过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制

过氧化物酶（POD ）活性测定

【实验原理】

过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]

【方法步骤】

（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。

（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。

表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表

4.结果计算

以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。也可以用每 min

内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。 POD 总活性[u/g(FW)]=

式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。其中 △470=ACK-AE

比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

Vt ——样品液总体积，mL 。

FW t V . V A T

⨯ ⨯ ⨯ ⨯ 1

470 01 0 ∆

V1 ——测定时样品用量，mL 。

W ——样品鲜重，g 。

蛋白质含量单位为mg/g 。

过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法

【原理】

H 2O 2在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A 240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【试剂】

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液：取A 液91.5ml ，B 液8.5ml,充分混合。

0.1mol/L H 2O 2 以30%的过氧化氢稀释(30*1.1g/34.01)mol/100ml=9.7mol/L,取0.52ml 30%的过氧化氢稀释到50ml.

【方法】

1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g 置研钵中，加入2ml 4℃下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，再用缓冲液冲洗研钵数次定容至25ml ，合并冲洗液，混合均匀后置于5℃冰箱中静置10min ，取上部澄清液在4000rpm 下离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。

2.测定：取10ml 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2顺序加入试剂。

表2 紫外吸收法测定H 2O 2样品液配置表

的H 2O 2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

3.结果计算：

以1min 内A 240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u ）。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T

⨯⨯⨯⨯124010∆

式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。其中 △470=ACK-AE

比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

Vt ——样品液总体积，mL。

V1 ——测定时样品用量，mL。

W——样品鲜重，g。

蛋白质含量单位为mg/g。

所需试剂的配制

A液：0.2 mol/L Na2HPO4-12 H2O 71.64g定容至1000ml

B液：0.2 mol/L NaH2PO4-2H2O 31.2g定容至1000ml

1、超氧化物歧化酶SOD活性测定

0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)取A液228.75ml，B液21.25ml定容至1000mL。

130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL

750u mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mL，用前配避光

100u mol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。用前配置，避光保存。20u mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，用前配置，避光

2、过氧化物酶POD活性测定

愈创木酚、30%过氧化氢、

100m mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：分别取贮备液A：0.2 mol/L Na2HPO4 6.15mL溶液与贮备液B ：0.2 mol/L NaH2PO4溶液43.85mL充分混匀定容至100mL。

20m mol/L KH2PO4：称取0.681g KH2PO4定容至250mL.

3、过氧化氢酶CA T活性测定

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液,取A液91.5ml，B液8.5ml,充分混合。

0.1mol/L H2O2以30%的过氧化氢配制：30%的过氧化氢密度为1.1g/立方厘米,分子量为34.01,据理推算:

(30*1.1g/34.01)mol/100ml=9.7mol/L

30% PEG6000 配置方法如下：称取300gPEG ，溶于一定量的水中，最后定容之1000ml ，即为所需的30%PEG的溶液。谢谢大家下载,本文档下载后可根据实际情况进行编辑修改.再次谢谢大家下载.翱翔在知识的海洋吧.