蒸馏水试剂配制:○1pH 6.0的磷酸缓冲液:0.2mol/l NaH2PO4 (27.6g NaH2PO4•H2O 用蒸馏水配成1000ml）取87.7ml和0.2mol/l Na2HPO4 （71.7g Na2HPO4•12H2O 或53.65g Na2HPO4•7H2O 用蒸馏水配成1000ml）取12.3ml后混合，用蒸馏水稀释至200ml即可。
○22%H2O2：取6.7ml 30%H2O2于烧杯中，再加入93.3mL蒸馏水（或加蒸馏水稀释至100mL），搅拌均匀。
○30.05 mol/L愈创木酚：准确称取6.2g愈创木酚，再用95%的乙醇配制定容至100ml即可。
三、步骤：○1粗酶液的提取：称取一定质量的植物材料放入研钵中，加入提取液1 mL(pH 6.0的磷酸缓冲液)，研磨，再加入9 mL提取液，将匀浆全部转入离心管中，于4 000 r/min 4 ℃离心10 min，上清液即为酶的粗提取液，收集上清液于冷处（冰箱4℃保存）。
○2酶活性的测定：将4 mL反应混合液( pH 6.0的磷酸缓冲液2 mL,酶液1 mL,0.05 mol/L 愈创木酚1 mL)和1 mL 2% H202加入试管中立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于470 nm波长下用U 2800型紫外可见分光光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每15 s记录1次，记录2 min ，另外以缓冲液代替酶液作为较零对照组。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL 。
过氧化物酶活性测定
过氧化物酶活性测定
过氧化物酶（peroxidase）是一类广泛存在于各种生物中的酶。
它们能够催化过氧化物与底物之间的氧化还原反应。
此类酶有多种生物功能，其中最重要的是用于废弃物的代谢和细胞保护。
在工业和农业领域中，过氧化物酶也常被用作催化剂。
因此，对于过氧化物酶的活性测定十分重要。
传统的过氧化物酶活性测定方法主要包括光谱分析法、吸光度法、滴定法、电化学法等。
今天我们主要介绍光谱分析法的原理和步骤。
过氧化物酶在酸性pH下的催化活性主要是由其含有的含铁金属离子（Fe3+）决定的。
Fe3+构成的氧桥结构能够与底物发生氧化还原反应，同时产生吸收峰。
因此，利用曲线拟合的方法可以测定样品中过氧化物酶的活性。
具体操作步骤如下：
1. 处理样品。
将待测样品加入一定比例的磷酸盐缓冲液（pH 5.0）。
若含有颜色物质需添加过滤效果的吸附剂。
2. 加入反应液。
向样品中加入过氧化氢，使其浓度为0.1%。
3. 反应后读取吸收度。
反应结束后，利用紫外-可见光谱仪读取其吸收值。
4. 分析数据。
根据吸收峰的强度和波长，利用标准曲线计算出过氧化物酶的活性。
总之，过氧化物酶活性的测定对于研究生物学和工业化学等领域都具有重要的意义。
随着科学技术的不断发展，相信在未来，这一领域的研究也将不断深入，为我们带来更多的新发现和应用。
过氧化物酶含量的测定(比色法)
过氧化物酶含量的测定（比色法）过氧化物酶含量测定是一种常用的生物学和化学学科中的实验方法。
该方法被广泛应用于生物体内氧化应激、氧化物解毒和氧化物代谢等方面的研究。
该方法利用底物的氧化还原反应，通过检测产生的表观色素的变化来测定过氧化物酶的酶活性。
实验原理：过氧化物酶是一种催化酯类和醇类底物的氧化还原反应酶，其底物是一种含有双键的多不饱和酯类及多酚类物质。
这些底物的氧化作用需要过氧化物酶及辅助成分，通过产生艳蓝色淀粉和牛肉素的氧化还原反应来表现出来。
常见的底物是喹啉及其衍生物类化合物。
这些化合物在钠盐和钾盐的存在下，可以和以均等量的0.02%-0.05%的过氧化氢溶液配合使用，产生表观色素（θ=100nm），其中颜色的强度与底物氧化的程度成正比。
过氧化物酶的酶活性是测定过程中的关键要素，一定的酶浓度可以帮助底物迅速氧化。
实验步骤：1.提取组织过氧化物酶，制备1%避光标准物质。
2.在底部添加适量的底物，并加入0.02%-0.05%的过氧化氢溶液（90min内完成剩余测定）。
第一个反应必须使反应均匀发生，并加入适量的怡宝那和氢氧化钾调节酸度和盐度，然后按照程序进行反应。
最大吸收波长：613nm；试管增量：每5秒；试管量：1ml。
3.利用磁性制动器将试管定在这个位置并将它们降到盘子中心，当酶浓度很低时可以通过上下弯曲试管使溶液更加均匀。
4.测量反应后溶液的吸光度，并确定吸收峰的位置。
根据标准曲线计算出样品中过氧化物酶的浓度，如图所示。
实验注意事项：1.所有的耗材都必须干燥，并且必须在实验过程中保持干燥状态。
2.测定前，必须使用透明质酸纯化介质和亚硫酸钠而不是硫酸钠进行预防性清洁。
3.在进行试管反应时，必须将试管置于盘子的中心位置。
如果实验中涉及液体转移，请务必谨慎操作。
4.严格按照各步骤操作，以保证实验结果的准确性。
总结：通过比色法测定过氧化物酶的酶活性是一种可靠、快速、简便的方法。
该方法的步骤简单，有助于对生物体内的氧化应激、氧化物解毒和氧化物代谢等方面的研究。
材料类过氧化物酶检测步骤
材料类过氧化物酶检测步骤1.将透析膜依次浸泡于50%乙醇1小时,10mmol/L NaHCO31小时, 1 mmol/LEDTA1小时,在蒸馏水中洗两次并放于含0.01%(m/V)叠氮钠的0.1mol/L磷酸钠缓冲液于4℃保存。
2.取≥1mg/ml抗体溶液(A280=1.44mg lgG/ml)对2L0.1mol/L pH6.8的磷酸钠缓冲液透析，于4C缓慢搅动下过夜。
3. 10mgHRP 溶解于1ml 0.1mol/L pH9.2的碳酸盐缓冲液，取0.25ml 加入0.25ml新配制的1.71 mg/ml NalO4溶液中，盖紧混匀，于室温下避光放置2h。
4.取1ml透析后的抗体溶液和0.25g SephadexG-25加至0.5mlHRP/NalO4混合腑中。
用玻璃棉塞紧巴斯德吸管管尖并用Parafilm 封口膜封好。
将抗体/葡聚糖凝胶/HRP混合物加人巴斯德吸管，室温下避光放置3h。
5.柱子用0.75ml碳酸盐缓冲液洗脱偶联物。
加38ul 5mg/ml NaBH4溶液至洗脱物中，室温下避光孵育30min。
再加112ul 5mg/ml NaBH4溶液继续孵育60min。
6.加0.9ml饱和硫酸铵溶液，于4℃下温和搅拌30min。
于4℃,10000g离心15min。
7.弃上清。
沉淀重溶于0.75 ml TEN缓冲液中，装人透析袋于4C对2LTEN 缓冲液透析过夜。
更换TEN缓冲液再继续透析4h。
8.从透析袋中取出偶联物，加BSA 至20mg/ml。
加等体积甘油，于-20℃保存。
过氧化物酶与抗体标记之后,可以进行抗原抗体的检测,这使得Trinder's 试剂检测、酶联免疫、鲁米诺化学发光分析这些检测方法与抗原抗体的免洗分析相结合起来,使各种检测方法适应性更广。
德晟是血液检测相关试剂的生产厂家，研发并销售有多种酶制剂、色原底物、发光底物。
过氧化物酶活性的测定
实验六：过氧化物酶活性的测定左哥一、实验目的：过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酶类物质代谢，植物抗性密切相关。
通过实验掌握提取POD和测定其活性方法和原理。
二、实验原理：过氧化物酶催化H2O2氧化酶类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其它分子缩合，产生颜色较深产物。
本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，次产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸收光度变化得知过氧化物酶的活性。
三、材料与试剂材料：马铃薯试剂：20m mol/L KH2PO4,反应混合液四、方法步骤：1、酶液制备：称取材料1.079g，加入20m mol/L KH2PO4 5ml,于研钵中研磨成匀浆，在3000r/min，下离心10min,上清液转入25ml,容量瓶，残渣再用5ml, KH2PO4,提取一次，定容，混匀，贮于冷凉处备用。
2、比色测定：光径1cm比色杯两只，1只先加1ml KH2PO4，再加3ml混合液作参比液；另一只加1ml,酶液，3ml混合液，立即计时并置于分光光度计中，在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测8min，每次测定前重新对照校准。
五、实验结果酶活力（0.01 A470/L）=(A2-A1)/0.01(t2-t1)*(V2/V1)=328.2μ酶的比活力（μ/g）=酶活力/样品重=304.2μ/g实验七：种子生活力快速测定一、实验目的：种子生活力即种子发芽潜力，是鉴定种子力量研究种子储藏生理的重要指标，本实验运用TTC，红墨水发快速测定种子生活力。
二、实验原理：1、TTC法：有生活力的种子呼吸作用产生的NADH能还原TTC，生产的红色的TPE，将胚染成红色，无生活力的种子，无呼吸代谢活动，不能还原TTC，肧不着色。
2、红墨水法：植物活细胞的原生质膜有选择透性，某些染料分子不能透过。
如红墨水，因而不能将种肧染色，而死的种肧，其细胞膜结果破坏，选择透性丧失，因而染料分子能透过膜进入细胞将种肧染色。
实验五_过氧化物酶酶活性的测定
实验五_过氧化物酶酶活性的测定一、实验原理1. 过氧化物酶（POD）在植物生长过程中发挥重要作用。
在压力、紫外线辐射、微生物侵入和病原体感染等外界刺激下，植物组织中的过氧化物酶活性会显著增加，以保护植物免遭伤害。
2. 过氧化物酶是一种氧化酶，催化产生氧气的反应（如下）：ROOR′+ 酶———> R′OH + O23. 过氧化物酶活性的测定实验基于上述反应，利用巴尔的显色方法测定过氧化物酶催化下的氧化反应速率。
二、实验步骤1. 将100mL的3% H2O2（v/v）制成浓度为60mmol/L的过氧化氢溶液。
2. 按0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL 5个等份，取出浓度分别为6、12、18、24、30mmol/L的H2O2溶液，放入5个试管中。
4. 将1mL的20mg/mL酶溶液加入中等浓度（12mmol/L）的H2O2溶液中，混合均匀。
缓慢倾斜试管，使溶液彻底混合。
5. 取出一根手指，将其浸泡于硫酸铁铵溶液中。
将试管倾斜，瓶口与硫酸铁铵溶液接触，放入深100°C的水浴中加热2min。
将溶液混合均匀。
6. 将试管移出水浴，冷却到室温后，再加入1mL的硼酸缓冲液，混合均匀。
7. 测定吸收值（深紫色的铁化合物阴离子形成）。
利用光度计在546nm处测量。
8. 按照如上步骤分别测定不同浓度下的H2O2溶液。
三、结果分析1. 计算各试管中产生的氧气量，并绘制曲线（以5mmol/L，10mmol/L，15mmol/L，20mmol/L，25mmol/L的浓度为横坐标）。
2. 计算过氧化物酶活性（OD/min/mg）。
四、实验注意事项1. 检查瓶塞和试管，确保没有损坏。
2. 操作过程中，需严格按照试剂用量来添加试剂。
3. 热水浴器的温度应为100°C。
4. 硫酸铁铵溶液应略微加热一会儿，以充分溶解。
5. 实验过程中避免强光照射。
过氧化物酶活性的测定
过氧化物酶活性的测定一、实验目的掌握酶活性的测定方法和原理。
二、实验原理过氧化物酶是一种含铁卟啉的氧化酶，是利用H2O2将代谢中一些化合物氧化,其活性与呼吸作用、光和作用等一些生理过程有关。
测定过氧化物酶的活性变化是植物生理和病历上一个常用的指标。
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm的吸光度变化测定过氧化物酶活性。
三、材料、设备和试剂新鲜马铃薯块茎容量瓶（25ml）、量筒（25ml）、移液管（1ml）、研钵、试管架UV-9200紫外可见分光光度计、天平、秒表0.2M磷酸缓冲液（pH6.0）：将0.2M NaH2PO4溶液87.7ml与0.2M Na2HPO4溶液12.3ml混合反应混合液四、实验方法4.1制备酶液：4.2活性测定：值为纵坐标，绘制酶促反应曲线，计算酶的相对活性。
过氧化物酶活性=(△OD470*Vt)/(W*Vs*0.01*t)[u/(g·min)]其中：△OD470为反应时间内吸光值的变化；W为样品质量；t为反应时间；Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时酶液体积。
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离种子蛋白质一、实验目的学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠), SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小.当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k,b 均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量，从而根据分子量将混合蛋白质分离开。
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POD检测方法
(Horseradish Peroxidase)
1原理
Purpurogallin的产生可以通过420nm的光吸收进行检测。
2试剂：
A.5.0%焦酚溶液
B.0.5% 过氧化氢（H2O2）溶液
C 酶稀释液：100mM PB 缓冲液, pH6.0
3 操作规程：
3.1仪器参数设定
检测方法：时间扫描
测量波长：420nm 系数/因子：2.5 测量温度：20±0.5℃
3.2 样品准备
若待测样品为固体，可以按10mg 样品/1000ul 超纯水比例溶解。
溶解后于2-8度放置30min。
3.3 检测方法
3.3.1在石英比色皿中加入525ul水，80ul试剂A, 40ul试剂B,80ul 试剂C于20度孵育
2min。
3.3.2加入25 ul 样品后, 温和混匀后开始测定。
3.3.3 测定结束后，每隔20秒计算△OD，取△OD最大值
3.3.4 活性值（U/ml）范围为0.3-0.7U/ml，若超出范围，待测样品需经试剂C稀释后再次
进行检测。
3.3.5测定样品前需检测空白反应值，即其他操作不变，用25ulC代替样品，测定OD blank。
3.3.6计算公式
活性（U/ml）。