过氧化氢酶的活性测定

过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法（滴定法、比色法）【原理】

过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)

R(Fe+3OH－)2+ H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2

据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5 H2O2+2 KMnO4+4H2SO4-------- 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4

即可求出消耗的H2O2的量。

【仪器和用具】

研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。

【试剂】

10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；

0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；

0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；

0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4•2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。

【方法】

1.酶液提取取小麦叶片

2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入高温灭活酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。

3.用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。

4.结果计算：

酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：

酶活(mg H2O2/gFW•min)=

式中A—对照KMnO4滴定毫升数；

B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；

VT—酶液总量（ml）；

V1—反应所用酶液量（ml）;

W—样品鲜重（g）；

1.7—1ml 0.1mol/L 的KMnO 4相当于1.7mg H 2O 2。

三、过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法

【原理】

H 2O 2在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A 240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与用具】

紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶1个；0.5ml 刻度吸管2支，2ml 刻度吸管1支；10ml 试管3支；恒温水浴；

【试剂】

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L H 2O 2（用0.1mol/L 高锰酸钾标定）。 【方法】

1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g 置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min ，取上部澄清液在4000rpm 下离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

2.测定：取10ml 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表20-2顺序加入试剂。

25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L 的H 2O 2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算：

以1min 内A 240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u ）。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T

⨯⨯⨯⨯124010∆

式中 ∆A 240 = A S 0－()

A A S S 122+

A S 0—加入高温灭活酶液的对照管吸光值； A S 1, A S 2—样品管吸光值； Vt —粗酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定用粗酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；

0.1—A 240每下降0.1为1个酶活单位（u ）；

t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

【注意事项】

凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

三、过氧化氢含量的测定

【原理】

H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。

【仪器和用具】

研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。

【试剂】

100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。

【方法】

1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表20-1加入试剂。

待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。

2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。

3.结果计算：